F1의 절연-ATPase 기생 원생 생물 Trypanosoma brucei 에서

요약

이 프로토콜 설명 F₁의 정화- Trypanosoma brucei의 교양된 곤충 단계에서 ATPase. 프로시저 생성 매우 순수한, 균질, 고 활성 복잡 한 구조상과 효소 연구에 적합 합니다.

초록

F₁-ATPase는 F 형 ATP synthase, 생물 막에 걸쳐 양성자 동기 힘을 사용 하 여 아데노신 3 인산 염 (ATP)를 생산 하는 효소의 막 외부 촉매 subcomplex. 그대로 F₁의 절연-ATPase는 네이티브 소스에서 효소의 단백질 구성, 운동, 변수와 감도 억제제를 특성화 하는 필수적인 전제 조건입니다. 매우 순수 하 고 균질 F₁-ATPase는 ATP 합성과 가수분해의 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공 하는 구조 연구에 사용할 수 있습니다. 이 문서에서는 설명 합니다 F₁의 정화에 대 한 절차- Trypanosoma brucei, 아프리카 trypanosomiases의 원인이 되는 대리인에서에서 ATPase. F₁-ATPase는 침투성 세포에 생체 외에서 배양 trypanosomes에서 여는 미토 콘 드 리아 vesicles에서 격리 됩니다. 소포는 기계적으로 쥡니다와 F₁에 의해 조각-ATPase는 클로 프롬 적 출에 의해 내부 미토 콘 드 리아 멤브레인에서 발표. 효소 복합물은 추가 연속 음이온 교환 및 크기 배제 크로마토그래피에 의해 정화 된다. 중요 한 질량 분석 기술을 보여주었다는 순화 된 복잡 한 거의 모든 단백질 오염 물질 없는 이며, 따라서, 엑스레이 결정학 또는 cryo 전자 현미경 검사 법에 의해 구조 결심을 위한 적당 한 물자를 나타냅니다. 격리 된 F₁-ATPase 전시 ATP 가수분해 활동, 나트륨 아 지 드, F 형 ATP synthases의 강력한 억제제에 의해 완전히 저해 될 수 있습니다. 순화 된 복잡 한 실내 온도에 적어도 3 일에 대 한 안정적이 고 활성 남아 있습니다. 황산 암모늄에 의해 강 수는 장기 저장을 위해 사용 됩니다. 유사한 절차는 F₁의 정화 사용 되었습니다-ATPases 포유류 및 식물 조직, 효 모, 또는 박테리아. 따라서, 제시 프로토콜 F₁에 대 한 지침으로 사용할 수 있습니다-다른 유기 체에서 ATPase 격리.

서문

F 타입 ATP synthases는 막 도약 ATP 형성 박테리아와 미토 콘 드리 아, 엽록체의 에너지 시험 막 걸쳐 multiprotein 단지 그 몇 양성자 전 좌를 회전. ATP 합성의 회전 메커니즘의 분자 세부 정화 박테리아와 미토 콘 드리 아 ATP synthases 및 그들의 subcomplexes¹의 구조 연구 때문에 주로 알려져 있습니다. F 형 ATP synthase 막 내장 고 막 외부 moieties로 구성 됩니다. F₁막 외부 부분-ATPase, 포함 ATP 또는 역방향 반응은 아데노신 diphosphate (ADP)의 인 산화 발생 3 촉매 사이트. F₁-ATPase 공개 될 수 있는 실험적으로 막 내장 moiety에서은, 하지만 하지, ATP를 합성 하는 기능을 유지 하면서. F_o, 라고 막 도약 분야 중재 단백질 전 좌, 효소의 중앙 부분의 회전 드라이브. F₁ 과 F_o 분야 중앙과 주변 줄기로 연결 된다.

첫 번째는 F₁을 정화 하려고-1960 년대에 다시 싹 트는 효 모 및 소 심장 미토 콘 드리 아에서 ATPase. 이러한 프로토콜 사용 추출 쥡니다, 암모늄 또는 protamine 황산 염 강 수, 옵션 크로마토그래피 단계 및 열 처리^{2,3,4로 분류 한에 의해 중단 되었다 미토 콘 드리 아 ,,56}. 정화는 크게 개선 하 고 클로 프롬, F₁를 쉽게 해제 사용 하 여 단순화-미토 콘 드 리아 멤브레인에서 ATPase 조각⁷. 클로 프롬 추출 했다 다음 F₁을 추출 하는 데 사용 됩니다-ATPases 다양 한 동물, 식물 및 세균성 원본 (예를 들어, 쥐 간⁸, 옥수수⁹, 식물 maculatum¹⁰및 병원 성 대장균 ¹¹). 더 클로 프롬 발표 F₁의 정화-ATPase 선호도 또는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)에 의해 굴복 했다 엑스레이 결정학에 의해 고해상도 구조 결정을 위해 적당 한, 매우 순수한 단백질 복잡 한로 F₁의 구조에 의해 문서화-소 심장^12,13 를 Saccharomyces cerevisiae¹⁴ATPase. F₁-ATPase 구조 또한 육성 하기 어려운 유기 체에서 결정 하 고, 따라서, 초기 생물 학적 물질의 양을 제한 했다. 이 경우에는 F₁에서-ATPase subunits 인위적으로 표현 되었고, 대장균에 복잡 한에 조립 및 전체 분리 효소 태그 소 단위 친화성 크로마토그래피 를 통해 에 의해 순화 되었다. 이러한 접근 방식은 F₁의 결정을 주도-ATPase 구조 두 thermophilic 박테리아 종, Geobacillus stearothermophilus¹⁵ Caldalkalibacillus thermarum^16, 에서 ^{그러나 17}.,이 방법론은 오히려 진 핵 F₁에 적합 하지 않습니다-ATPases 이후 간결한 protheosynthetic 장치, posttranslational 처리 및 복잡 한 어셈블리에 의존.

클로 프롬 기반 추출은 이전 F₁을 분리 하는 데 사용 됩니다-ATPases 단 세포 digenetic 기생충 Trypanosoma cruzi¹⁸ 와 토니 brucei¹⁹, 미국인을 일으키는 중요 한 포유류 병원 균 및 아프리카 trypanosomiases, 각각, 그리고 monogenic 곤충 기생충 Crithidia fasciculata²⁰에서. 이 담긴 F₁의 간단한 설명만 이끌어-ATPases, 다운스트림 응용 프로그램 완전히 구성, 구조, 및 복합물의 효소 속성을 특성화 하는 데 사용 했다. 이 문서에서는 설명 합니다 F₁에 대 한 최적화 된 방법- 토니 brucei의 교양된 곤충 라이프 사이클 단계에서 ATPase 정화. 메서드는 소 및 효 모 F₁-ATPases^21,22의 격리에 대 한 설립된 프로토콜에 따라 개발 된다. 절차는 매우 순수 하 고 동종 효소 적합 체 외에서 효소 그리고 금지 분석 실험, 질량 분석²³, 및 구조 결정²⁴상세한 proteomic 특성화를 생성합니다. F₁의 지식과 정화 프로토콜-ATPase 구조 원자 수준에서 화면 작은 분자 억제제, 식별 하 고 아프리카 trypanosomiases에 대 한 새로운 약물의 개발에 도움을 설계 하는 가능성을 엽니다. 또한, 프로토콜 정화 F₁을 적용할 수 있습니다-다른 유기 체에서 ATPase.

프로토콜

1. 버퍼 및 솔루션

1. 아래에 나열 된 솔루션을 준비 합니다. 액체 크로마토그래피에 대 한 모든 버퍼 드 그냥 사용 하기 전에 ADP, benzamidine, 및 프로 테아 제 억제제를 추가 합니다.
   1. Aminocaproic 산 (ACA), 그리고 프로 테아 제 억제제 (10 µ M amastatin, 50 µ M bestatin, 50 µ M pepstatin, 50 µ M leupeptin, 및 50 µ M diprotin A) 염 산 (Tris HCl) ph 8.0, 0.25 M 자당 5 m m benzamidine, 5mm 버퍼 a: 50 mM Tris 버퍼를 준비 합니다.
   2. 버퍼 b: 50 mM Tris HCl pH 8.0, 0.25 M 자당, 4 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 5mm benzamidine, 5mm ACA, 1mm ADP, 및 프로 테아 제 억제제 (10 µ M amastatin, 50 µ M bestatin, 50 µ M pepstatin, 50 µ M leupeptin, 및 50 µ M diprotin A)를 준비 합니다.
   3. Q 열 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl pH 8.0, 4 mM EDTA, 10mm MgSO₄, 5 mM benzamidine, 5mm ACA, 및 1mm ADP.
   4. Q 열 차입 버퍼 준비: 1 M NaCl와 Q-열 버퍼.
   5. 초 버퍼 준비: 20 mM Tris HCl pH 8.0, 10mm MgSO₄, 100 m m NaCl, 1 mM ADP.
   6. 클로 프롬 2 M Tris HCl ph 8.5 포화를 준비 합니다. 클로 프롬을 믹스 2 M Tris HCl ph 8.5 스크류 캡 병에 약 1:1 비율에서, 흔들, 유기와 수성 단계 분리 시키고 pH 지시자 종이 스트립 위 수성 층에서 pH를 측정. 실내 온도에 상점. 그냥 사용 하기 전에, 다시 동요 하 고 별도 단계를 보자. 낮은 클로 프롬 레이어를 사용 합니다.
      주의: 클로 프롬은 휘발성과 눈과 피부에 자극. 증기 두건에서 작동 합니다. 안전 안경 흔들어 사용 합니다.

2입니다. 하위 미토 콘 드리 아 입자의 준비

1. 침투성 세포²⁵ 에서 1 x 10¹¹ procyclic T. brucei 얼음 버퍼 A. 유지 샘플 단계 3.2까지 냉장의 5 ml의 2 x 10¹¹ 셀에 의해 고립 된 미토 콘 드리 아 소포 (mitoplasts) resuspend
2. Bicinchoninic 산 (BCA) 단백질 분석 결과²⁶ 제조업체의 지침에 따라에 의해 정지에 단백질 농도 결정 합니다.
   1. 초순에 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 희석 시리즈를 사용 하 여 표준 곡선을 건설 하기 위하여. 적은 양의 샘플 BSA의 범위는 표준에 맞게 초순 물으로 20-100 배 희석.
   2. 샘플에서 총 단백질 양을 계산 하 고 추가 버퍼 A. 그것을 diluting 하 여 16 mg/ml 단백질 농도가지고
3. 서 스 펜 션 7의 쥡니다 여 mitoplasts 거꾸로 소포 막 조각으로 조각 15 x 3.9 m m의 직경을 가진 70 ~ 100 J는 microtip와 충 동 당의 총 에너지와 s. 초음파 균질 화기는 에너지 출력을 표시 하지 않으면, 최대 전력의 50%에서 최적화를 시작 합니다. 30 대 한 얼음 샘플을 품 어 충 동 사이 s. 쥡니다, 후 정지가 된다 약간 어두운.
4. 토사는 막 ultracentrifugation 54000 x g 16 h 또는 98000 x g 5 h 4 ° c.에 의해 조각 가만히 따르다는 상쾌한 클로 프롬 추출 진행 또는 플래시 동결 액체 질소에는 토사와-80 ° c.에 그것을 저장합니다

3. F₁의 릴리스-클로 프롬에 의해 막에서 ATPase

1. 작은 Dounce 균질 화기의 도움으로 버퍼 B에에서 미토 콘 드리 아 막의 펠 릿을 resuspend. 버퍼 B의 볼륨에 따라 총 버퍼의 사용 단계 2.1과 2.2를 사용 하 여 다음 수식에서 계산: 볼륨 (버퍼 B) = 볼륨 (버퍼 A) x 12/21. 15 또는 50 mL 원뿔 튜브에 정지를 전송.
2. 얼음에서 샘플을 제거 하 고, 지금부터, 샘플 및 실 온에서 사용 될 모든 솔루션을 유지.
3. 클로 프롬 2 M Tris HCl ph 8.5; 포화를 추가합니다 클로 프롬을 추가할 수의 현 탁 액의 절반 볼륨을 같습니다. 단단히 뚜껑을 닫습니다. 흔들어 적극적으로 정확히 20 s. 8400 x g 실 온에서 5 분에서 그것을 즉시 원심.
4. 1.6 mL microtubes 이동 상단 흐린 수성 단계. 프로 테아 제 억제제 (10 µ M amastatin, 50 µ M bestatin, 50 µ M pepstatin, 50 µ M leupeptin, 및 50 µ M diprotin A) 클로 프롬 치료에 의해 제거 억제제를 대체를 추가 합니다. 실 온에서 30 분 13000 x g 에서 샘플 원심 신선한 microtubes는 상쾌한 전송 하 고 모든 불용 성 재료를 제거 하는 원심 분리를 반복 합니다.

4. 음이온 교환 크로마토그래피

1. Equilibrate 280에서 흡 광도까지 5 mL/min의 유량에 Q 열 버퍼와 고속 단백질 액체 크로마토그래피 시스템에 부착 된 5 mL 음이온 교환 (Q) 열 전도도 및 안정화 (버퍼의 약 50 mL).
2. 280에서 흡수도 될 때까지 대기를 1 mL/분의 유량에 equilibrated 열에 3.3 단계에서는 상쾌한 로드 nm 안정화는 배경에서. 0.5 mL/분 수집 1 mL 분수의 흐름 속도에서 100 %0 %에서 Q-열 차입 버퍼의 25 mL 선형 그라데이션이 적용 됩니다.
3. PH 8.0에 풀 먼 ATPase 분석 결과² ATP 가수분해 활동에 대 한 주요 차입 피크에 해당 하는 개별 분수 시험 반응 혼합물의 1 mL 당 각 분수의 10 µ L을 사용 합니다. ATPase 활동 하는 분수를 풀. 선택적으로, 나트륨 라우릴 인산 polyacrylamide 젤 전기 영동 (SDS-PAGE)에 각 분수의 10 µ L 고 Coomassie 파란 개별 F₁을 시각화 하 여 젤 얼룩-ATPase 소 단위 및 오염 단백질.
4. 막 한 200-500 µ L. 100000 MWCO PES 필터 스핀 열을 사용 하 여 풀링된 샘플 초 또는 게 실 온에서 하룻밤 샘플 진행 하는 집중.

5. 크기 배제 크로마토그래피

1. SEC 열 0.5 mL/min의 유량에 SEC 버퍼의 적어도 48 mL (2 개의 열 볼륨)와 액체 크로마토그래피 시스템에 연결 된 equilibrate
2. 열에 샘플을 적용 하 고 수집 0.25-mL 분수 0.25 mL/분의 유량에서 크로마토그래피를 실행 합니다.
3. SDS 페이지에 UV_280nm 흡수도 추적의 봉우리에 해당 하 고 Coomassie 블루 얼룩 분수의 10 µ L를 실행 합니다. F₁을 포함 하는 첫 번째 주요 피크-ATPase. 풀 먼 ATPase 분석 결과 의해 ATP 가수분해 활동 및 아 지 드 감도 대 한이 피크에 해당 하는 분수 시험 BCA 분석 결과 의해 단백질 농도 결정 합니다.
4. 순화 된 F₁유지-실내 온도에 ATPase 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 정화 후 3 일 이내 사용 하 고. 또는 100000 MWCO PES 필터 > 1.5 mg/ml, 촉진 그것 포화 황산 암모늄을 혼합 하 여 pH 8.0 (볼륨 x 1.2), 조정 회전 열을 사용 하 여 샘플을 집중 하 고 4 ° c.에 그것을 저장합니다

결과

일반적인 정화 (그림 1) T. brucei 셀²⁵ 표준에서 양식 2 x 10¹¹ procyclic hypotonically lysed 1 x 10¹¹ Percoll 그라데이션에 고립 된 미토 콘 드 리아 소포 (mitoplasts)로 시작 포도 당-풍부한 SDM-79 중²⁷. mitoplasts 쥡니다, 돌 다에 의해 조각화 되 고 포함 하는 매트릭스 상쾌한 삭제 됩니다. 미토 콘 드리 아 막 클?...

토론

F₁에 대 한 프로토콜-ATPase 정화 T. brucei 에서 개발한 F₁의 분리에 따라 이전에 게시 방법-ATPase 단지 다른 종^13,14에서. 메서드에 유전 수정 필요 하지 않습니다 (예를 들어, 태그) 하 고 현재 모든 소 단위와 완전히 활성화 단지 생성. 중요 한 단계는 F₁의 클로 프롬 촉진 릴리스-ATPase 효소의 막 연결 부분에서. 지금까지 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)	Applichem	A0948
Amastatin Hydrochloride	Glantham Life Sciences	GA1330
Aminocaproic Acid	Applichem	A2266
BCA Protein Assay Kit	ThermoFischer Scientific/Pierce	23225
Benzamidine Hydrochloride	Calbiochem	199001
Bestatin Hydrochloride	Sigma Aldrich/Merck	B8385
Chloroform	Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free	Roche	4693159001	Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Any supplier
Hydrochloric Acid	Any supplier		For pH adjustment
Ile-Pro-Ile	Sigma Aldrich/Merck	I9759	Alias Diprotin A
Leupeptin	Sigma Aldrich/Merck	L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Any supplier
Pepstatin A	Sigma Aldrich/Merck	P5318
Protein Electrophoresis System	Any supplier
Sodium Chloride	Any supplier
Sucrose	Any supplier
Tris	Any supplier
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer	Beckman Coulture	328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL	Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device	Sartorius	516-7017	Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL	GE Healthcare Life Sciences	17115401	Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm	Sartorius	18406--47------N	Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	29091596	Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES	Sartorius	VS0641
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
AKTA Pure 25	GE Healthcare Life Sciences	29018224	Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601	Shimadzu		Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor	Beckman Coulture		Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000	BioLogics	0-127-0001	Or similar ultrasonic homogenizer