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Cryo Electron Microscopi, sia a scansione (SEM) o trasmissione (TEM), sono ampiamente utilizzati per la caratterizzazione di campioni biologici o di altri materiali con un elevato contenuto di acqua 1. A SEM / Focused Ion Beam (FIB) viene utilizzato per identificare le caratteristiche di interesse in campioni ed estrarre una lamella sottile elettrone-trasparente per il trasferimento ad un crio-TEM.
Qui vi presentiamo un protocollo utilizzato per preparare i campioni crio-TEM di spore di Aspergillus niger, ma che può essere facilmente adattato per qualsiasi numero di microrganismi o soluzioni. Noi facciamo uso di una stazione di crio-transfer personalizzato costruito e modificato crio-SEM camera di preparazione 2. Le spore sono presi da una cultura, immergersi, congelato in una granita azoto liquido e osservato nel crio-SEM per selezionare una regione di interesse. Un sottile lamella viene poi estratto utilizzando il FIB, attaccato ad una griglia TEM e successivamente diluito all'elettrone trasparenza. La griglia viene trasferito a un titolare crio-TEM e in un TEM per studi ad alta risoluzione. Grazie all'introduzione di una punta nanomanipulator raffreddato e una stazione di crio-transfer, questo protocollo è un adattamento semplice a temperatura criogenica del preparato FIB utilizzato di routine di campioni TEM. Come tale, ha il vantaggio di richiedere una piccola quantità di modifiche agli strumenti esistenti, le impostazioni e le procedure; sono ios facile da implementare; ha una vasta gamma di applicazioni, in linea di principio lo stesso che per la preparazione del campione crio-TEM. Una limitazione è che richiede una gestione sapiente dei campioni a passaggi critici per evitare o minimizzare contaminazioni.
In questo protocollo una cryo-FIB/SEM viene utilizzato per produrre campioni TEM da una regione specifica del campione, precedentemente identificato con elevata precisione mediante analisi SEM. Microscopia elettronica (scansione o trasmissione) analisi di campioni biologici è una tecnica di routine utilizzato per la ricerca e diagnostica. SEM è piuttosto veloce e facile da utilizzare e interpretare, ma le informazioni vengono ottenute solo dalla superficie del campione e con una risoluzione nell'intervallo 1.5 nm. TEM ha una risoluzione più alta, ma è più difficile da attuare, l'analisi delle immagini è meno semplice e che si ottiene informazione di massa, i campioni devono essere diluiti a elettroni trasparenza (meno di circa 500 nm di spessore). Un ulteriore problema è che i requisiti per vuoto di tali strumenti sono raramente tollerati da campioni contenenti acqua. Nella maggior parte dei casi, i campioni biologici devono essere fisso chimicamente (acqua con sostituzione, per esempio, polimeri) o secchi. In entrambi i casi, le modifiche significative allamorfologia e struttura del campione sono suscettibili di verificarsi. Crio TEM preparazione dei campioni idratati induce cambiamenti chimici minime e produce campioni più vicino possibile al loro stato nativo, soprattutto se vetrificazione di ghiaccio si ottiene 1-6.
Il FIB è ampiamente utilizzato per preparare i campioni TEM per i suoi numerosi vantaggi 7. Per citarne alcuni: l'uso di ioni ad alta energia ad incidenza quasi normale riduce al minimo l'effetto dei tassi di fresatura differenziali legati ai materiali; la regione estratto dal campione globale può essere scelto con una precisione sub-micron; una piccola quantità di materiale viene estratto. Alcuni recenti sviluppi tecnici hanno reso possibile con il FIB anche per la preparazione del campione TEM a temperature criogeniche 2,8-10. Ci sono diversi vantaggi rispetto al metodo tradizionale di preparazione crio-microtomia 11,12 utilizzato principalmente per campioni materia soffice, come la mancanza di deformazione meccanica della lamella affettato,l'assenza di segni di coltello e la possibilità di preparare campioni compositi con hard / interfacce o componenti morbide.
NOTA: tutti i parametri indicati nel presente protocollo sono validi per gli strumenti ei modelli qui indicati. Alcuni di questi parametri (contrassegnati con * nel testo) possono variare se si utilizza un altro fabbricante o il modello.
1. Start-up del FIB / SEM
2. Congelamento del campione
3. Fresatura Ion
4. Cryo Trasferimento a TEM
In questo lavoro abbiamo fatto uso di: un doppio fascio FIB / SEM dotato di nanomanipulator e una camera di crio-preparazione; un TEM con un supporto crio-transfer; una stazione di crio-transfer prototipo. Il anticontaminator (AC) lame della camera di crio-preparazione e la punta del nanomanipulator (NM) sono stati modificati da Gatan. Rispetto ad una camera di crio-preparazione standard, le lame AC sono più grandi di fornire una maggiore dissipatore di calore per la punta NM. Inoltre, l'AC è dotato di morsetti per il collegamento delle trecce Cu per lo scambio termico con la punta NM. I pneumatici della FIB / SEM sono state modificate per consentire al NM di essere e restare inseriti anche quando la camera del campione è stato sfiatato. Va notato che i parametri utilizzati in questo lavoro sono più adatti per l'apparecchiatura di cui sopra; tali parametri possono essere regolati necessaria quando si lavora con altri tipi di apparecchiature. Per lavorare con questo protocollo, le normali precauzioni per la manipolazione di criogenia, sistemi di azoto e vuoto liquido deveda seguire.
Il metodo è stato testato su diversi tipi di campioni con buoni risultati, che vanno da soluzioni o matrici polimeriche contenenti nanoparticelle, di organismo unicellulare ai nematodi. Esempi delle varie fasi della procedura sono illustrati nelle figure 1-12 su A. spore niger colorate con tetrossido di osmio e permanganato di potassio. Le spore vengono prima esposte mediante SEM (Figura 1) per identificare il sito per l'estrazione. In questo caso, una sezione trasversale di qualsiasi spora era sufficiente, ma è possibile posizionare il ROI per estrazione con sub-micrometrica precisione, per esempio, tagliare una cella specifica ad una distanza determinata dalla membrana cellulare. Una volta individuata la caratteristica di interesse, il primo passo della deposizione crio-Pt è implementato (Figura 2), per proteggere il campione da danni fascio dalla macinazione ione. Il campione è inclinato a 52 ° per procedere con i primi passi of la fresatura (Figura 3): lo sputtering di due trincee su entrambi i lati della lamella. Il campione viene quindi inclinato indietro e in seguito lavorato a lasciare solo due piccoli ponti che collegano alla rinfusa (Figura 4). Il nanomanipulator raffreddata viene portato a contatto con la lamella (Figura 5) e un altro crio-deposizione di Pt loro saldature insieme (Figura 6). I ponticelli di collegamento vengono poi macinati distanza e la NM sposta la lamella in prossimità della zona di fissaggio della griglia TEM (Figura 7), dove viene saldato con un finale crio-deposizione di Pt (Figura 8). Il NM viene poi separato dal lamella (Figura 9), che viene ridotto alla elettroni trasparenza con il fascio di ioni (Figura 10 e 11). La lamella è finalmente trasferito al TEM (Figura 12) dove imaging ad alta risoluzione, spettroscopia, tomografia e altre tecniche can essere impiegati.
Figura 1. Cryo-SEM immagine di spore di A. niger, prima di Pt deposizione.
Figura 2. La stessa area in Figura 1 dopo Pt deposizione ma prima dell'indurimento.
Figura 3. Cryo-SEM immagine della stessa area in Figura 2, inclinato 52 °, dopo Pt deposizione e polimerizzazione, con trincea fresatura corso(Vedi passo 3.7).
Figura 4. La lamella, pronto per lift-out.
Figura 5. La punta nanomanipulator fredda entra in contatto con la lamella.
Figura 6. A seconda Pt crio-deposizione è usato per saldare insieme le nanomanipulator e la lamella.
Figura 7. L'nanomanipulator freddo viene utilizzato per trasferire la lamella alla zona di attacco della griglia TEM.
Figura 8. Cryo-deposizione viene utilizzato ancora una volta per fissare la lamella alla rete TEM.
Figura 9. La lamella viene tagliata del nanomanipulator ed è ora pronto per l'archiviazione o diradamento di elettroni trasparenza.
Figura 10. Una fase intermedia del diradamento, con alcune spore visibili in sezione trasversale.
Figura 11 Cryo-SEM immagine del campione dopo diradamento finale.; la maggior parte degli altri spore doveva essere lavorato via perché la lamella aveva cominciato ad arricciarsi.
Figura 12. Una foto crio-TEM composito della lamella. Parte del Al stub è stato inclusonella lamella (freccia nera).
Questo protocollo è un adattamento piuttosto semplice a temperature criogeniche della preparazione del campione FIB / TEM standard utilizzato in scienze dei materiali a temperatura ambiente. Il metodo produce campioni TEM gratuitamente deformazione meccanica e segni di coltello (il grave inconveniente di microtomia), anche se tendaggi si può verificare se la superficie del campione è disomogeneo. Questo può essere ridotto crio-deposizione di uno strato di incappucciamento (in questo lavoro è stata utilizzata Pt), curato finché è liscio e informe 13. I campioni con componenti di durezza molto diversi possono essere preparate anche senza il rischio che si rompono sotto stress durante la preparazione. Sollecitazioni interne possono ancora provocare il sottile lamella di curvarsi o piegarsi, nel qual caso la dimensione della sezione deve essere ridotto. Un inconveniente rispetto ad altro metodo è la possibilità di modificare la struttura biologica a causa di esposizione al fascio di ioni e possibile impianto degli ioni del campione. Questi inconvenienti si verificano anche a TA per campione prepazione nella scienza dei materiali 15. Essi possono essere ridotte completando il diradamento con un passo lucidatura finale alla tensione più bassa per accelerare gli ioni (500-1000 V). Questo passaggio di lucidatura molto delicato rimuove lo strato danneggiato della lamella.
A causa della natura del crio-deposizione (punti 3.5, 3.10 e 3.13), gran parte del campione saranno coperti, ostacolando così la vista della superficie originale. Questo può rendere difficile tenere traccia del ROI, a meno che non si utilizzano più marcature come suggerito al punto 3.3.
Durante le fasi 4.5 e 4.7 i rischi lamelle sottili che entrano in contatto con l'aria. Questo è da evitare in quanto provocherebbe l'umidità nell'aria per formare cristalli di ghiaccio sulla superficie del campione, possibilmente fino al punto di oscurare caratteristiche importanti. Tali procedure devono essere eseguite più velocemente possibile, ma allo stesso tempo un maltrattamento durante il trasferimento può comportare la perdita del campione cheauto. Si raccomanda che l'utente esercita tali passaggi utilizzando griglie TEM vuoti prima di un tentativo su un campione reale è fatta.
In scienza dei materiali, lo strumento FIB è diventato il metodo principale di preparazione del campione TEM entro un decennio della sua commercializzazione. Poiché può essere utilizzato praticamente su qualsiasi campione, elimina la necessità di adattare la tecnica di preparazione al tipo di campione. Crediamo fermamente lo stesso potrebbe accadere a temperature criogeniche, grazie alla procedura qui dettagliata. La sua applicazione ai campioni più grandi è ancora soggetta alla possibilità di crio-conservazione loro in uno stato vetrificato, ma tecniche come tuffo congelamento o ad alta pressione di congelamento 3,5 può dimostrare di essere le soluzioni ottimali a questo problema.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Questa ricerca ha ricevuto il sostegno del Progetto QNano http://www.qnano-ri.eu che è finanziato dalle infrastrutture di ricerca della Comunità Europea nell'ambito del programma Capacità del 7 ° PQ (Grant No. INFRA-2010-262163).
Ringraziamo anche il consiglio di ricerca Formas per il sostegno finanziario.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Strata DB 235 | FEI | FIB/SEM | |
Omniprobe 100 | Oxford Instruments | nanomanipulator | |
Alto 2500 | Gatan | cryo preparation chamber | |
cryo-holder model 626 | Gatan | cryo transfer TEM holder | |
Tecnai F30 | FEI | TEM |
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