リコンビナーゼ媒介カセット交換を用いて、マウス胚性幹細胞における構造と機能の研究

要約

タンパク質は、多くの場合、異なる細胞機能を発揮することができ、複数のドメインを含みます。遺伝子ノックアウト（KO）は、この機能的多様性を考慮していません。ここでは、様々な機能ドメインまたはタンパク質の変異体の分子解剖を可能KO胚性幹細胞における組み換え媒介カセット交換（RMCE）ベースの構造と機能のアプローチを報告しています。

要約

マウスの胚または胚性幹細胞における遺伝子工学（たmESC）は、与えられたタンパク質の機能を研究することができます。タンパク質は、細胞の主力であり、しばしば翻訳後修飾によって影響を受けることができる複数の機能ドメインからなります。条件付きまたは構成ノックアウト（KO）マウスでは、全タンパク質の枯渇を考慮に入れ、この機能的多様性と規制を負いません。 MESCラインとFLPe組換え媒介カセット交換（RMCE）のためのドッキング部位がROSA26（R26）遺伝子座内に挿入された誘導されたマウスモデルは、以前に報告されました。ここでは、マルチドメインタンパク質の異なる機能の分子解剖することができます構造 - 機能アプローチについて報告します。このため、RMCE互換マウスは、KOマウスと交配されている必要があり、その後、RMCE互換KOたmESCを分離する必要があります。次に、推定レスキュー構築物のパネルは、RMCE targetiを介してR26遺伝子座に導入することができますNG。候補レスキューcDNAを容易組換えクローニングを使用してターゲティングベクターのRMCE部位の間に挿入することができます。次に、KOのたmESCはFLPeリコンビナーゼ発現プラスミドと組み合わせたターゲティングベクターでトランスフェクトされます。 RMCEは、ROSA26ドッキング部位でプロモーターレスネオマイシン耐性遺伝子を再活性化し、正しい標的化事象の選択を可能にします。このように、100％に近い高いターゲティング効率は、半高スループット様式での複数の推定レスキュー構築物の挿入を可能にする、得られます。最後に、R26駆動型救助構築物の多くは、親のKOたmESCで観察された表現型を救出する能力について試験することができます。私たちは、P120カテニン（p120ctn）表現型の読み出しとして胚様体（EB）中胚葉分化を使用してのKOたmESCにおける実証の原則構造と機能の研究を提示します。このアプローチは、重要なドメイン、推定下流経路、および疾患関連点の識別を可能にします与えられたタンパク質のためのKO表現型の基礎となる変異。

概要

哺乳動物のゲノムは、約20,000のタンパク質をコードする遺伝子が含まれていると推定されています。選択的スプライシングと翻訳後修飾は、さらに、タンパク質のレパートリーを増やします。タンパク質は、モジュラー構造^1を有し、しばしば、異なるタンパク質複合体へのそれらの動員および複数の細胞プロセス²への参加を可能にする、複数の相互作用ドメインを含みます。一つの例は、p120ctnと呼ばれる多機能性タンパク質です。 p120ctnはCtnnd1遺伝子によってコードされ、N末端およびC末端領域によって隣接大きな中央アルマジロリピートドメインから構成されています。 p120ctnのアルマジロドメインは、細胞 - 細胞接着に関与している古典的カドヘリンの高度に保存された膜近傍ドメインに結合し、それはまた、転写リプレッサーKaisoに結合します。 p120ctnのN末端ドメインは、異なるキナーゼ、ホスファターゼ、小さなRhoGTPases、及び微小管関連Pと相互作用しますroteins ^3。興味深いことに、選択的スプライシングの結果として、p120ctnアイソフォームは、4つの代替開始コドン⁴から生成することができます。それは最も5' 開始コドンから翻訳および全長N末端セグメントを含むようp120ctnアイソフォーム1Aは、最長です。 p120ctnアイソフォーム3および図4に、このN末端セグメントは、それぞれ、部分的におよび完全に削除されます。さまざまな細胞機能におけるタンパク質（またはタンパク質アイソフォーム）とそのドメインの正確な役割を理解することが課題です。

たmESCにおいて標的遺伝子は、対応する遺伝子の遺伝子欠失を介してタンパク質の機能の研究を可能にし、広く発達重要と疾患関連遺伝子および経路の同定に貢献しています。逆遺伝学では、この画期的なによる相同組換え⁵にMESC単離及び標的遺伝子の分野における進歩の結果でしたアップ。相同組換えは、DNAフラグメントが二本鎖（ds）DNA切断後に2つの類似または同一の核酸部分との間で交換されるプロセスです。二本鎖DNA切断が頻繁であるため、通常、HRは非効率的です。最近、標的相同性指向性遺伝子の効率は、部位特異的ヌクレアーゼ^6,7を用いて増加させることができるが、残念ながら、これらは、オフターゲット効果⁸を受けやすいです。遺伝子ターゲティングを可能にするためのより信頼性の高い技術は、のCre / loxP配列又はFLPe / FRTなどの部位特異的組換え系に基づいているRMCE、です。 LoxP及びFRT配列は、 バクテリオファージP1で発見され、 サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は 、それぞれ、サイトの向きを決定非対称8塩基対の配列を含む、34塩基対から成ります。例えば、DNAストレッチ内の2つのloxP部位は、flox化DNAを切除またはIとなるかどうかを決定する一方、配向のCre媒介組み換え⁹時nversed。二つの部位が異なる染色体上に位置している場合また、Creをも転位を誘導することができます。 RMCEは、クロス反応し、ゲノム遺伝子座に埋め込まれていない異種の組換え部位を利用しています。同じ異種部位に隣接するDNA断片を含有するドナープラスミドの存在下で、リコンビナーゼは、なぜなら、二重同時トランスロケーション（ 図1）のRMCE互換ゲノム遺伝子座にこのDNA断片を挿入します。ここで、のみ正しくRMCE標的クローンをドッキング細胞のR26ゲノム中に存在する「捕捉された、」プロモーターレスネオマイシン耐性遺伝子（ネオ^R）を復元着信ベクター上のプロモーター（ 図1）に対する薬剤耐性のおかげをレンダリングすることができ^10、11。これは^、<100％11しばしば近く、非常に高いターゲティング効率をもたらします/ SUP> ^12。結論として、RMCEベースのターゲティングは非常に効率的であり、構造機能研究のために使用することができます。しかし、それは事前設計ゲノム遺伝子座を必要とします。

図1. RMCE媒介ターゲティングの略図。両方は、2つの異種FRT部位（白及び赤の三角形によって示される）を保有する場合RMCEは、定義されたゲノム遺伝子座への着信ターゲティングベクターからのDNAセグメントの交換を可能にします。加えて、操作されたゲノム遺伝子座は、プロモーターおよび短縮型ネオマイシン耐性（ネオ^R）遺伝子を含みます。プロモーターを提供することによってのみ正しい組換え事象は、高いターゲティング効率で得られ、ネオマイシン耐性を復元する、入ってくるDNA断片に開始コドン。 トンの拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。彼のフィギュア。

たmESCにおけるゲノム工学は、RMCE互換マウスの生成を可能にします。 1981年に、2つのグループが胚盤胞の内部細胞塊（ICM）から多能性細胞を捕捉及び培養^13、14でそれらを維持することに成功しました。たmESCは、生殖細胞系列を含む、胚および成人の細胞のすべてのタイプの中に自己複製と分化することができます。したがって、たmESCにおいて標的遺伝子（のCre / loxPシステムを使用して）構成的または条件付きKOマウスの開発を通して逆遺伝学的研究を可能にします。しかし、マウスES細胞を分離するための古典的な方法は非常に非効率的です。いくつかの主要な改良が大幅MESC SRとウシ胎児血清^{（FBS）16を}含有する培地、及び薬理学の使用の間に交互に^、15培地（SR）に定義血清置換の使用を含む、MESCラインを導出するための成功率が増加しています例えばpluripotin又は2I ¹⁷などの論理化合物。 Pluripotin、小さな合成分子は、白血病阻害因子（LIF）およびマウス胚線維芽細胞（MEFの^）18の非存在下で未分化状態におけるたmESCの伝播を可能にします。最後に、SR / FBS培地交替プロトコルはLIFと^19、20 pluripotin組み合わせた場合たmESCは（100％に近い）非常に高い効率で単離することができることが示されています。これらのプロトコルは、その後、構造 - 機能研究のために使用することができるRMCE互換ノックアウトたmESCの効率的な分離を可能にします。

本論文では、特定の細胞プロセスに責任があるタンパク質内のキーのドメインまたは残基を同定するために、1つを可能にする方法を説明します。この目的のために、効率的MESC分離を有効に高度な技術、ターゲティングベクターのアセンブリ、およびMESCターゲティングのパイプラインを作成しましたD。このようにして、タンパク質アイソフォーム、ドメイン変異体、および下流のエフェクターとの大きなパネルがKOされたmESCで導入することができ、in vitroでの KO表現型を救出する能力について評価することができます。

プロトコル

マウス上の全ての実験は、機関投資家、国、ヨーロッパの動物の規定に従って行われました。

RMCE互換KOたmESCの単離

1. そのようなROSALUCマウス¹⁰またはROSA26-のiPSCマウス²¹などのRMCE互換マウスとヘテロ接合性KOマウスを繁殖。両方のRMCE互換マウスは、混合129 / C57BL6 /スイスの背景上で維持しました。
   注：ヘテロKOマウスとの交配は、ホモ接合型KOマウスの胚性致死を克服することをお勧めします。
2. R26座¹²にRMCEカセットを含有するヘテロ接合性KOマウスを選択するためにPCRを使用します。
3. ヘテロ接合性KOマウスとRMCE互換性、ヘテロ接合性KOマウスを繁殖し、RMCE互換性、ホモ接合型KO胚盤胞を単離します。
   1. 夕方に時間交配を設定し、交尾が翌朝プラグを確認してください。
      注：プラグは男性の凝固及び小胞腺からの分泌物の凝固で作られています。これらのプラグは、女性の膣を満たし、8持続 - 飼育後24時間。差し込まれ、女性は0.5 DPC（日ポスト交尾）の胚を運ぶことが考えられています。
      1. 、プラグをチェックし、彼女の尾の付け根で女性を持ち上げ、によって白っぽい塊のための彼女の膣口を調べるために。プラグは見ることが困難な場合、わずかに角度のついたプローブを用いて外陰部の唇を広げます。その男性とは別のプラグインの女性。
   2. 3.5 DPCの胚盤胞を収集します。
      1. 承認された方法（ 例えば、頚椎脱臼）によって妊娠した雌を安楽死させます。 midventral切開部を作り、子宮や卵管を解剖細かいハサミやピンセットを使用して（まだお互いに取り付けられています）。
      2. 45°の角度に26ゲージの針を曲げます。この曲がった針をM2培地で満たされた1 mLの注射器を取り付け、10 cmディッシュの蓋に子宮から胚盤胞をフラッシュするために使用します。
         1. に最も近い子宮の終わりに針を挿入します卵管。プランジャーを押しながら細かい鉗子と場所に針を保持します。子宮の腫れは成功したフラッシュを示します。
      3. すべての胚を収集し、新鮮なM2培地のドロップに二度、それらを洗浄するために - （200〜100μmの直径を持つ）口のピペットを使用してください。すぐに洗浄した後、培養プレートに胚盤胞を転送する（下記参照）。
         注：の胚盤胞の解剖と取り扱いが層流で行う必要があります。
4. RMCE互換KOたmESCを隔離
   1. マイトマイシンC処理したDR4 MEFを有する12ウェルプレート（ 材料の表を参照）胚盤胞の単離の前に一日を準備します。
      注：これらのMEFは、4つの薬物選択遺伝子を含有し、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するのTg（DR4）1Jae / Jマウスから単離し、そして²² 6-チオグアニンました。
      1. 0.1％ゼラチンでコートすべての培養プレート。 0.1％のゼラチンを追加培養プレートに、5％CO ₂中、37℃で5分間インキュベートし、ゼラチン溶液を吸引します。コンフルエント単層¹⁹にシード12ウェルプレート中のP2のMEFのバイアルの四分の一とMEF培地2mlでそれらを成長させる（ 表1、 材料の表を参照のこと）。
      2. 3時間マイトマイシンC（10μg/ ml）でそれらを不活性化し、リン酸緩衝生理食塩水^（PBS）19で二回洗っ。
   2. SR-ES細胞培地中のマイトマイシンC処理したMEFと、ゼラチン化12ウェルプレート上に胚盤胞（1ウェル/胚）板、口のピペットを用いて、（2ミリリットル/ウェル）のいずれか2μMのpluripotinまたは2Iを補充します（1μMのErkインヒビターPD0325901及び3μMGSK3インヒビターCHIR99021）。 5％CO ₂で37℃でインキュベートします。
   3. 3日間 - すべての2（pluripotinまたは2Iを補っ）SR-ES細胞培地をリフレッシュします。
   4. stereomicro下の各胚盤胞を調べ4.0Xの倍率でスコープとMEF層へのハッチングと添付ファイルを確認してください。
      注：胚盤胞のハッチ、彼らはそれらをカプセル化透明帯を失います。アタッチされていない胚盤胞とのウェルズは、口のピペットを使用してリフレッシュする必要があります。
   5. 使い捨てチップとP10ピペットを用いて培養12日 - 10後（実体顕微鏡を使用して）、個々のICMの増生を選択します。 （室温）30μL/ウェルのPBSを含むV字型、96ウェルプレートに培地の約10μLで伸長を転送します。
   6. 各ウェルにマルチチャンネルピペットを使用して、0.25％トリプシンの50μLを加え、5％CO ₂中で37℃で3分間インキュベートします。
   7. FBS含有MESC媒体の100μLを追加します。 10〜15回ピペッティングによって単一細胞にICMの派生物を解離。そしてICMコロニーが採取される前に、一日に調製したマイトマイシンC処理した、96-ウェルMEFプレートに解離した細胞を移します。
   8. OMI、これ以降のステップから MESC媒体からのT pluripotinまたは2I。次の日に、（100μL/ウェル）SR含有MESC媒体にFBS-からメディアを変更します。
   9. 96〜24ウェルフォーマット¹⁹から確立MESCラインを展開。
      1. PBS200μLで細胞を洗浄し、トリプシンの50μLを添加し、5％CO中で37℃で5分間インキュベートFBSベースMESC培地100μLを加えます。 10ピペットで解離 - マルチチャンネルピペットを用いて15回。およびマイトマイシンC処理した、24-ウェルMEFプレートに解離した細胞を移します。
      2. 次の日にSRベースのメディアに変更します。 24から6ウェルフォーマットと同様にたmESCを展開。コンフルエントな6ウェルプレート¹⁹から4 freezings - 3を作ります。
   10. 選択のR26軌跡²³及びKO対立遺伝子（この場合、p120ctnためのPCRプライマーを用いてRMCE互換、ホモKOたmESCを識別する; p120ctnヌルとフロックス対立遺伝子についてPCRを以前に記載しました。小娘= "外部参照"> 12）。

表1.培養培地。すべてのメディアは、4℃で保存し、使用前に37℃で30分間に温めました。

組換えクローニングを用いRMCE互換標的ベクターの2世代

1. 制限酵素（RE）を使用して組換え互換ベクターは、ベースまたはPCRベース^24件のクローニング技術にレスキュー構築物クローン。 cDNAは終止コドンが含まれていることを確認してください。
   1. デザインのattBタグ付きプライマー^24。 GGGGストレッチ、にattB1サイト、リンカ、Kozak配列、および救助cDNAの約25ヌクレオチド（そのATGで始まる）：フォワードプライマーは、以下の要素が含まれていることを確認してください。 GGGGストレッチ、AttB2サイト、リンカ、および約25 NUC：リバースプライマーは、同様の組成を有していることを確認します救助のcDNA（逆相補体）のleotides。
   2. attB-隣接してcDNAを得るために、PCR を介して救助するcDNAを増幅します。
   3. attB-挟まれたcDNA 100ngのとカナマイシン耐性遺伝子を含む組み換え互換ドナーベクター、150ngの10-μLBP反応を行います。
   4. 熱ショックコンピテントMC1061 大腸菌 （E. coli）（工程2.3に記載のものと同様の）細菌中BP混合物の5μLを変換します。
   5. （ステップ2.4で説明したものと同様の）正しいレスキューcDNAを含むベクターを含むコロニーを同定
2. レスキューcDNAを含有するベクター100ngを用いて、10μLLR反応を行います。 Cre切除pRMCE-DV1ベクトル^11（LMBP 8195）の150 ngの。ファージにコードさインテグラーゼと切出し酵素や細菌統合宿主因子が含まれているリコンビナーゼミックス、の2μL。 25℃で2時間インキュベートします。
   注：LR反応が再結合である反応attL部位およびattR部位を含むデスティネーションベクターを含むエントリークローンをLRクロナーゼ酵素ミックスによって再結合されたイオン。これは、目的の遺伝子に隣接するattB部位を含む発現クローンになります。
3. 熱ショックコンピテントMC1061 大腸菌にLRの混合物の5μLを変換します。
   1. リブ5μLLRの混合物を追加し、熱ショックコンピテント大腸菌の40μLと、2 mLのスクリューキャップチューブスカート、氷上で20分間インキュベートします。 37°Cで5分間インキュベートします。
   2. 1 mLのルリアブロス（LB）培地を加え、37℃で1時間インキュベートします。プレートアンピシリンに50μL（アンペア;100μg/ mLの）寒天プレートを含有し、37℃で一晩増殖。
4. 正しいターゲッティングベクターを用いてコロニーを同定します。
   1. P200チップを使用してランダムに5個のコロニーを選択してください。 2を含有するガラス試験管にチップを移す - LB培地5mlを、37℃で一晩増殖。
   2. 例市販のキットを使用して細菌培養物からのプラスミドDNAを道。
   3. RE消化と配列決定を使用してそれらを検証します。 10μLの反応でREの0.2μL（20 U /μL）および対応する10×緩衝液、1μLを用いてプラスミド2μgの - 0.5を切りました。 37℃で少なくとも1時間インキュベートし、1％アガロースゲル上で分離します。 DNA断片の予測パターンを持つコロニーを選択します。
      1. サンガー配列決定を用いてTlox F（ATC ATG TCT GGA TCC CCA TC）及びIRES R（GGG GCG GAA TTC GAT ATC AAG）プライマー（5ピコモル/μL）で確認ベクトル（50 ng /μLで）を分析します。

救助の標的3. RMCE媒介MESCはR26座に構築します

1. FBSベースMESC培地中のMEF上に少なくとも二回RMCE互換KOのたmESC通路それらの文化を開始します。糊化6ウェルプレート上たmESCを分割します。
2. 翌日、1.5で、約50％の集密度で、細胞をリフレッシュFBSベースMESC培地のmL及びレスキューcDNAを含むベクターを標的のCre切除pRMCE-DV1とたmESCをトランスフェクトします。
   1. DNAミックスを作成します。純粋なDMEM培地を250μLにFLPe発現プラスミド²⁵の1ターゲッティングベクターおよび1μgを加えます。
   2. リポフェクションミックスを作成します。純粋なDMEM培地の250μLにリポフェクションベースのトランスフェクション試薬の7μL（ 例えば、リポフェクタミン2000）を追加し、室温（RT）で5分間インキュベートします。
      注：同様のRMCEターゲティング効率が他のリポフェクションベースの試薬（ 例えば、リポフェクタミンLTXとのEffectene）を用いて得ました。
   3. リポフェクションミックスとDNAミックスを混合し、室温で20分間インキュベートします。リフレッシュたmESCにトランスフェクション混合物をピペット。優しく旋回し、一晩おきます。
3. トランスフェクションの1日後、コンフルエントDR4とのMEFの層及び10mLのFBS系Mと10 cmの培養皿に6ウェルプレートから全てたmESCを分割ESC培地。
4. トランスフェクションの2日後、培地には0.2mg / mLのG418（100X）を添加することによって正しいFLPe媒介カセット交換とMESCクローンを選択します。
   注：すべてのたmESCを殺すG418の最低濃度を識別するためにG418の各バッチにKill曲線を作成します。
5. G418含有MESC培地で毎日たmESCをリフレッシュします。コロニーは7の後に表示されます - 10日なので、ステップ1.4に従ってこれらを選択して展開します。
6. PCR ¹¹ を介して正しいクローンを確認します。

胚様体におけるたmESCの分化4（EBS）

1. FBSベースMESC培地中のMEF上に少なくとも二回R26駆動型レスキュー構築物およびそれらを通過してのKOたmESCの文化を開始します。 MEFを取り除くために糊化6ウェルプレート上の通路たmESC一回。
2. PBSで洗浄し、ほぼコンフルエントMESC培養物をトリプシン処理。プレートは、非接着性、細菌グレードのペットに異なる希釈（1/20と1/40）でたmESCを解離しました分化培地中でRI-料理。
3. EBを30日間これらの皿で形成することを可能にします。 50mLのチューブにEB懸濁液を転送し、EBを重力によって沈降させ、上清を除去し、新鮮な培地を追加し、そして細菌のグレードに戻るEB懸濁液を転送：次の手順を使用して3日 - すべての2培地をリフレッシュ皿。
4. 以前¹²に記載されたプロトコルを使用して免疫蛍光および透過電子顕微鏡により標的たmESCとEBSを分析します。

結果

RMCE互換KO MESC株を単離するための手順は、図2に示されています。二つの連続交配はRMCE互換KO胚盤胞を得るために必要とされています。まず、ヘテロKOマウスはRMCE互換、ヘテロKOマウスを得ることがRMCE互換のマウスと交配されています。これらのマウスは、次いでRMCE互換3.5 DPC、ホモ接合型KO胚盤胞を得るために、他のヘテロ接合性KOマウスとの時限交配の?...

ディスカッション

私たちのMESC分離法は、ユーザーフレンドリーであり、そのような胚盤胞のマイクロサージェリーなどの高度なスキルや設備を必要としません。したがって、この技術は、科学界の大部分にアクセスできます。基本的な細胞培養の経験を持つ誰もがICMの派生物を伝播したmESCラインを確立することができます。しかし、胚盤胞の洗浄及び取り扱いはいくつかの練習が必要です。口のピペットは?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ROSALUC Mice	made in house		frozen sperm available upon request
R26-iPSC mice	made in house		frozen sperm available upon request
Vessel probe	Fine Science Tools	10160-13	to check for copulation plugs
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167	make aliquots and store at -20°C
Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps)	Fine Science Tools	11251-10	spray with 70% EtOH before use (do not autoclave)
23G needles	Fine-ject	8697
1-ml syringes	Soft-ject	6680
60-mm bacterial grade plates (for flushing)	Gosselin	BB60-01
Mouth pipette	made in house		see discussion
Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain)	ATTC	SCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae mice	The Jackson Laboratory	3208
Mitomycin C	Sigma-Aldrich	M0503
Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium	Gibco	14190-094
Tg(DR4)1Jae/J mice	JAX	3208	mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine
0.1% Gelatin	Sigma-Aldrich	G1393	Dissolve 0.5 g in 500 ml distilled water, autoclave and store at 4°C.
Trypsin (0.25%)	Gibco	25200-056
2 μM pluripotin	Cayman Chemical	10009557
pRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection	LMBP 08870	public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)
cre-excised pRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection	LMBP 08195	public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA	Addgene	20733
heat-shock competent DH5α bacteria	made in house
Gateway pDONR221 vector	Thermo Fisher	12536-017	contains kanamycin-resistance gene
BP clonase II mix	Thermo Fisher	11789-020
LR clonase II mix	Thermo Fisher	11791-020
Luria Broth (LB)
Ampicillin
Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer	Thermo Fisher	3730XL
G418	Thermo Fisher	11811-023
Lipofectamine 2000 transfection reagent	Thermo Fisher	11668027
Lipofectamine LTX transfection reagent	Thermo Fisher	15338100
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425
GATEWAY pENTR 1A vector	Thermo Fisher	A10462	recombination-compatible vector
mouse monoclonal anti-p120ctn antibody	BD Transduction Laboratories	610134
mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody	BD Transduction Laboratories	610181
General equipment:
Sterile dissection tools			fine scissors and forceps for dissecting the uterus
Sterile pipettes: 5 ml, 10 ml and 25 ml
15-ml and 50-ml conical centrifuge tubes
96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom)
Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells
Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μl)
Sterile multichannel reservoirs
Access to a laminar air flow
Access to an incubator at 37°C with 5% CO2
Access to an inverted microscope
Access to a bench-top centrifuge
Access to a stereo microscope with transmitted-light
Culture media:
MEF Medium:			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco	41965-062
10% fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-7524
L-glutamine (2 mM)	Gibco	25030-024
Sodium pyruvate  (0.4 mM)	Gibco	11360-039
penicillin (100 U/ml)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/ml)	Gibco	15140-122
SR-based mESC medium:			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
DMEM/F12	Gibco	31330-038	mixed in a 1:1 ratio
15% knock-out serum replacement (SR )	Gibco	10828–028
L-glutamine (2 mM)	Gibco	25030-024
0.1 mM non-essential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin (100 U/ml)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/ml)	Gibco	15140-122
β-mercaptoethanol (0.1 mM)	Sigma-Aldrich	M 3148
2,000 U/ml recombinant mouse LIF	(IRC/VIB Protein Service facility)
FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium):			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
Differention Medium			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	21980-032
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid	Gibco	11279-023
2 mM L-glutamine	Gibco	25030-024
0.4 mM 1-thioglycerol	Sigma-Aldrich	M-6145
50 μg/ml ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A-4544
penicillin (100 U/ml)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/ml)	Gibco	15140-122
2i
1 μM Erk inhibitor PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408
3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021	Axon Medchem	Axon 1386