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Cryo Electron Microscópios, ou de varredura (MEV) ou de transmissão (TEM), são amplamente utilizados para a caracterização de amostras biológicas ou outros materiais com alto teor de água 1. A SEM / Focused Ion Beam (FIB) é usado para identificar características de interesse em amostras e extrair, uma lamela elétron-fina e transparente de transferência para um crio-TEM.
Aqui é apresentado um protocolo utilizado para preparar amostras de crio-MET de esporos de Aspergillus niger, mas que pode ser facilmente adaptado a qualquer número de micro-organismos ou soluções. Nós fazemos uso de uma estação de transferência de crio personalizado construído e uma crio-SEM preparação câmara modificado 2. Os esporos são tomadas a partir de uma cultura, mergulham-congelado numa lama de azoto líquido e observadas no crio-SEM para seleccionar uma região de interesse. Uma lamela fina é então extraída usando o FIB, ligado a uma rede de MET e subsequentemente eliminadas até electrões transparência. A grade é transferido para um suporte de crio-MET e para uma ETM para estudos de alta resolução. Graças à introdução de uma ponta nanomanipulator resfriado e uma estação de transferência de crio, este protocolo é uma adaptação simples de temperatura criogênica da preparação FIB usado rotineiramente de amostras TEM. Como tal, tem as vantagens de se exigir uma pequena quantidade de modificações para instrumentos, instalações e procedimentos existentes; ele is fácil de implementar; que tem uma ampla gama de aplicações, em princípio, a mesma que para a preparação da amostra de crio-MET. Uma limitação é que requer tratamento eficiente dos espécimes em passos críticos para evitar ou minimizar as contaminações.
Neste protocolo de um cryo-FIB/SEM é usado para produzir as amostras de MET a partir de uma região específica da amostra, previamente identificada com elevada precisão por análise MEV. A microscopia eletrônica (varredura e transmissão) a análise de amostras biológicas é uma técnica de rotina usados para pesquisa e diagnóstico. SEM é fácil de empregar e interpretar bastante rápido e, mas a informação só é obtida a partir da superfície da amostra e com uma resolução na faixa de 1,5 nm. TEM tem uma resolução maior, mas é mais difícil de implementar, a análise de imagem é menos simples e que a informação é obtida a granel, as amostras devem ser diluídas a elétron transparência (menos de cerca de 500 nm de espessura). Um problema adicional é que os requisitos de vácuo desses instrumentos raramente são toleradas por amostras que contêm água. Na maioria dos casos, as amostras biológicas devem ser quer quimicamente fixo (substituindo a água com, por exemplo, polímeros) ou seca. Em ambos os casos, mudanças significativas nomorfologia e estrutura das amostras são susceptíveis de ocorrer. Preparação Cryo TEM de espécimes hidratados induz alterações químicas mínimas e produz amostras o mais próximo possível do seu estado nativo, especialmente se vitrificação de gelo é obtido 1-6.
O FIB é amplamente usado para preparar amostras para TEM suas numerosas vantagens 7. Para citar alguns: o uso de íons de alta energia a incidência quase normal minimiza o efeito das taxas de moagem diferenciais relacionadas com as matérias-; a região extraído a partir da amostra a granel pode ser escolhida com uma precisão sub-mícron; uma quantidade muito pequena de material é extraído. Alguns desenvolvimentos técnicos recentes tornaram possível usando o FIB também para preparação de amostras TEM em temperaturas criogênicas 2,8-10. Há várias vantagens em relação ao método tradicional de preparação de crio-micrótomo 11,12 utilizado principalmente para amostras de matéria macia, tais como a ausência de deformação mecânica da lamela cortado,a ausência de marcas de faca ea possibilidade de preparar amostras compostas com interfaces de disco / macios ou componentes.
Nota: Todos os parâmetros indicados no presente protocolo são válidas para os instrumentos e modelos aqui indicados. Alguns desses parâmetros (marcadas com * no texto) pode ser diferente, se um outro fabricante ou modelo é usado.
1. Start-up da FIB / SEM
2. Congelação Amostra
3. Ion Milling
4. Cryo Transferência para TEM
Neste trabalho fez uso de: a dupla viga FIB / SEM equipado com um nanomanipulator e uma câmara de crio-preparação; TEM um com um suporte de transferência de crio; uma estação de transferência de crio protótipo. O anticontaminator (AC) lâminas da câmara de crio-preparação e a ponta do nanomanipulator (NM) foram modificados por Gatan. Com relação a uma câmara de crio-preparação padrão, as lâminas AC são maiores para proporcionar uma maior dissipador de calor para a ponta NM. Além disso, o AC está equipada com grampos para ligar as tranças Cu para a troca de calor com a ponta NM. Os pneumáticos do FIB / SEM foram modificados para permitir que o NM ser e permanecer inserido, mesmo quando a câmara da amostra foi ventilado. Deve notar-se que os parâmetros utilizados neste trabalho são os mais adequados para o equipamento acima listadas; os parâmetros podem ser ajustados para necessário ao trabalhar com outros tipos de equipamentos. Para trabalhar com este protocolo, as precauções normais para a manipulação de criogenia, sistemas de nitrogênio e vácuo líquido deveser seguidas.
O método foi testado em diferentes tipos de amostras, com bons resultados, que varia a partir de soluções ou de matrizes poliméricas contendo nanopartículas, ao organismo unicelular para nemátodes. Exemplos dos vários passos do processo estão ilustrados nas Figuras 1-12 em A. esporos niger corados com tetróxido de ósmio e permanganato de potássio. Os esporos são primeiro fotografada por SEM (Figura 1) para identificar o local de extracção. Neste caso, uma secção transversal de qualquer esporo era suficiente, mas é possível posicionar o ROI para extracção com precisão sub-micrométrico de, por exemplo, uma fatia de uma célula específica, a uma distância específica a partir da membrana celular. Uma vez que a característica de interesse foi identificada, a primeira etapa da deposição de crio-Pt é implementada (Figura 2), para proteger a amostra de danos a partir da moagem de feixe de iões. A amostra é inclinada a 52 ° para prosseguir com os primeiros passos Sf de moagem (figura 3): a pulverização de duas trincheiras em ambos os lados da lamela. A amostra é então inclinada para trás e ainda triturada para deixar apenas duas pequenas pontes de ligação que para a maior parte (Figura 4). O nanomanipulator arrefecido é trazido em contacto com a lamela (Figura 5) e outro de crio-deposição de Pt soldas juntos (Figura 6). As pequenas pontes de ligação são, em seguida, moído de distância e o NM move a lamela perto da área de fixação da grelha TEM (Figura 7), onde é soldado com um crio-deposição final Pt (Figura 8). O NM é então separado da lamela (Figura 9), a qual é diluída para baixo a transparência de electrões com o feixe de iões (Figura 10 e 11). A lamela é finalmente transferido para a ETM (Figura 12) onde imagens de alta resolução, espectroscopia, a tomografia e outras técnicas can ser empregues.
Figura 1. Imagem Cryo-SEM de esporos de A. niger, antes de deposição de Pt.
Figura 2. A mesma área na Figura 1, após a deposição de Pt, mas antes da cura.
Imagem Figura 3. Cryo-SEM da mesma área na figura 2, inclinado 52 °, após a deposição de Pt e de cura, com a moagem trincheira curso(Veja o passo 3.7).
Figura 4. A lamela, pronto para elevador-out.
Figura 5. A ponta nanomanipulator frio faz contato com a lâmina.
Figura 6. Um segundo Pt crio-deposição é usado para soldar conjuntamente o nanomanipulator e a lamela.
Figura 7. Nanomanipulator O frio é utilizado para transferir a lamela para a área de fixação da grelha TEM.
Cryo-deposição Figura 8. For usado mais uma vez, para fixar a lâmina à grelha TEM.
Figura 9. A lamela é cortado livre do nanomanipulator e agora está pronto para armazenamento ou diluindo a elétron transparência.
Figura 10. Um passo intermediário de adelgaçamento, com poucos esporos visíveis em secção transversal.
Figura 11 imagem Cryo-SEM da amostra após o desbaste final.; a maior parte dos outros esporos tinha que ser moído para longe porque a lamela começaram a enrolar.
Figura 12. Uma imagem crio-TEM composto da lamela. Parte do stub Al foi incluídona lamela (seta preta).
Este protocolo é uma adaptação bastante simples a temperaturas criogênicas da preparação padrão da amostra FIB / TEM utilizada em ciências de materiais em temperatura ambiente. O método produz amostras TEM livres de deformação mecânica e marcas de faca (a grande desvantagem de microtomia), embora curtaining pode ocorrer se a superfície da amostra é heterogênea. Este pode ser reduzido por crio-deposição de uma camada de nivelamento (neste trabalho de Pt foi usado), curado até que seja lisa e sem traços 13. As amostras com componentes de dureza muito diferente pode ser preparado também sem o risco de que iria quebrar sob o esforço durante a preparação. As tensões internas podem ainda fazer com que a lâmina fina de dobrar ou enrolar, caso em que o tamanho da secção tem de ser reduzida. A desvantagem em comparação com outro método é a possibilidade de alterar a estrutura biológica devido a exposição ao feixe de iões e possível implantação de iões na amostra. Estas desvantagens também ocorrer à TA durante amostra preparção em ciência dos materiais 15. Eles podem ser reduzidos através do preenchimento do desbaste com um passo final de polimento ao menor tensão de aceleração de iões (500-1.000 V). Esta etapa de polimento muito suave irá remover a camada danificada da lamela.
Devido à natureza do crio-deposição (passos 3.5, 3.10 e 3.13), grandes partes da amostra irá ser coberto, obstruindo assim a vista da superfície original. Isso pode torná-lo difícil de acompanhar o ROI, a menos que várias marcas são usadas como sugerido no passo 3.3.
Durante as etapas 4.5 e 4.7 os riscos lamelas finas que entram em contacto com o ar. Isto tem que ser evitada, pois causaria a humidade no ar para formar cristais de gelo na superfície da amostra, possivelmente, para o ponto de obscurecer características importantes. Essas etapas devem ser realizadas tão depressa quanto possível, mas ao mesmo tempo um manuseamento incorrecto durante a transferência é susceptível de provocar a perda da amostra eleself. Recomenda-se que o usuário pratica esses passos usando grades TEM vazios antes for feita uma tentativa em uma amostra real.
Na ciência dos materiais, o instrumento FIB tornou-se o principal método de preparação de amostras TEM dentro de uma década de sua comercialização. Uma vez que pode ser utilizado em praticamente qualquer amostra, que elimina a necessidade de adaptar a técnica de preparação para o tipo de amostra. Acreditamos firmemente que o mesmo poderia acontecer em temperaturas criogênicas, graças ao procedimento detalhado aqui. A sua aplicação a amostras maiores ainda está sujeita à capacidade de crio-preservação-los em um estado vitrificados, mas técnicas como mergulhar-congelamento ou de alta pressão de congelamento de 3,5 pode revelar-se as soluções ótimas para o problema.
Autores têm nada a revelar.
Esta pesquisa recebeu apoio do Projeto QNano http://www.qnano-ri.eu que é financiado pelas infra-estruturas da Comunidade Europeia de Investigação no âmbito do Programa Capacidades FP7 (Grant No. INFRA-2010-262163).
Agradecemos também o conselho de pesquisa Formas de apoio financeiro.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strata DB 235 | FEI | FIB/SEM | |
Omniprobe 100 | Oxford Instruments | nanomanipulator | |
Alto 2500 | Gatan | cryo preparation chamber | |
cryo-holder model 626 | Gatan | cryo transfer TEM holder | |
Tecnai F30 | FEI | TEM |
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