Struktur-Funktions-Studien in embryonalen Maus-Stammzellen Rekombinase-vermittelten Kassettenaustausch

Zusammenfassung

Proteine ​​enthalten oft mehrere Domänen, die verschiedene zelluläre Funktionen ausüben kann. Gen-Knock-outs (KO) nicht über diese funktionelle Vielfalt berücksichtigen. Hier berichten wir über eine Rekombination vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) -basierte Struktur-Funktions-Ansatz in KO embryonalen Stammzellen, die für die molekulare Präparation von verschiedenen funktionellen Domänen oder Varianten eines Proteins ermöglicht.

Zusammenfassung

Gentechnik in Maus-Embryonen oder embryonale Stammzellen (mESCs) ermöglicht die Untersuchung der Funktion eines bestimmten Proteins. Proteine ​​sind die Arbeitspferde der Zelle und bestehen oft aus mehreren funktionellen Domänen, die durch posttranslationale Modifikationen beeinflusst werden kann. Die Verarmung des gesamten Proteins in bedingten oder konstitutiv Knock-out (KO) Mäusen nimmt nicht berücksichtigt diese funktionale Vielfalt und Regulierung. Eine MESC Linie und ein abgeleitetes Mausmodell, in dem eine Andockstelle für FLPe Rekombination vermittelten Kassettenaustausch (RMCE) innerhalb des ROSA26 (R26) Locus eingefügt wurde, wurde bereits berichtet. Hier berichten wir über eine Struktur-Funktions-Ansatz, der für die molekulare Zerlegung der verschiedenen Funktionalitäten eines Multi-Domain Protein ermöglicht. Zu diesem Zweck RMCE-kompatible Mäuse müssen mit KO-Mäusen gekreuzt werden und dann RMCE-kompatibel KO mESCs isoliert werden müssen. Als nächstes kann ein Panel von putativen rescue-Konstrukten in die R26-Locus über RMCE targeti eingeführt werdenng. Die Kandidaten rescue cDNAs kann leicht zwischen RMCE Seiten des Targeting-Vektors unter Verwendung von Rekombinations-Klonierung eingefügt werden. Als nächstes wird KO mESCs mit dem Targeting-Vektor in Kombination transfiziert mit einer FLPe Rekombinase Expressionsplasmid. RMCE reaktiviert die promotorlose Neomycin-Resistenz-Gene in den ROSA26 Andockstellen und ermöglicht die Auswahl des korrekten Targeting-Ereignisses. Auf diese Weise werden hohe Wirkungsgrad Targeting von nahezu 100% erzielt, so dass zum Einsetzen mehrerer putativen rescue Konstrukte in eine halb-hohen Durchsatz Weise. Schließlich kann eine Vielzahl von R26 getriebenen Rettungs Konstrukte auf ihre Fähigkeit getestet werden, um den Phänotyp zu retten, die in Eltern KO mESCs beobachtet wurde. Wir präsentieren eine Proof-of-Principle-Struktur-Wirkungs-Studie in p120 Catenin (p120ctn) KO mESCs mit endoderm Differenzierung in Embryoidkörpern (EVG) als phänotypische Anzeige. Dieser Ansatz ermöglicht die Identifizierung von wichtigen Domänen, putative nachgeschaltete Wege und krankheitsrelevanten PunktMutationen, die KO-Phänotypen für ein bestimmtes Protein zu Grunde liegt.

Einleitung

Es wird geschätzt, dass etwa 20.000 Säugergenomen Protein-kodierenden Gene enthalten. Alternatives Spleißen und posttranslationale Modifikationen erhöhen die Proteinrepertoires. Proteine haben einen modularen Aufbau ¹ und häufig mehrere Wechselwirkungsdomänen enthalten, die ihre Einstellung ² in verschiedene Proteinkomplexe und ihre Beteiligung an mehreren zellulären Prozesse ermöglichen. Ein Beispiel dafür ist das multifunktionale Protein namens p120ctn. p120ctn wird durch das CTNND1 Gen codiert und besteht aus einer großen zentralen Domäne Armadillo - Repeat flankiert von einem N-terminalen und C-terminalen Region. Die Armadillo-Domäne von p120ctn bindet an eine hoch konservierten Juxtamembrandomäne der klassischen Cadherine, die in Zell-Zell-Adhäsion beteiligt sind, aber es bindet auch an den Repressor Kaiso. Die N-terminale Domäne von p120ctn interagiert mit verschiedenen Kinasen, Phosphatasen, kleinen RhoGTPasen und Mikrotubuli-assoziierte proteins ^3. Interessanterweise als Ergebnis des alternativen Spleißens, p120ctn Isoformen können ⁴ aus vier alternativen Startcodons erzeugt werden. p120ctn Isoform 1A ist die längste, wie es aus dem am meisten 5' translatiert wird Startcodon und enthält die Volllängen-N-terminales Segment. In p120ctn Isoformen 3 und 4 ist dieses N-terminale Segment teilweise gelöscht und vollständig sind. die genaue Rolle von Proteinen (oder Protein-Isoformen) und die Domänen in verschiedenen zellulären Funktionen zu verstehen, bleibt eine Herausforderung.

Gen-Targeting in mESCs ermöglicht die Untersuchung der Funktion eines Proteins durch die genetische Deletion des entsprechenden Gens und hat weitgehend dazu beigetragen, die Identifizierung von entwicklungs wichtig und krankheitsrelevanten Genen und Wegen. Dieser Durchbruch in der reversen Genetik war das Ergebnis der Fortschritte in den Bereichen der MESC Isolierung und Gene aufgrund homologer Rekombination Targeting ⁵ . Homologe Rekombination ist ein Verfahren, bei der DNA-Fragmenten zwischen zwei ähnlichen oder identischen Nukleins Einheiten nach doppelsträngige (ds) DNA-Brüchen ausgetauscht werden. Normalerweise ist HR ineffizient, weil dsDNA Pausen selten sind. Seit kurzem wird die Effizienz der Homologie-directed gene targeting könnte unter Verwendung von ortsspezifischen Nucleasen erhöht ^{6, 7,} aber unglücklicherweise sind diese anfällig für Nebeneffekte ^8. Eine zuverlässigere Technik zu ermöglichen, Gen-Targeting ist RMCE, die auf ortsspezifische Rekombinationssysteme, wie Cre / loxP oder FLPe / FRT-basiert. LoxP und Frt - Sequenz werden in Bakteriophage P1 und Saccharomyces cerevisiae, bzw., und aus 34 bp, einschließlich einer asymmetrischen 8 - bp - Sequenz gefunden, die die Orientierung der Website festlegt. Auf der anderen Seite ist die Orientierung von, zum Beispiel, zwei loxP-Stellen innerhalb einer DNA-Strecke werden bestimmen, ob die floxed DNA exzidiert wird oder i⁹ nversed nach Cre-vermittelter Rekombination. Darüber hinaus kann Cre induziert auch eine Translokation, wenn zwei Standorte auf verschiedene Chromosomen befinden. RMCE nutzt artfremden Rekombinationsstellen, die nicht kreuzreagieren und das in einer genomischen Locus eingebettet sind. In Anwesenheit eines Donator - Plasmid , das ein DNA - Fragment mit den gleichen hetero Stellen flankierte enthält, fügt die Rekombinase dieses DNA - Fragment in den kompatibelen RMCE genomischen Locus durch doppelte versetzte Translokation (Abbildung 1). Hier wird nur richtig RMCE gezielte Klone können drug resistance dank eines Promotors auf dem ankommenden Vektor rendern , die ein „gefangen“ , stellt promotorlose Neomycinresistenzgen (Neo ^R) in der R26 Genom der Docking - Zellen (Abbildung 1) ^{10, 11.} Daraus ergibt sich eine sehr hohe Targeting Effizienz, oft nahe 100% ^{11 <}/ sup> ^12. Abschließend ist RMCE basierte Targeting sehr effizient und kann für Struktur-Funktionen Studien verwendet werden; Jedoch erfordert es eine vorgefertigte genomischen Locus.

Abbildung 1 : Schematische Darstellung der RMCE Vermittelte Targeting. RMCE ermöglicht den Austausch von DNA-Segmenten aus einem ankommenden Targeting-Vektor zu einem definierten genomischen Locus, wenn sowohl zwei hetero FRT-Stellen Harbor (dargestellt durch weiße und rote Dreiecke). Darüber hinaus enthält das manipulierte genomischen Locus und ein promotorloses Neomycin-Resistenz verkürztes (Neo ^R) -Gen. Durch die Bereitstellung von Wiederherstellung einen Promotor und Startcodon in dem ankommenden DNA-Fragmente, nur korrekte Rekombinationsereignisse Neomycin-Resistenz, was zu hohen Effizienzen Targeting. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version t anzuzeigenseine Figur.

Genomtechnik in mESCs ermöglicht die Erzeugung von RMCE-kompatible Mäuse. Im Jahr 1981 gelang es zwei Gruppen von pluripotenten Zellen der inneren Zellmasse (ICM) von Blastozysten in Erfassung und in Kultur ^{13, 14} aufrechtzuerhalten. mESCs der Lage ist, die Selbsterneuerung und Differenzierung in alle Arten von embryonalen und adulten Zellen, einschließlich der Keimzelllinie. Daher Gene in mESCs Targeting ermöglichen Reverse genetische Studien über die Entwicklung von konstitutiven oder bedingten KO-Mäusen (die Cre / loxP-System verwendet wird). Allerdings ist die klassische Art und Weise Maus-ES-Zellen zu isolieren, ist sehr ineffizient. Verschiedene Verbesserungen haben große stark erhöht die Erfolgsrate für die Ableitung MESC Linien, einschließlich der Verwendung eines definierten serum-Ersatz (SR) Medium ^15, im Wechsel zwischen MESC Medium SR und fötales Rinderserum (FBS) , ^16, und die Verwendung von pharmakodynamischen enthaltendlogische Verbindungen wie pluripotin oder 2i ^17. Pluripotin, ein kleines synthetisches Molekül, ermöglicht die Ausbreitung von mESCs in einem undifferenzierten Zustand in Abwesenheit von Leukämie - Hemmfaktor (LIF) und embryonalen Mausfibroblasten (MEFs) ^18. Schließlich hat es sich gezeigt , dass mESCs kann mit einem sehr hohen Wirkungsgrad ( in der Nähe von 100%) isoliert werden , wenn ein SR / FBS - Medium Wechsel - Protokoll mit LIF kombiniert und pluripotin ^{19, 20.} Diese Protokolle ermöglichen die effiziente Isolierung von RMCE-kompatibel KO mESCs, die anschließend für Struktur-Funktions-Studien verwendet werden können.

Dieses Dokument beschreibt ein Verfahren, das man die Schlüssel-Domänen oder Reste innerhalb eines Proteins zu identifizieren, ermöglicht es, die für spezifische zelluläre Prozesse verantwortlich sind. Zu diesem Zweck wird eine Pipeline von fortschrittlichen Technologien, die eine effiziente MESC Isolierung ermöglichen, Targeting-Vektor Montage und MESC Targeting war erstellend. Als solche großen Platten mit Proteinisoformen, Domain - Mutanten und Effektoren können in KO mESCs eingeführt werden können und für ihre Fähigkeit , die in - vitro - KO - Phänotyp zu retten ausgewertet werden.

Protokoll

Alle Versuche an Mäusen wurden nach institutionellen, nationalen und europäischen Tiere Vorschriften durchgeführt.

1. Isolierung von RMCE-kompatibel KO mESCs

1. Breed heterozygot KO - Mäuse mit RMCE-kompatible Mäuse, wie ROSALUC Mäuse ¹⁰ oder ROSA26-iPS - Mäuse ^21. Beide RMCE-kompatible Mäuse wurden auf einem Misch 129 / C57BL6 / Swiss Hintergrund gehalten.
   HINWEIS: Kreuzung mit heterozygot KO-Mäusen wird empfohlen, embryonale Letalität in homozygot KO-Mäusen zu überwinden.
2. Verwenden PCR heterozygot KO - Mäuse wählen ¹² eine RMCE Kassette im R26 - Locus enthält.
3. Breed RMCE-kompatibel, heterozygot KO-Mäuse mit heterozygot KO-Mäusen und isolieren RMCE-kompatibel, homozygot KO Blastozysten.
   1. Legen Sie Zeit Paarungen am Abend und prüfen für Kopulation am nächsten Morgen eingesteckt wird.
      HINWEIS: Die Stecker sind aus geronnenem Absonderungen aus den koagulierenden und vesikuläre Drüsen der männlichen gemacht.Diese Stecker füllen die Vagina des Weibchens und bleiben für 8-24 Stunden nach der Züchtung. Plugged Frauen gelten als 0,5 dpc (Tage post coitum) Embryonen zu tragen.
      1. Um Stecker zu prüfen, heben Sie das Weibchen durch die Basis ihres Schwanzes und durch ihre vaginale Öffnung für eine weißliche Masse untersuchen. Verbreitet die Lippen der Vulva leicht mit einer abgewinkelten Sonde, wenn der Stopfen nur schwer zu sehen. Separate gesteckt Frauen von ihren männlichen.
   2. Sammeln Sie Blastozysten bei 3,5 dpc.
      1. Euthanize trächtige Weibchen von den zugelassenen Verfahren (zB Genickbruch). Machen Sie einen midventral Schnitt und sezieren die Gebärmutter und Eileiter (noch aneinander befestigt) mit feinen Schere und Pinzette.
      2. Biegen, um eine 26-Gauge-Nadel in einem Winkel von 45 °. Anhänge eine 1-ml-Spritze mit M2-Medium auf diese gebogene Nadel gefüllt und es verwendet, die Blastozysten aus dem Gebärmutter in den Deckel einer 10-cm-Schale zu spülen.
         1. Führen Sie die Nadel in das Ende des Uterus, die am nächstendie Eileiter. Halten Sie die Nadel an Ort und Stelle mit einer feinen Pinzette während Schieben des Kolbens; zeigt eine erfolgreiche Spülung der Gebärmutter Schwellung.
      3. Verwenden, um eine Mundpipette (mit einem Durchmesser von 100 bis 200 um) alle Embryonen zu sammeln und waschen, sie zweimal in einem Tropfen frischen Mediums M2. Unmittelbar nach dem Waschen sie übertragen die Blastozysten zu den Kulturplatten (siehe unten).
         HINWEIS: Die Präparation und Handhabung von Blastozysten sollte in laminarer Luftströmung erfolgen.
4. Isolieren RMCE-kompatibel KO mESCs
   1. Vorbereiten einer 12-Well - Platte mit Mitomycin-C-behandelten DR4 MEFs (siehe Tabelle of Materials) einen Tag vor der Blastozyste Isolation.
      ANMERKUNG: Diese MEFs wurden isoliert aus Tg (DR4) 1Jae / J - Mäusen , die vier arzneimittel selektierbare Gene enthalten , und verleihen eine Resistenz gegen Neomycin, Puromycin, Hygromycin, und 6-Thioguanin ^22.
      1. Coat alle Kulturplatten mit 0,1% Gelatine. In 0,1% Gelatinefür 5 min bei 37 ° C in 5% CO ₂ und aspirieren die Gelatinelösung zu den Kulturplatten, inkubieren. Seed ein Viertel einer Phiole P2 MEFs in einer 12-Well - Platte und wächst sie in 2 ml MEF - Medium (siehe Tabelle 1, die Tabelle der Materialien) zu einer konfluenten Monoschicht ^19.
      2. Inaktivieren sie mit Mitomycin C (10 ug / ml) für 3 h und wäscht sie zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) ^19.
   2. Verwendung einer Mundpipette Platte, die die Blastozysten auf gelatinisierte 12-well-Platten (1 Vertiefung / Embryo), mit Mitomycin-C-behandelten MEFs in SR-ES-Zell-Medium (2 ml / Vertiefung), ergänzt mit entweder 2 uM pluripotin oder mit 2i (1 & mgr; M Inhibitor Erk PD0325901 und 3 uM GSK3-Inhibitor CHIR99021). Inkubieren bei 37 ° C in 5% CO _2.
   3. Aktualisieren Sie die SR-ES-Zellmedium (ergänzt mit pluripotin oder 2i) alle 2 - 3 Tage.
   4. Untersuchen Sie jeden Blastozyste unter einem stereomicroAnwendungsbereich bei 4,0X Vergrößerung und prüfen die Schraffur und die Befestigung an der MEF-Schicht.
      HINWEIS: Wenn Blastozysten Luke, sie verlieren die Zona pellucida, die sie kapselt. Wells mit ungebunden Blastozysten müssen das Pipettieren mit dem Mund aufgefrischt werden verwendet wird.
   5. Wählen Sie einzelne ICM Auswüchsen (ein Stereomikroskop mit) nach 10 bis 12 Tagen Kultur eine P10-Pipette mit Einwegspitzen verwenden. Übertragen, das Auswachsen in etwa 10 & mgr; l Medium zu einer V-förmigen, 96-Well-Platte, enthaltend 30 & mgr; l / Vertiefung PBS (bei Raumtemperatur).
   6. Je 50 ul 0,25% Trypsin in jede Vertiefung einer Multikanalpipette und Inkubation für 3 min bei 37 ° C in 5% CO _2.
   7. In 100 ul FBS enthaltenden MESC Medium; die ICM Auswüchse in einzelne Zellen dissoziiert von 10-15 mal pipettiert; und übertragen Sie die dissoziierten Zellen zu Mitomycin-C-behandeln 96-Well-Platten MEF, die einen Tag vorbereitet wurden, bevor die ICM Kolonien gepickt werden.
   8. Von diesem Schritt vorwärts, omi t pluripotin oder 2i vom MESC Medium. Am nächsten Tag, ändern Sie das Medium aus FBS- auf SR-haltigen MESC Medium (100 & mgr; l / Well).
   9. Erweitern Sie die etablierten MESC Linien von 96- bis 24-Well - Format ^19.
      1. Waschen Sie die Zellen mit 200 ul PBS, werden 50 & mgr; l Trypsin und Inkubation für 5 min bei 37 ° C in 5% CO 100 l FBS-basiertes MESC Mediums. dissoziieren durch Pipettieren von 10 - 15 mal unter Verwendung einer Mehrkanalpipette; und übertragen die dissoziierten Zellen zu Mitomycin-C-behandelten 24-Well-Platten MEF.
      2. Wechseln Sie auf SR-basierten Medium am nächsten Tag. Erweitern Sie die mESCs in ähnlicher Weise von 24- bis 6-Well-Format. Machen Sie 3 bis 4 Frost aus einer konfluenten 6-Well - Platte ^19.
   10. Identifizieren RMCE-kompatibel, homozygot KO mESCs unter Verwendung von PCR - Primern für die R26 - Locus ²³ und KO - Allel der Wahl (in diesem Fall p120ctn; PCRs für p120ctn null und floxed Allele wurde beschrieben , bevorlass = "xref"> 12).

Tabelle 1. Nährmedien. Alle Medien wurden bei 4 ° C gelagert und erwärmt auf 37 ° C 30 min vor der Verwendung.

2. Erzeugung eines RMCE-kompatiblen Vektor-Targeting Rekombinationsklonierung Verwendung

1. Klon , der die Rettungs Konstrukte in Rekombinations-kompatible Vektoren Restriktionsenzym (RE) -basierte oder ²⁴ Klonierungstechniken-PCR basiert. Stellen Sie sicher, dass die cDNAs ein Stop-Codon enthalten.
   1. Design AttB-markierte Primer ^24. Sicherzustellen, dass der Vorwärtsprimer enthält die folgenden Elemente: a stretch GGGG, eine Stelle attB1, ein Linker, eine Kozak-Sequenz und etwa 25 Nucleotide der cDNA rescue (beginnend mit ATG). Achten Sie darauf, dass der Reverse-Primer eine ähnliche Zusammensetzung hat: eine GGGG Strecke, eine attB2 Website, einen Linker, und etwa 25 Nukleotides von Rettungs cDNA (reverse Komplement).
   2. Amplify die Rettung cDNA über PCR AttB-flankierten cDNA zu erhalten.
   3. Durchführen einer 10-ul BP-Reaktion mit 100 ng AttB-flankierten cDNA und 150 ng der Rekombination-kompatiblen Donorvektor, der ein Kanamycin-Resistenz-Gen enthält.
   4. Transformieren 5 ul der BP in Mischungen Hitzeschock-kompetente MC1061 Escherichia coli (E. coli) Bakterien (ähnlich wie in Schritt 2.3 beschrieben).
   5. Identifizieren Kolonien mit dem korrekten rescue cDNA enthaltenden Vektoren (ähnlich wie in Schritt 2.4 beschrieben)
2. Durchführen einer 10-ul LR-Reaktion unter Verwendung von 100 ng von Rettungs- cDNA enthaltenden Vektor; 150 ng des Cre-exzidiert pRMCE DV1-Vektor ¹¹ (LMBP 8195); und 2 ul Rekombinase-Mischung, die enthält eine Phagen-codierte Integrase und Excisionase und ein bakterielles Integration Host Factor. bei 25 ° C für 2 h inkubiert.
   HINWEIS: Eine LR-Reaktion ist eine Rekombination reagierenIons in der ein Eintrag Klon attL-Stellen und einen Zielvektor, enthaltend attR-Stellen enthalten, wird durch den LR CLONASE Enzymmix rekombiniert. Dies führt zu einem Ausdruck Klon, attB-Stellen das Gen von Interesse flankieren.
3. Transformieren 5 ul der LR Mischungen in Hitzeschock-kompetenten MC1061 E. coli - Bakterien.
   1. Zugabe von 5 & mgr; l LR - Mischungen zu einem gerippten, umging, 2-ml - Schraubdeckel Rohr mit 40 ul Hitzeschock-kompetenter E. - coli - Bakterien und Inkubation für 20 min auf Eis. Inkubieren Sie für 5 min bei 37 ° C.
   2. 1 ml Luria-Brühe (LB) Medium und Inkubation für 1 h bei 37 ° C. Platte 50 & mgr; l auf Ampicillin (Amp; 100 ug / ml) enthaltenden Agarplatten wachsen und über Nacht bei 37 ° C.
4. Identifizieren Sie die Kolonien mit dem richtigen Zielvektor.
   1. Pick-5 Kolonien zufällig eine p200 Spitze verwenden. Übertragen, um die Spitze zu einem Glasteströhrchen, das 2 bis 5 ml LB-Medium wachsen und über Nacht bei 37 ° C.
   2. ExTrakt den Plasmid-DNA aus den Bakterienkulturen im Handel erhältliche Kits.
   3. Validieren RE verdaut und Sequenzierung verwendet. Geschnitten 0,5-2 ug Plasmid unter Verwendung von 0,2 & mgr; L RE (20 U / ul) und 1 ul des entsprechenden 10-fach-Puffers in einer 10-ul-Reaktion. mindestens 1 h inkubieren bei 37 ° C und getrennt auf einem 1% Agarosegel. Wählen für Kolonien, die mit dem vorhergesagten Muster von DNA-Fragmenten.
      1. Analysieren der Vektoren bestätigt (50 ng / & mgr; l) mit Tlox F (ATC ATG TCT GGA TCC CCA TC) und IRES R (GGG GCG GAA TTC GAT ATC AAG) Primer (5 pmol / & mgr; l) unter Verwendung von Sanger-Sequenzierung.

3. RMCE vermittelte MESC Rescue Targeting Konstrukten der R26 Locus

1. Starten Sie eine Kultur der RMCE-kompatibel KO mESCs und Passage sie mindestens zweimal auf MEFs in-FBS Basis MESC Medium. Teilen Sie die mESCs auf einem verkleistert 6-Well-Platte.
2. Am nächsten Tag, aktualisieren Sie die Zellen, bei etwa 50% Konfluenz, mit 1,5ml FBS-basierte MESC Medium und transfektieren die mESCs mit einem Cre-exzidiert pRMCE DV1-Targeting-Vektor rescue cDNA enthält.
   1. Machen Sie einen DNA-Mix. 1 ug Targeting - Vektor und 1 & mgr; g FLPe-Expressionsplasmid ²⁵ bis 250 & mgr; l reinen DMEM - Medium.
   2. Machen Sie eine Lipofektion Mix. ADD 7 uL Lipofektion basierte Transfektionsreagenz (zB Lipofectamine 2000) zu 250 & mgr; l reinem DMEM - Medium , und Inkubation für 5 min bei Raumtemperatur (RT).
      Hinweis: ähnliche RMCE Targeting - Effizienz wurden mit anderen Lipofektion Basis erhalten Reagenzien (zB Lipofectamin LTX und Effectene).
   3. Mischen Sie das DNA-Gemisch mit der Lipofektion Mischung und Inkubation für 20 min bei RT. Pipette, um die Transfektion Mischung auf die aufgefrischt mESCs. Vorsichtig schwenken und lassen Sie über Nacht.
3. Ein Tag nach der Transfektion aufgeteilt alle mESCs aus der 6-Well-Platte auf eine 10-cm-Kulturschale mit einer konfluenten Schicht von DR4 MEFs und 10 ml FBS-basiertem mESC Medium.
4. Zwei Tage nach der Transfektion auszuwählen MESC Klont mit dem korrekten FLPe-vermittelten Kassettenaustausch durch Zugabe von 0,2 mg / ml G418 (100-fach) auf das Medium.
   HINWEIS: Stellen Sie eine Kill-Kurve für jede Charge von G418 die niedrigste Konzentration von G418 zu identifizieren, die alle mESCs töten.
5. Aktualisieren Sie die mESCs täglich mit G418-haltigem MESC Medium. 10 Tage, so dass diese auswählen und erweitern gemäß Schritt 1.4 - Kolonien sollen nach 7 erscheinen.
6. Bestätigen Sie die richtige Klone mittels PCR ^11.

4. Differenzierung von mESCs in Embryoid Bodies (EBs)

1. Starten Sie eine Kultur der KO mESCs mit R26 getriebenen Rettungs Konstrukte und Passage sie mindestens zweimal auf MEFs in-FBS Basis MESC Medium. Passage die mESCs einmal auf verkleistert 6-Well-Platten erhalten der MEFs befreien.
2. Waschen mit PBS und trypsinize die fast-konfluenten MESC Kulturen. Platte dissoziiert mESCs in verschiedenen Verdünnungen (1/20 und 1/40) auf nicht-adhärenten, bakteriell-grade petri-Gerichte in Differenzierungsmedium.
3. Lassen Sie EBs in diese Gerichte für 30 Tage zu bilden. Aktualisieren Sie das Medium alle 2 - 3 Tage nach dem folgende Verfahren: Übertragung der EB Suspension auf ein 50-ml-Röhrchen, lassen Sie die EBs durch die Schwerkraft, Entfernen des Überstandes, fügen Sie frisches Medium, und übertragen Sie die EB Suspension zurück zu einer bakteriellen Qualität Gericht.
4. Analysiert die gezielten mESCs und EBs durch Immunofluoreszenz und Transmissionselektronenmikroskopie unter Verwendung von Protokollen , die zuvor ¹² beschrieben wurden.

Ergebnisse

Das Verfahren RMCE-kompatiblen KO MESC Linien zu isolieren , ist in Abbildung 2 dargestellt. Zwei aufeinanderfolgende Züchtungen sind erforderlich RMCE-kompatibel KO Blastozysten zu erhalten. Zunächst werden heterozygot KO-Mäuse mit RMCE-kompatibelen Mäusen gekreuzt RMCE-kompatibel, heterozygot KO-Mäuse zu erhalten. Diese Mäuse werden dann für zeitlich Paarungen mit anderen heterozygot KO-Mäusen verwendet, zu erhalten, 3,5-dpc, RMCE-kompatibel, homozygot KO Blast...

Diskussion

Unsere MESC Isolationsmethode ist benutzerfreundlich und erfordert keine fortgeschrittenen Fähigkeiten oder Ausrüstung, wie Mikrochirurgie von Blastozysten. Somit ist diese Technologie zu einem großen Teil der wissenschaftlichen Gemeinschaft zugänglich. Jeder, der Grundzellkultur Erfahrung kann ICM Auswüchse propagieren und mESCs Linien etablieren. Allerdings erfordert die Spülung und die Handhabung von Blastozysten etwas Übung. Ein Mundpipette wird verwendet Blastozysten zu übertragen und besteht aus einer Mikr...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ROSALUC Mice	made in house		frozen sperm available upon request
R26-iPSC mice	made in house		frozen sperm available upon request
Vessel probe	Fine Science Tools	10160-13	to check for copulation plugs
M2 medium	Sigma-Aldrich	M7167	make aliquots and store at -20°C
Fine forceps (Dumont #5 Standard tip Student forceps)	Fine Science Tools	11251-10	spray with 70% EtOH before use (do not autoclave)
23G needles	Fine-ject	8697
1-ml syringes	Soft-ject	6680
60-mm bacterial grade plates (for flushing)	Gosselin	BB60-01
Mouth pipette	made in house		see discussion
Mouse embryonic fibroblasts (MEFs, TgN (DR4)1 Jae strain)	ATTC	SCRC-1045
TgN (DR4)1 Jae mice	The Jackson Laboratory	3208
Mitomycin C	Sigma-Aldrich	M0503
Phosphate buffered saline (PBS) without calcium or magnesium	Gibco	14190-094
Tg(DR4)1Jae/J mice	JAX	3208	mice that contain four drug-selectable genes and DR4 MEFS confers resistance to neomycin, puromycin, hygromycin and 6-thioguanine
0.1% Gelatin	Sigma-Aldrich	G1393	Dissolve 0.5 g in 500 ml distilled water, autoclave and store at 4°C.
Trypsin (0.25%)	Gibco	25200-056
2 μM pluripotin	Cayman Chemical	10009557
pRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection	LMBP 08870	public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)
cre-excised pRMCE-DV1	BCCM/LMBP collection	LMBP 08195	public available from the BCCM/LMBP collection (http://bccm.belspo.be)
pCAG-FlpE-IRES-Puro-pA	Addgene	20733
heat-shock competent DH5α bacteria	made in house
Gateway pDONR221 vector	Thermo Fisher	12536-017	contains kanamycin-resistance gene
BP clonase II mix	Thermo Fisher	11789-020
LR clonase II mix	Thermo Fisher	11791-020
Luria Broth (LB)
Ampicillin
Applied Biosystems 3730XL DNA Analyzer	Thermo Fisher	3730XL
G418	Thermo Fisher	11811-023
Lipofectamine 2000 transfection reagent	Thermo Fisher	11668027
Lipofectamine LTX transfection reagent	Thermo Fisher	15338100
Effectene transfection reagent	Qiagen	301425
GATEWAY pENTR 1A vector	Thermo Fisher	A10462	recombination-compatible vector
mouse monoclonal anti-p120ctn antibody	BD Transduction Laboratories	610134
mouse monoclonal anti-Ecadherin antibody	BD Transduction Laboratories	610181
General equipment:
Sterile dissection tools			fine scissors and forceps for dissecting the uterus
Sterile pipettes: 5 ml, 10 ml and 25 ml
15-ml and 50-ml conical centrifuge tubes
96-well culture plates V-shaped bottom and flat bottom)
Culture dishes: 24 wells, 12 wells and 6 wells
Multichannel pipettes (to pipette 30, 50, 100 and 200 μl)
Sterile multichannel reservoirs
Access to a laminar air flow
Access to an incubator at 37°C with 5% CO2
Access to an inverted microscope
Access to a bench-top centrifuge
Access to a stereo microscope with transmitted-light
Culture media:
MEF Medium:			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)	Gibco	41965-062
10% fetal bovine serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F-7524
L-glutamine (2 mM)	Gibco	25030-024
Sodium pyruvate  (0.4 mM)	Gibco	11360-039
penicillin (100 U/ml)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/ml)	Gibco	15140-122
SR-based mESC medium:			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
DMEM/F12	Gibco	31330-038	mixed in a 1:1 ratio
15% knock-out serum replacement (SR )	Gibco	10828–028
L-glutamine (2 mM)	Gibco	25030-024
0.1 mM non-essential amino acids	Gibco	11140-050
penicillin (100 U/ml)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/ml)	Gibco	15140-122
β-mercaptoethanol (0.1 mM)	Sigma-Aldrich	M 3148
2,000 U/ml recombinant mouse LIF	(IRC/VIB Protein Service facility)
FBS-based mESC medium (similar to SR-based mESC medium):			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Knockout DMEM	Gibco	10829-018
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
Differention Medium			stored at 4°C; warm 30 min at 37°C before use
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Gibco	21980-032
15% FBS	Hyclone	SH30070.03E
5% CD Hybridoma Medium(1x) liquid	Gibco	11279-023
2 mM L-glutamine	Gibco	25030-024
0.4 mM 1-thioglycerol	Sigma-Aldrich	M-6145
50 μg/ml ascorbic acid	Sigma-Aldrich	A-4544
penicillin (100 U/ml)	Gibco	15140-122
streptomycin (100 µg/ml)	Gibco	15140-122
2i
1 μM Erk inhibitor PD0325901	Axon Medchem	Axon 1408
3 μM Gsk3 inhibitor CHIR99021	Axon Medchem	Axon 1386