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要約

このプロトコルを記述する F1の浄化-atp アーゼトリパノソーマの培養昆虫ステージから。手順により、高純度、均一な、アクティブな複合体の構造と酵素の研究に最適です。

要約

F1-atp アーゼは F 型 ATP 合成酵素、アデノシン三リン酸 (ATP) を生成する生物膜を渡るプロトン動機力を使用する酵素膜外因性触媒 subcomplex。そのまま F1の分離-ネイティブ ソースから atp アーゼは酵素のタンパク質組成、速度論的パラメーター、および阻害剤への感受性を特徴付けるための必須の前提条件です。高純度、均一の F1-atp アーゼは構造研究、ATP 合成と加水分解の分子メカニズムに洞察力を提供する使用ことができます。この資料は、F1の浄化のための手順を説明します-トリパノソーマ、アフリカ trypanosomiases の病原 ATPase。F1-atp アーゼは体外で培養した培養 trypanosomes から低張性溶解して得られるミトコンドリアの小胞から分離。小胞は超音波と F1により機械的に断片化されます-atp アーゼはクロロホルム抽出法によるミトコンドリア内膜から解放されます。酵素複合体は連続陰イオン交換とサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに純化されます。高感度質量分析技術を示した浄化された複雑な事実上すべての蛋白質の汚染物を欠いているし、したがって、x 線結晶構造解析や電子顕微鏡による構造決定のための適した材料を表します。孤立した F1-ATPase は、ATP の加水分解活性は、アジ化ナトリウム、F 型 ATP 合成酵素の強力な阻害剤で完全に抑制することができますを展示します。精製した複合体は、室温で少なくとも 3 日間安定性とアクティブを維持します。アンモニウムの硫酸塩の沈殿物は、長期保存のために使用されます。同じようなプロシージャは、F1の浄化のために使用されている型 Atpase 細菌や酵母、哺乳類と植物組織から。したがって、提案するプロトコルは、F1のためのガイドラインとして使用できる-他の生物からの atp アーゼの隔離。

概要

F 型 ATP 合成酵素は膜結合型細菌、ミトコンドリア、葉緑体の ATP の形成と膜をエネルギー伝達を渡るカップル プロトン透過経路が多蛋白質複合体を回転させます。ATP 合成の回転機構の分子の詳細は、精製された細菌やミトコンドリア ATP 合成酵素とその subcomplexes1の構造の研究のために主に知られています。F 型 ATP 合成酵素は膜組み込みと膜外因性基に編成されます。F1として知られている膜外因性部-atp アーゼ、ATP または逆の反応にアデノシン二リン酸 (ADP) のリン酸化が発生する 3 つの触媒部位が含まれています。F1-膜固有の部位から実験的 atp アーゼがリリースされる加水分解、しかしない、ATP を合成する能力を維持しながらことができます。Foと呼ばれる膜結合型部門は、酵素の中央部分の回転を駆動するタンパク質輸送を仲介します。F1と Foセクターは、中枢および末梢の茎によって接続されます。

1F を浄化するために、最初の試み-ATPase 出芽酵母とウシ心筋ミトコンドリア日付 1960 年代に戻る。これらのプロトコルが使用される抽出アンモニウムまたはプロタミン硫酸塩沈殿物、続いてオプション クロマトグラフィー ステップと熱処理2,3,4 分画の超音波によって中断されたミトコンドリア ,5,6。浄化は大幅改善、F1を容易に解放するクロロホルムの使用で簡素化-ミトコンドリア膜 ATPase の断片7。クロロホルム抽出、F1の抽出に使用された様々 な動物、植物、細菌の源 (例えばラット肝8トウモロコシ9アルムのニンジン10、および大腸菌大腸菌型 Atpase 11)。さらにクロロホルム リリース F1の精製-atp アーゼ アフィニティまたはサイズ排除クロマトグラフィー (SEC) で得られた x 線結晶構造解析による高分解能構造解析に適していた、非常に純粋なタンパク質複合体、として1F の構造によって文書化-ウシ心筋12,13と酵母14ATPase。F1-atp アーゼ構造も耕しにくい生物から決定した、したがって、最初の生物学的材料の量は限られていた。この場合は、F1-atp アーゼのサブユニットが人工的に表現し、エシェリヒア属大腸菌、複雑に組み立てし、全く異種酵素の親和性クロマトグラフィー経由でタグ サブユニットを精製しました。このようなアプローチは、F1の決定につながった-2 好熱性細菌種や株中等度好熱15 Caldalkalibacillus thermarum16,からの atp アーゼの構造17です。 ただし、この方法は適していませんむしろ真核生物の F1型 Atpase それは原核生物 protheosynthetic 装置、翻訳処理、および複雑なアセンブリに依存しているので。

クロロホルムを用いた抽出 F1を分離に使用していた型 Atpase 単細胞ミナミハタンポ寄生虫cruzi18とt. グリコシルホスファチジルイノシトール19アメリカを引き起こす重要な哺乳類の病原体から、アフリカの trypanosomiases、それぞれ、およびイネ昆虫寄生虫クリシジアファシクラータ20から。これらの浄化は、F1の簡単な説明だけに主導型 Atpase、組成、構造、および複合体の酵素学的性質を完全に特徴づける下流のアプリケーションが使われていませんので。F1の最適化方法について説明します- t. 血の培養昆虫のライフ サイクル段階から atp アーゼ浄化。メソッドは、ウシおよび酵母 F1型 Atpase21,22の隔離のための確立したプロトコルに基づいて開発です。プロシージャには、高純度、均一酵素体外酵素と阻害アッセイ、適した質量23、および構造決定24によって詳細なプロテオーム解析が得られます。浄化のプロトコルと F1の知識-atp アーゼ構造の原子レベルが低分子阻害剤を識別し、アフリカの trypanosomiases の新薬の開発を支援する画面をデザインする可能性を開きます。さらに、プロトコルが F1を浄化するために合わせることができる-他の生物から atp アーゼ。

プロトコル

1. バッファーとソリューション

  1. 次に挙げたソリューションを準備します。液体クロマトグラフィーのすべてのバッファーをドガします。ちょうど使用する前に ADP、benzamidine、およびプロテアーゼ阻害剤を追加します。
    1. アミノカプロン酸 (ACA)、およびプロテアーゼ阻害剤 (10 μ M amastatin 50 μ M bestatin 50 μ M ペプスタチン、50 μ M leupeptin、50 μ M diprotin A) 塩酸 (トリス-HCl) ph 値 8.0 0.25 M ショ糖 5 mM 5 mM benzamidine のバッファー a: 50 mM Tris バッファーを準備します。
    2. バッファー b: 50 mM トリス塩酸 pH 8.0、0.25 M ショ糖、4 mM エチレンジアミン四酢酸 (EDTA)、benzamidine 5 mM、5 mM、ACA 1 mM ADP、およびプロテアーゼ阻害剤 (10 μ M amastatin 50 μ M bestatin 50 μ M ペプスタチン、50 μ M leupeptin、50 μ M diprotin A) を準備します。
    3. Q 列バッファーの準備: 1 mM ADP、ACA、5 mM 5 mM benzamidine 10 mM MgSO420 mM トリス塩酸 pH 8.0、4 mM EDTA。
    4. Q カラム溶出バッファーを準備: 1 M NaCl を Q 列バッファー。
    5. 秒のバッファーを準備: 20 mM トリス塩酸 pH 8.0、10 mM MgSO4, 100 mM の NaCl、1 mM ADP。
    6. クロロホルム飽和 2 M トリス-HCl pH 8.5 を準備します。クロロホルムをミックス 2 M トリス-HCl pH 8.5 スクリュー キャップ ボトルで約 1:1 の比率で、振る、有機および水様段階別を聞かせてし、pH 指示薬紙のストリップと上方の水層の pH を測定します。常温で保存します。使用の直前にもう一度シェイクさせ別のフェーズ。下層のクロロホルムを使用します。
      注意: クロロホルムは揮発性と眼や皮膚に刺激を与えるです。発煙のフードで働いてください。振るときは、安全眼鏡を使用します。

2. サブ ミトコンドリア粒子の調製

  1. 低張性換散25 1 x 1011から 5 mL の氷冷バッファー A. 維持手順 3.2 まで冷蔵して、サンプルの procyclic t. グリコシルホスファチジルイノシトールの 2 x 10 の11セルによって分離ミトコンドリアの小胞 (mitoplasts) を再懸濁します。
  2. ビシンコニン酸 (BCA) 蛋白質の試金26製造元の指示に従って、懸濁液のタンパク質濃度を決定します。
    1. 純水ウシ血清アルブミン (BSA) の希釈系列を使用して、標準曲線を作成します。少量の 20-100 倍超純水 BSA の範囲の基準に適合する試料を希釈します。
    2. サンプルの総蛋白量を計算し、追加のバッファー A. で薄めて 16 mg/mL に蛋白質の集中をもたらす
  3. 7 懸濁液の超音波処理によって逆小胞と膜部分に mitoplasts をフラグメント 15 x 直径 3.9 mm、陰極とインパルスあたり 70 〜 100 J の総エネルギーと s。超音波ホモジナイザーでエネルギー出力が表示されない場合は、最大電力の 50% での最適化を開始します。30 の氷のサンプルをインキュベート衝動間 s。超音波処理後、懸濁液に少し暗くなります。
  4. 16 時間 54,000 × g、4 ° C で 5 時間 98,000 x g の遠心によるフラグメントの膜堆積物上清をデカントしクロロホルム抽出を続行またはフラッシュ凍結沈殿物を液体窒素で、-80 ° C で保存

3 F1のリリース-クロロホルムによる膜 ATPase

  1. 小さな Dounce ホモジナイザーを用いてバッファー B にミトコンドリア膜のペレットを再懸濁します。バッファー B のボリュームに基づいてバッファーの合計使用手順 2.1 と 2.2 を使用して、次の数式で計算: ボリューム (バッファー B) x 12/21 ボリューム (バッファー A) を =。懸濁液を 15 または 50 mL の円錐管に転送します。
  2. 氷からサンプルを削除し、さあ今からサンプルと室温で使用するすべてのソリューションを維持します。
  3. クロロホルム飽和 2 M トリス-HCl pH 8.5; を追加します。懸濁液の半分の量を追加するクロロホルムのボリュームに相当します。キャップをしめてください。丁度 20 のため精力的にそれを振る s. はすぐに部屋の温度で 5 分間の 8,400 x g でそれを遠心分離します。
  4. 1.6 mL マイクロ チューブに上部曇り水相を転送します。プロテアーゼ阻害剤 (10 μ M amastatin、50 μ M の bestatin、50 μ M ペプスタチン、50 μ M leupeptin、50 μ M diprotin A) クロロホルム処理により除去阻害剤を交換するを追加します。室温で 30 分間 13,000 x gでサンプルを遠心します。新鮮なチューブに上清を転送し、不溶性物質を削除する遠心分離を繰り返します。

4 陰イオン交換クロマトグラフィー

  1. 吸光度 280 まで 5 mL/min の流速で Q 列のバッファーを持つ高速蛋白質液体クロマトグラフィー システムに接続されている 5 mL 陰イオン交換 (Q) コラムを平衡させ nm と導電率 (約 50 mL のバッファー) を安定させます。
  2. ステップ 3.3 吸光度まで待機を 1 mL/分の流量で釣合い列に 280 から上澄みを読み込む nm がバック グラウンドで安定します。Q カラム溶出のバッファーを 0% から 100% 収集の 1 mL の一部分を 0.5 mL/分の流量での 25 mL 線形グラデーションを適用します。
  3. PH 8.0 でプルマン atpase 活性アッセイ2 ATP 加水分解活性の主要な溶出ピークに対応する個々 の分数の試金します。反応混合物の 1 mL あたり各画分の 10 μ L を使用します。ATPase 活性を示す画分をプールします。必要に応じて、ナトリウム ドデシルりん酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (SDS-PAGE) の各分画の 10 μ L を分離し、個々 の F1を視覚化するブルーでゲルを染色-atp アーゼ サブユニットと汚染蛋白質。
  4. 集中スピン列を用いた 200-500 μ L に 100,000 MWCO PES フィルター膜限外濾過法によるプールのサンプルは秒または室温で一晩サンプル ストアに進みます。

5. サイズ排除クロマトグラフィー

  1. 0.5 mL/min の流速で秒バッファーの少なくとも 48 ml (2 列ボリューム) 液体クロマトグラフィー システムに接続されている秒コラムを平衡させ。
  2. 列にサンプルを適用し、収集 0.25 mL 分数 0.25 mL/分の流量でクロマトグラフィーを実行します。
  3. SDS-PAGE の紫外280 nm吸光度トレースのピークに対応し、ブルーで、それらを染色した分数の 10 μ L を実行します。最初の主要なピークを含む F1-atp アーゼ。プルマン分子アッセイによって ATP 加水分解活性とアジ化感度のピークに対応する分数の試金します。BCA アッセイによってタンパク質濃度を決定します。
  4. 精製 F1を維持-常温 ATPase 下流用浄化後 3 d でそれを使用しています。また、> 1.5 mg/mL、沈殿物飽和硫酸アンモニウムを混合することによってそれを pH 8.0 (ボリューム x 1.2) に調整する 100,000 MWCO PES フィルターを回転カラムを使用するサンプルを集中し、4 ° C で保存

結果

典型的な精製 (図 1) から始まるミトコンドリア小胞 (mitoplasts) 2 x 1011 procyclic に hypotonically 分離 1 x 1011からパーコールに分離された標準で培養したt. グリコシルホスファチジルイノシトールセル25グルコースが豊富な SDM 79 中27。スピン、超音波によって、mitoplasts が断片化しているし、行?...

ディスカッション

F1のプロトコル- t. グリコシルホスファチジルイノシトールからの atp アーゼの浄化は、F1の分離に基づいて以前に発行された法を開発した-他種13,14ATPase 複合体。遺伝的変更がメソッドに必要ない (例えば、タグ付け) と存在のすべてのサブユニットとの完全にアクティブな複合体が得られます。重要なステップは、F...

開示事項

著者が明らかに何もありません。

謝辞

教育省 ERC CZ によって資金が供給されたこの仕事 LL1205、18-17529S、チェコ共和国の助成機関補助金を付与し、ERDF/ESF プロジェクト (号の寄生虫の病原性と病原性の研究センターCZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759)。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)ApplichemA0948
Amastatin HydrochlorideGlantham Life SciencesGA1330
Aminocaproic AcidApplichemA2266
BCA Protein Assay KitThermoFischer Scientific/Pierce23225
Benzamidine HydrochlorideCalbiochem199001
Bestatin HydrochlorideSigma Aldrich/MerckB8385
ChloroformAny supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-freeRoche4693159001Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)Any supplier
Hydrochloric AcidAny supplierFor pH adjustment
Ile-Pro-IleSigma Aldrich/MerckI9759Alias Diprotin A
LeupeptinSigma Aldrich/MerckL2884
Magnesium Sulfate HeptahydrateAny supplier
Pepstatin ASigma Aldrich/MerckP5318
Protein Electrophoresis SystemAny supplier
Sodium ChlorideAny supplier
SucroseAny supplier
TrisAny supplier
NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, PolyallomerBeckman Coulture328874
DounceTissues Homogenizer 2 mLAny supplier
Glass Vacuum Filtration DeviceSartorius516-7017Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mLGE Healthcare Life Sciences17115401Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mmSartorius18406--47------NDegasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences29091596Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PESSartoriusVS0641
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
AKTA Pure 25GE Healthcare Life Sciences29018224Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601ShimadzuOr similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti RotorBeckman CoultureOr similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000BioLogics0-127-0001Or similar ultrasonic homogenizer

参考文献

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143 F1 atp ATP F atp

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