Method Article
Cryo Electron Microscope, soit à balayage (MEB) ou de transmission (TEM), sont largement utilisés pour la caractérisation des échantillons biologiques ou d'autres matériaux avec une forte teneur en eau 1. Une SEM / Focused Ion Beam (FIB) est utilisé pour identifier les caractéristiques d'intérêt dans des échantillons et extraire une lame mince, électron-transparent pour le transfert à un cryo-MET.
Nous présentons ici un protocole utilisé pour préparer les échantillons cryo-TEM des spores d'Aspergillus, mais qui peut facilement être adapté pour n'importe quel nombre de micro-organismes ou des solutions. Nous faisons usage d'une station de transfert cryo-construit sur mesure et une chambre de préparation cryo-SEM modifié 2. Les spores sont prises à partir d'une culture, plongez-gelés dans une bouillie de l'azote liquide et observé dans la cryo-SEM pour sélectionner une région d'intérêt. Une lame mince est ensuite extrait à l'aide du FIB, fixé à une grille de TEM et ensuite dilué électrons à la transparence. La grille est transférée à un titulaire de cryo-MET et dans un TEM pour les études à haute résolution. Merci à l'introduction d'une pointe de nanomanipulateur refroidi et une station cryo-transfert, ce protocole est une adaptation simple à la température cryogénique de la préparation FIB régulièrement utilisé des échantillons TEM. Comme tel, il a l'avantage d'exiger une petite quantité de modifications à instruments, des configurations et des procédures existantes; il is facile à mettre en œuvre; elle a une large gamme d'applications, en principe, les mêmes que pour la cryo-TEM préparation de l'échantillon. Une limitation est qu'il nécessite une manipulation habile des échantillons lors des étapes cruciales pour éviter ou minimiser les contaminations.
Dans ce protocole, un cryo-FIB/SEM est utilisée pour produire des échantillons TEM d'une région spécifique de l'échantillon, préalablement identifiés avec une grande précision par analyse SEM. La microscopie électronique (balayage ou transmission) l'analyse des échantillons biologiques est une technique de routine utilisées pour la recherche et le diagnostic. SEM est assez rapide et facile à utiliser et à interpréter, mais l'information est obtenue uniquement à partir de la surface de l'échantillon et avec une résolution de l'ordre de 1,5 nm. TEM a une résolution plus élevée, mais est plus difficile à mettre en œuvre, l'analyse d'image est moins simple et que l'information est obtenue en vrac, les échantillons doivent être éclaircis à électrons transparence (inférieure à environ 500 nm d'épaisseur). Un problème supplémentaire est que les exigences de vide de ces instruments sont rarement tolérés par des échantillons contenant de l'eau. Dans la plupart des cas, les échantillons biologiques doivent être fixés chimiquement (en remplaçant l'eau avec, par exemple, des polymères) ou séché. Dans les deux cas, des changements importants à lala morphologie et la structure de l'échantillon sont susceptibles de se produire. Cryo TEM préparation des éprouvettes hydratées induit des changements minimes de produits chimiques et produit des échantillons aussi près que possible de leur état natif, en particulier si la vitrification de la glace, on obtient 6.1.
Le FIB est largement utilisé pour préparer les échantillons TEM pour ses nombreux avantages 7. Pour n'en nommer que quelques-uns: l'utilisation d'ions de haute énergie en incidence quasi-normale minimise l'effet des différentiels des taux d'usinage liés aux matières; la région extraite à partir de l'échantillon en vrac peut être choisi avec une précision inférieure au micron; une très petite quantité de matériau est extrait. Certains développements techniques récents ont permis à l'aide du FIB aussi pour TEM préparation des échantillons à des températures cryogéniques 2,8-10. Il existe plusieurs avantages par rapport au procédé traditionnel de préparation de cryo-microtomie 11,12 principalement utilisé pour les échantillons de matière molle, tels que l'absence de déformation mécanique de la lamelle en tranches,l'absence de marques de couteau et la possibilité de préparer des échantillons composites avec des interfaces dures / molles ou des composants.
REMARQUE: tous les paramètres donnés dans ce protocole sont valables pour les instruments et les modèles indiqués ici. Certains de ces paramètres (marqués par * dans le texte) peuvent différer si un autre fabricant ou le modèle utilisé.
1. Démarrage de la FIB / SEM
2. Congélation de l'échantillon
3. Ion Fraisage
4. Cryo transfert de TEM
Dans ce travail, nous avons utilisé: un double faisceau FIB / SEM équipé d'un nanomanipulateur et une chambre cryo-préparation; un TEM avec un support cryo-transfert; une station de transfert de cryo prototype. Le anticontaminator (AC) lames de la chambre cryo-préparation et la pointe de l'nanomanipulateur (NM) ont été modifiés par Gatan. En ce qui concerne une chambre cryo-préparation standard, les pales AC sont plus grands pour fournir un plus grand dissipateur de chaleur pour la pointe de NM. Par ailleurs, le courant alternatif est muni d'attaches pour le raccordement des tresses de Cu pour l'échange de chaleur avec l'extrémité de la NM. Les pneumatiques de la FIB / SEM ont été modifiés pour permettre le NM d'être et de rester insérées même lorsque la chambre de l'échantillon a été évacué. Il convient de noter que les paramètres utilisés dans ce travail sont les mieux adaptés pour l'équipement énuméré ci-dessus; ces paramètres peuvent être ajustés nécessaire lorsque l'on travaille avec d'autres types d'équipements. Pour travailler avec ce protocole, les précautions habituelles pour la manipulation de la cryogénie, systèmes d'azote et de vide liquides devraitsuivre.
La méthode a été testée sur différents types d'échantillons avec de bons résultats, allant de solutions ou de matrices polymères contenant des nanoparticules, à organisme unicellulaire aux nématodes. Des exemples des différentes étapes du procédé sont illustrées sur les figures 1 à 12 sur R. niger spores colorées avec du tétroxyde d'osmium et le permanganate de potassium. Les spores sont d'abord imagées par MEB (figure 1) pour identifier le site d'extraction. Dans ce cas, une coupe transversale selon l'une quelconque des spores était suffisante, mais il est possible de positionner le retour sur investissement pour l'extraction avec une précision sous-micrométrique, par exemple, découper une cellule spécifique à une distance spécifique à partir de la membrane cellulaire. Une fois que la caractéristique présentant un intérêt a été identifié, la première étape de la déposition cryo-Pt est appliqué (figure 2), afin de protéger l'échantillon contre les dommages de faisceau à partir de l'usinage ionique. L'échantillon est incliné de 52 ° par rapport à procéder aux premières étapes of la fraise (figure 3): la pulvérisation de deux tranchées sur les deux côtés de la lamelle. L'échantillon est ensuite incliné vers l'arrière et en outre broyé pour ne laisser que deux petits ponts qui la relient à la masse (figure 4). Le nanomanipulateur refroidi est mis en contact avec la lamelle (Figure 5) et un autre dépôt de cryo-Pt les soudures ensemble (figure 6). Les petits ponts de liaison sont ensuite broyés à une distance de et le MN se déplace de la lamelle à proximité de la zone de fixation de la grille de TEM (figure 7), où il est soudé avec un cryo-dépôt final de Pt (figure 8). Le NM est ensuite séparé de la lamelle (Figure 9), qui est amincie vers le bas de la transparence d'électrons avec le faisceau d'ions (Figure 10 et 11). La lamelle est finalement transféré à la TEM (Figure 12) où l'imagerie haute résolution, la spectroscopie, la tomographie et d'autres techniques can être employé.
Figure 1. L'image Cryo-SEM de spores de A. Niger, avant le dépôt Pt.
Figure 2. La même zone de la figure 1 après le dépôt Pt mais avant le durcissement.
Figure 3. L'image Cryo-SEM de la même zone sur la figure 2, inclinée de 52 °, après le dépôt de Pt et le durcissement, avec la tranchée en cours de fraisage(Voir étape 3.7).
Figure 4. L'lamelle, prêt pour l'ascenseur-out.
Figure 5. L'extrémité de nanomanipulateur froid est en contact avec la lamelle.
Figure 6. Un deuxième Pt cryo-dépôt est utilisé pour souder ensemble les nanomanipulateur et la lamelle.
Figure 7. Nanomanipulateur Le froid est utilisé pour transférer la lamelle à la zone de fixation de la grille de TEM.
Figure 8. Cryo-dépôt est utilisé une fois de plus pour fixer la lamelle à la grille de TEM.
Figure 9. La lamelle est coupé libre de la nanomanipulateur et il est maintenant prêt pour stockage ou l'amincissement à électrons transparence.
Figure 10. Une étape intermédiaire de l'amincissement, avec quelques spores visibles en coupe transversale.
Figure 11 images Cryo-SEM de l'échantillon après l'éclaircie finale.; la plupart des autres spores ont dû être blanchi de suite parce que la lamelle avait commencé à s'enrouler.
Figure 12. Composite image cryo-MET de la lamelle. Une partie de la souche Al a été inclusdans la lamelle (flèche noire).
Ce protocole est une adaptation assez simple à des températures cryogéniques de la préparation de l'échantillon FIB / TEM standard utilisé en sciences des matériaux à température ambiante. La méthode produit des échantillons TEM libres de déformation mécanique et marques de couteau (le principal inconvénient de microtomie), bien que rideaux peut se produire si la surface de l'échantillon n'est pas homogène. Ceci peut être réduit par cryo-dépôt d'une couche de couverture (Pt dans ce travail a été utilisé), durcie jusqu'à ce qu'elle soit lisse et sans relief 13. Les échantillons avec des composants de dureté très différente peuvent être préparés aussi bien sans le risque qu'ils se rompre sous le stress pendant la préparation. Contraintes internes peuvent encore causer la lame mince de plier ou boucle, dans ce cas, la taille de la section doit être réduite. Un inconvénient par rapport à l'autre méthode est la possibilité de modifier la structure biologique due à l'exposition au faisceau d'ions et possible l'implantation des ions dans l'échantillon. Ces inconvénients se produisent également à la température ambiante pour l'échantillon prépaation en science des matériaux 15. Ils peuvent être réduits en effectuant l'amincissement par une étape de polissage finale à la plus basse tension d'accélération pour les ions (V) 500-1000. Cette étape de polissage très doux va enlever la couche endommagée de la lamelle.
En raison de la nature de la cryo-dépôt (étapes 3.5, 3.10 et 3.13), de grandes parties de l'échantillon seront couverts, obstruant ainsi la vue de la surface d'origine. Cela peut rendre difficile de garder une trace du retour sur investissement, à moins que plusieurs marques sont utilisées comme suggéré dans l'étape 3.3.
Au cours des étapes 4.5 et 4.7 les fines lamelles de risques à venir en contact avec l'air. Ceci doit être évité car il provoquerait l'humidité de l'air pour former des cristaux de glace sur la surface de l'échantillon, le cas échéant, au point d'obscurcir les caractéristiques importantes. Ces étapes doivent être effectuées aussi rapidement que possible, mais dans le même temps une mauvaise manipulation lors du transfert est susceptible d'entraîner la perte de l'échantillon, ilauto. Il est recommandé que l'utilisateur exerce ces étapes en utilisant vides TEM grilles avant une tentative sur un échantillon réel est fait.
En science des matériaux, l'instrument FIB est devenu la principale méthode de TEM préparation de l'échantillon dans une décennie de sa commercialisation. Etant donné qu'il peut être utilisé sur pratiquement n'importe quel échantillon, il supprime la nécessité d'adapter la technique de préparation à la nature de l'échantillon. Nous croyons fermement que la même chose pourrait se produire à des températures cryogéniques, grâce à la procédure décrite ici. Son application à des échantillons plus importants est encore soumis à la capacité de cryoconservation dans un état vitrifié, mais des techniques telles que le gel ou la plongée sous haute pression de congélation 3,5 peut s'avérer des solutions optimales à ce problème.
Les auteurs ont rien à révéler.
Cette recherche a reçu le soutien du projet QNano http://www.qnano-ri.eu qui est financé par les infrastructures de recherche de la Communauté européenne au titre du programme Capacités du 7e PC (Grant No. INFRA-2010-262163).
Nous remercions également le Conseil de recherches Formas de soutien financier.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strata DB 235 | FEI | FIB/SEM | |
Omniprobe 100 | Oxford Instruments | nanomanipulator | |
Alto 2500 | Gatan | cryo preparation chamber | |
cryo-holder model 626 | Gatan | cryo transfer TEM holder | |
Tecnai F30 | FEI | TEM |
Demande d’autorisation pour utiliser le texte ou les figures de cet article JoVE
Demande d’autorisationThis article has been published
Video Coming Soon