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극저온 전자 현미경은 스캐닝 (SEM) 또는 전송 (TEM) 중 하나는, 널리 높은 수분 함량 1 생체 시료 또는 기타 자료의 특성에 사용됩니다. SEM / 집중 이온 빔 (FIB)는 샘플에 대한 관심의 기능을 식별하고 극저온 TEM에 전송을위한 얇은 전자 투명한 얇은 판을 추출하는 데 사용됩니다.
여기에서 우리는 아스 페르 길 루스 니제르 포자 크라이 TEM 시료를 준비하는 데 사용되는 프로토콜을 제시하지만, 쉽게 미생물 또는 솔루션의 수에 대한 적응 될 수있다. 우리는 사용자 정의 내장 크라이 전송 역 및 수정 크라이 SEM 준비 챔버 (2)를 사용합니다. 포자는 액체 질소의 비자금에 뛰어 들다 - 냉동 및 관심 영역을 선택 크라이 SEM에서 관찰, 문화에서 가져옵니다. 얇은 라멜라는 다음 TEM 그리드에 연결된 이후에 투명성을 전자 얇아, FIB를 사용하여 추출한다. 그리드는 크라이 TEM 홀더 및 고해상도 TEM 연구에 전사된다. 냉각 nanomanipulator 팁과 크라이 환승역 도입 덕분에,이 프로토콜은 TEM 샘플의 일상적 사용 FIB 준비의 극저온까지 간단 적응이다. 이와 같이 기존의 기기는, 셋업 및 절차에 대한 변형의 양이 적은 이점이있다; 그것의 I구현하기가 쉽다; 그것은 원칙 크라이 TEM 샘플 준비와 동일한에서 응용 프로그램의 넓은 범위를 가지고 있습니다. 하나의 한계는 오염을 방지하거나 최소화하기 위해 중요한 단계에서 표본의 숙련 된 처리가 필요한 것입니다.
이 프로토콜에서 cryo-FIB/SEM 기계 SEM 분석에 의해 높은 정밀도로 식별 된 샘플의 특정 영역에서 TEM 샘플을 생성하기 위해 사용된다. 생물학적 시료의 전자 현미경 (스캔 또는 전송) 분석 연구 및 진단에 사용되는 일상적인 기술이다. SEM 오히려 빠르고 고용하고 해석하기 쉽지만, 정보는 샘플 표면에서 및 1.5 nm의 범위의 해상도를 얻을 수있다. TEM은 더 높은 해상도를 가지고 있지만, 구현하기가 더욱 어렵고, 이미지 분석은 이하 간단하며 대량 정보가 획득되는 반면, 샘플 (약 500 nm 두께 이하의) 투명도 전자 얇아 져야한다. 또 다른 문제는 그 악기의 진공 요구 사항이 거의 수분을 함유 한 시료에 의해 허용되지 않는 것입니다. 대부분의 경우, 생물학적 시료는 화학적으로 (중합체, 예를 들어, 물을 대체) 고정 또는 건조 할 수도있다. 에 두 경우 모두, 큰 변화시편의 형태와 구조는 발생하기 쉽다. 수화 표본의 극저온 TEM 준비는 최소한의 화학적 변화를 유도하고 얼음의 유리화가 1-6을 얻을 수있다 특히, 자신의 고유 상태로 가능한 한 샘플을 가까이 생산하고 있습니다.
FIB는 널리 많은 장점 7 TEM 샘플을 준비하는 데 사용됩니다. 몇 가지 이름을하려면 거의 수직 입사에 고 에너지 이온의 자료를 사용하는 관련 차동 밀링 환율의 영향을 최소화; 대부분의 샘플에서 추출 된 영역은 서브 마이크론의 정밀도로 선택 될 수있다; 물질의 미량이 추출된다. 일부 최근의 기술 개발은 극저온 2,8-10에서 TEM 샘플 준비를 위해 또한 FIB를 사용 가능하게했다. 이러한 슬라이스 라멜라의 기계적 변형의 부족과 같은 부드러운 물질 샘플에 주로 사용 크라이 microtomy 11,12의 전통적인 제조 방법에 비해 여러 가지 이점이있다하드 / 소프트 인터페이스 또는 구성 요소와 복합 샘플을 준비하는 칼 마크와 가능성의 부재.
참고 :이 프로토콜에 주어진 모든 매개 변수가 여기에 표시되는 악기와 모델에 대한 유효합니다. 다른 제조업체 나 모델을 사용하는 경우 (텍스트에서 *로 표시) 이러한 매개 변수 중 일부는 다를 수 있습니다.
FIB / SEM의 1. 시동
2. 샘플 냉동
3. 이온 밀링
TEM 4. 알아내는 전송
이 작품에서 우리는 사용했다 : nanomanipulator와 크라이 준비 챔버가 장착 된 듀얼 빔 FIB / SEM을; 크라이 전송 홀더 TEM; 프로토 타입을 알아내는 전송 역. anticontaminator (AC)는 크라이 조정실의 블레이드와 nanomanipulator (NM)의 끝이와 Gatan에 의해 수정되었다. 표준 크라이 프렙 챔버에 대해, AC 블레이드 NM 팁에 대한 더 큰 히트 싱크를 제공하는 것이 크다. 또한, AC는 NM 팁의 열 교환을위한 구리 머리 띠를 연결하는 클램프가 장착되어 있습니다. FIB / SEM의 공압은 NM가 될 수 있도록 수정 된 샘플 챔버가 배출 된 경우에도 삽입 된 상태로 유지. 이는이 연구에서 사용 된 파라미터가 제일 위에 나열된 기기에 적합 주목해야한다; 이러한 매개 변수는 다른 유형의 장비로 작업 할 때 조절 될 필요가있다. 이 프로토콜을 사용하여 작업하는, 저온 학을 처리하기위한 일반적인주의 사항은, 액체 질소 진공 시스템은해야다음 될 수있다.
이 방법은 용액 또는 나노 입자를 포함하는 고분자 매트릭스에서, 선충에 단세포 유기체에 이르기까지, 좋은 결과 샘플의 다른 유형에서 테스트되었습니다. 절차의 여러 단계의 예는 A.에도 1-12에 도시되어있다 니제르 포자 산화 오스뮴 및 과망간산 칼륨으로 염색. 포자 먼저 추출 사이트를 식별 할 수 있습니다 (그림 1) SEM에 의해 촬영된다. 이 경우, 어떠한 포자의 단면은 충분하지만, 행 서브 마이크로 미터 정밀도로 추출 ROI의 위치를 예를 들면, 세포막으로부터 특정 거리에서 특정 세포를 슬라이스하는 것이 가능하다. 그 기능이 확인되면, 크라이 편 증착의 제 1 단계는 이온 밀링에서 빔 손상으로부터 시료를 보호하기 위해, (도 2)에 구현된다. 이 샘플은 첫 단계 O를 진행하는 52 °로 기울어 져F 밀링 (도 3) : 얇은 판의 양측에 두 개의 트렌치 스퍼터링. 샘플을 기울이면 더욱 대량으로 연결하는 두 개의 작은 다리 (그림 4)를 남겨두기 위하여 가공된다. 냉각 nanomanipulator는 얇은 판에 접촉 (그림 5)과 백금의 다른 크라이 증착들을 함께 연납 (그림 6)하게된다. 작은 연결 교량은 다음 멀리 분쇄 NM은 TEM 그리드의 부착 면적이 백금의 최종 크라이 증착 (그림 8) 납땜 (그림 7), 근처에 얇은 판으로 이동합니다. NM이어서 이온빔 투명도 (도 10 및 11)를 위해 전자 박판화 라멜라 (도 9)로부터 분리된다. 얇은 판은 마지막으로 TEM (그림 12)로 전송되는 경우 고해상도 이미징, 분광기, 단층 촬영 및 기타 CA의 기술N 사용될 수.
그림 1. A. 포자의 극저온-SEM 이미지 백금 증착하기 전에 니제르.
그림 2. 백금 증착 후 그림 1 만 치료 전에 같은 지역.
그림 2와 같은 지역의 그림 3. 극저온-SEM 이미지, 트렌치 밀링, 백금 증착 및 경화 후, 52 º 기울어 진행(3.7 단계 참조).
리프트 아웃에 대한 준비가 그림 4. 얇은 판.
그림 5. 차가운 nanomanipulator 팁 라멜라와 접촉한다.
그림 6. 두 번째 백금 크라이 증착 nanomanipulator와 얇은 판을 함께 납땜하는 데 사용됩니다.
: FO 내용 너비 = "5 인치"FO MG 고도는 = "그림 7"
그림 7. 차가운 nanomanipulator는 TEM 그리드의 부착 영역에 얇은 판을 전송하는 데 사용됩니다.
그림 8. 크라이 증착 TEM 그리드에 얇은 판을 부착 한 번 더 사용됩니다.
그림 9. 얇은 판은 nanomanipulator 무료 잘라 이제 저장 또는 투명 전자에 얇게 하나에 대한 준비가되어 있습니다.
그림 10. 숱의 중간 단계를 단면에서 보이는 몇 가지 포자.
. 최종 숱이 후 샘플의 11 극저온-SEM 이미지를 그림; 다른 포자의 대부분은 얇은 판 컬하기 시작했기 때문에 멀리 분쇄되어야했다.
그림 12. 얇은 판의 복합 크라이 TEM 사진을. 알 스텁의 일부가 포함되어 있습니다얇은 판 (검은 색 화살표)에서.
이 프로토콜은 실온에서 재료 과학에서 사용되는 표준 FIB / TEM 샘플 준비의 극저온에 오히려 간단 적응이다. 샘플 표면이 불균일 한 경우 curtaining가 발생할 수 있지만,이 방법은, 기계적인 변형과 칼 마크 (microtomy의 주요 단점)의 자유 TEM 샘플을 생성한다. 그것은 매끄럽고 특색이 13이 될 때까지이 경화 캡핑 층 (이 작업 편에 사용 하였다), 극저온의 증착에 의해 감소 될 수있다. 매우 경도가 다른 구성 요소와 샘플들이 제조 동안 스트레스 하에서 분해 할 위험없이도 제조 할 수있다. 내부 응력은 여전히 얇은 라멜라이 섹션의 크기가 감소되어야하는 경우, 구부러 지거나 휘지 발생할 수있다. 다른 방식에 비해 단점으로 인해 이온 빔과 샘플의 이온의 주입을 가능에 노출 생물학적 구조를 변경하는 가능성이다. 이러한 단점은 또한 샘플 prepar 대한 RT에서 발생할재료 과학 15 ATION. 이들은 이온 (500 ~ 1,000 V)에 대한 낮은 가속 전압에서 최종 폴리싱 단계와 씨닝을 완료하여 감소 될 수있다. 이 매우 부드러운 연마 단계는 얇은 판의 손상 층을 제거합니다.
때문에 극저온 증착 (3.5, 3.10 및 3.13 단계)의 특성, 샘플의 큰 부분이되어 원래의 표면의보기를 방해, 적용됩니다. 이 단계 3.3에서 제시된대로 여러 마킹이 사용되지 않는 것이 곤란, ROI를 추적하도록 할 수있다.
단계 공기와 접촉하는 4.5 및 4.7 얇은 라멜라 위험 중. 이것은 아마도 중요한 기능을 왜곡의 시점, 샘플의 표면 상에 얼음 결정을 형성하기 위해 공기에 수분을 야기으로 피해야한다. 그 단계는 가능한 한 빨리 수행되어야하지만, 동시에 전송 중에 부주의는 시료의 손실이 발생할 가능성이 그것을자기. 그것은 사용자가 실제 샘플에 대한 시도가 이루어지기 전에 빈 TEM 격자를 사용하여 이러한 단계를 연습하는 것이 좋습니다.
재료 과학, FIB 악기 상용화 10 년 내 TEM 샘플 준비의 주요 방법이되었다. 그것은 거의 모든 시료에 사용될 수 있기 때문에, 시료의 종류에 제조 기술을 조정할 필요성을 제거한다. 우리는 강력하게 같은이, 극저온의 온도에서 분석 절차 덕분에 일어날 수 있으리라 생각합니다. 큰 샘플에의 응용은 아직도 알아내는 보존 유리화 된 상태에서 그들을 할 수있는 능력에 따라, 그러나 3,5 동결 등의 플 런지 동결 또는 고압 등의 기술은이 문제에 대한 최적의 솔루션이 될 증명할 수 있습니다.
저자가 공개하는 게 없다.
이 연구는 FP7 용량 계획 (부여 번호 INFRA-2010-262163)에서 유럽 공동체 연구 인프라에 의해 자금을 조달 QNano 프로젝트 http://www.qnano-ri.eu의 지원을 받았다.
우리는 또한 금융 지원을위한 연구위원회 Formas 감사합니다.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strata DB 235 | FEI | FIB/SEM | |
Omniprobe 100 | Oxford Instruments | nanomanipulator | |
Alto 2500 | Gatan | cryo preparation chamber | |
cryo-holder model 626 | Gatan | cryo transfer TEM holder | |
Tecnai F30 | FEI | TEM |
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