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クライオ電子顕微鏡、走査型(SEM)のいずれか、または送信(TEM)は、広く高含水率1を有する生物学的試料または他の材料の特徴付けのために使用される。 SEM /集束イオンビーム(FIB)は、試料中の関心対象の特徴を識別し、クライオTEMへの転送のために薄い電子透過性のラメラを抽出するために使用される。
ここでは、 アスペルギルス·ニガー胞子の低温TEMサンプルを調製するために使用されるプロトコルを提示したが、容易に微生物または溶液の任意の数に適合させることができる。私たちは、特注のクライオ乗換駅と修正されたクライオSEMの準備室2を利用する。胞子を液体窒素スラッシュ内プランジ凍結し、関心領域を選択するためにクライオSEMで観察され、培養物から採取する。薄いラメラ次に、FIBを使用して抽出され、TEM格子に付着し、その後、電子透過まで薄く。グリッドは、クライオTEMホルダに、高分解能TEM研究のために転送される。冷却されたナノマニピュレータの先端とクライオ搬送ステーションの導入のおかげで、このプロトコルは、TEM試料の日常的に使用されるFIBの準備の極低温に簡単で最適化したものです。このように、既存の機器、セットアップおよび手順への修正に少量を必要とするという利点を有する。それをI実装するのは簡単。それは原則クライオTEMサンプル調製と同様に、広範囲の用途を有する。一つの制限は、汚染を回避又は最小限にするために重要なステップで標本の取り扱い熟練を必要とすることである。
このプロトコルでは、以前はcryo-FIB/SEM SEM分析によって高精度に同定された試料の特定領域からのTEM試料を作製するために使用される。生体試料の電子顕微鏡(走査または透過)分析は研究および診断のために使用されるルーチン的な技術である。 SEMはかなり早く採用し、解釈が容易であるが、情報は、試料表面から1.5 nmの範囲の解像度が得られる。 TEMは、より高い解像度を有するが、実装がより困難であり、画像解析はあまり簡単であり、大容量情報が取得されるのに対し、サンプル(約500nm未満の厚さ)の透明性を電子を薄くする必要がある。さらなる問題は、それらの機器の真空要件はほとんど水を含有する試料によって許容されないことである。ほとんどの場合、生物学的サンプルを化学的に固定(例えば、水に代えて、ポリマー)又は乾燥させるのいずれかがある。両方の場合において、有意な変化試料の形態および構造が生じやすい。水和した試験片のTEMクライオ調製物は、最小限の化学的変化を誘発し、それは氷のガラス化が1-6が得られる場合は特に、それらの天然の状態にできるだけ近いサンプルを生成する。
FIBは広く、その多くの利点のために7 TEMサンプルを調製するために使用される。少数を示すために:近垂直入射での高エネルギーイオンの使用は、材料関連の差動ミリング速度の影響を最小限に抑える。バルクサンプルから抽出された領域は、サブミクロンの精度で選択することができる;材料の非常に少量を抽出する。最近の技術開発は、極低温2,8-10でTEM試料調製のためにも、FIBを使用可能にした。このようなスライスされたラメラの機械的変形の欠如などのソフトマターのサンプルのために主に使用クライオミクロトーム11,12の伝統的な製造法に比べていくつかの利点がありますが、ナイフマークとハード/ソフトのインターフェイスやコンポーネントとコンポジット試料を調製する可能性がないこと。
注:このプロトコルで指定されたすべてのパラメータは、ここに示されている楽器やモデルに有効です。他のメーカーやモデルが使用されている場合(本文中に*でマーク)これらのパラメータの一部が異なる場合があります。
FIB / SEMの1。スタートアップ
2。サンプル凍結
3。イオンミリング
TEMに4。クライオトランスファー
本研究では、の使用なさ:ナノマニピュレータと低温準備室を搭載したデュアルビームFIB / SEMで;クライオ転写ホルダーとTEM;プロトタイプクライオ乗換駅。 anticontaminator(AC)クライオ準備室のブレードおよびナノマニピュレータ(NM)の先端がガタンによって変更された。標準的な凍結準備チャンバに対して、ACブレードは、NM先端より大きなヒートシンクを提供することが大きい。また、ACは、NMチップとの熱交換のための銅編組を接続するためのクランプが取り付けられている。 FIB / SEMの空気圧はNMがあることや、試料室をガス抜きしても、挿入されたままにできるように変更された。なお、この研究で使用されるパラメータは、最良上記機器に適していることに留意すべきである。これらのパラメータは、他のタイプの装置を操作するときに調整する必要もよい。このプロトコルを使用するには、極低温の液体窒素や真空システムを処理するための通常の予防措置をすべき続くこと。
この方法は、ナノ粒子を含有する溶液またはポリマーマトリックスから、線虫の単細胞生物に至るまで、良好な結果が得られ、異なるタイプのサンプル上でテストされている。手順の様々な工程の例は、A.に、図1-12に示されているニガー胞子は、四酸化オスミウム、および過マンガン酸カリウムで染色した。胞子は最初の抽出のための部位を同定するためにSEM( 図1)によって画像化される。この場合、任意の胞子の断面は十分であったが、それは、例えば、細胞膜からの特定の距離で特定のセルをスライスするサブマイクロメートルの精度で抽出用ROIを位置決めすることができる。関心対象の特徴が識別されると、低温のPt堆積の最初の工程は、イオンミリングからのビームによる損傷からサ ンプルを保護するために、( 図2)に実装される。サンプルは、最初のステップOを続行し52°に傾いているfはミリング( 図3):ラメラの両側の2つのトレンチのスパッタリング。次に、試料を倒し、さらにバルクに接続するだけ2小さな橋( 図4)を残すように粉砕される。冷却されたナノマニピュレータは、ラメラと接触する( 図5)とPtの他の低温堆積を一緒に半田付けする( 図6)にされる。小さ な接続ブリッジは離れて粉砕し、次いで、NMは、それが白金( 図8)の最終クライオ沈着に半田付けされるTEMグリッド( 図7)の取付領域の近傍にラメラを移動している。 NMは、その後、イオンビーム( 図10および11)を用いて、透明性を電子ために薄くされるラメラ( 図9)から分離される。ラメラは、最終的に高解像度イメージング、分光法、断層撮影および他の技術を約TEM( 図12)に転送されるN採用する。
図1。Aの胞子のクライオSEM像白金堆積前ニジェール 、。
図2。白金を堆積した後、図1にあるが、硬化前の同じ領域。
【図3】図2の同じ面積のクライオSEM像は、進行中のトレンチミリングして、Ptを蒸着および硬化後に、52度傾い(ステップ3.7を参照)。
図4。ラメ ラ、リフトアウトの準備ができて。
図5。冷たいナノマニピュレータの先端がラメラと接触する。
図6。第2PT低温堆積は、ナノマニピュレータとラメラを一緒にはんだ付けするために使用されます。
図7コールドナノマニピュレータはTEMグリッドの取り付け領域にラメラを転送するために使用される。
図8。クライオ堆積は、TEMグリッドにラメラを取り付けるためにもう一度使用されています。
図9。ラメ ラは、ナノマニピュレータの自由カットし、現在ではストレージや透明性を電子ために間伐いずれかの準備ができている。
図10。間伐の中間工程を、断面が見える少数の胞子で。
最終的な間伐後の試料の図11クライオSEM像;他の胞子のほとんどはラメラがカールし始めていたので、すぐに粉砕しなければならなかった。
図12。ラメ ラの複合クライオTEM写真。アル·スタブの一部が含まれていますラメラ(黒矢印)にある。
このプロトコルは、室温での材料科学で使用される標準的なFIB / TEM試料作製の極低温にかなり単純化したものです。試料表面が不均一である場合カーテニングが発生することがありますがこの方法は、機械的変形とナイフマーク(切片作成の主な欠点)の自由なTEMサンプルを生成します。これは、13滑らかで特徴となるまで硬化さキャッピング層(この研究でPtを使用した)の低温堆積によって減少させることができる。非常に異なる硬さの成分を有する試料は、それらが製造の間に応力下壊す危険性なしに同様に調製することができる。内部応力は依然として薄いラメラ部のサイズが縮小されなければならない場合には、曲げたり、カールさせることができる。他の方法と比較して欠点は、イオンビームと試料中のイオンの注入を可能に曝露する生物学的構造を変化させる可能性がある。これらの欠点は、試料た準備のためにRTで起こる材料科学15でATION。彼らは、イオン(500〜1,000 V)の最低加速電圧での最終研磨工程で間伐を完了することによって低減することができる。この非常に穏やかな研磨工程は、ラメラのダメージ層を除去します。
原因クライオ成長(3.5、3.10および3.13ステップ)の性質上、サンプルの大部分は、それによって、元の表面の表示を妨げる、カバーされます。これは、ステップ3.3で提案されているように、複数のマーキングが使用されない限り、それが困難な、ROIを追跡することができる。
ステップ4.5と4.7の間に薄いラメラリスクは、空気と接触する。これはおそらく重要な特徴を不明瞭にする点まで、試料の表面上の氷の結晶を形成するために、空気中の水分を引き起こすとして避けなければならない。これらのステップは、可能な限り迅速に行われるべきであるが、同時に転送中の誤操作は、試料の損失をもたらす可能性があるit自己。これは、ユーザーが実際の試料上での試行が行われる前に、空のTEMグリッドを使用してこれらのステップを実践することをお勧めします。
材料科学では、FIB装置は、その商業化の10年以内に、TEM試料作製のチーフ方法となっている。それは実質的に任意の試料で使用することができるので、試料の種類に調製技術を調整する必要性を除去する。私たちは強く同じことが、極低温で、ここで詳述した手順のおかげで発生する可能性が信じている。より大きなサンプルへの応用はまだクライオ保持するガラス化状態にして能力の対象となりますが、3,5の凍結などプランジ凍結や高圧のような技術は、この問題に対する最適なソリューションであることを証明することができます。
著者らは、開示することは何もありません。
本研究では、FP7の容量計画(認可番号インフラ2010から262163)の下で欧州共同体研究インフラによって賄われているQNanoプロジェクトhttp://www.qnano-ri.euから支援を受けた。
我々はまた、財政支援のための研究協議会Formasに感謝。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strata DB 235 | FEI | FIB/SEM | |
Omniprobe 100 | Oxford Instruments | nanomanipulator | |
Alto 2500 | Gatan | cryo preparation chamber | |
cryo-holder model 626 | Gatan | cryo transfer TEM holder | |
Tecnai F30 | FEI | TEM |
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