Isolierung der F1-ATPase aus der parasitären protiste Trypanosomen Trypanosomen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Reinigung des F-₁-ATPase aus dem kultivierten Insekt Stadium der Trypanosomen Trypanosomen. Das Verfahren ergibt einen sehr reinen, homogen und aktive Komplex für strukturelle und enzymatische Studien geeignet.

Zusammenfassung

F₁-ATPase ist ein Membran-extrinsische katalytische Subcomplex von F-Typ-ATP-Synthase, ein Enzym, das die Proton Motor über Biologische Membranen verwendet, um Adenosintriphosphat (ATP) zu produzieren. Die Isolation der intakten F₁-ATPase native entspringt ist eine wesentliche Voraussetzung für des Enzyms Proteinzusammensetzung, kinetische Parameter und Sensibilität für Inhibitoren zu charakterisieren. Ein hochreines, homogene F₁-ATPase eignet sich für strukturelle Studien, die Einblick in die molekularen Mechanismen der ATP-Synthese und Hydrolyse. Dieser Artikel beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von der F-₁-ATPase aus Trypanosomen Trypanosomen, die Erreger der afrikanischen Trypanosomiases. Die F-₁-ATPase ist isoliert von mitochondrialen Vesikel, die durch hypotone lyse von in Vitro kultivierten Trypanosomen gewonnen werden. Die Vesikel sind mechanisch fragmentiert, Beschallung und der F-₁-ATPase ist durch die Chloroform-Extraktion aus der inneren mitochondrialen Membran befreit. Der enzymatische Komplex wird weiter durch aufeinanderfolgende Anion Austausch und Größe-Ausschluss Chromatographie gereinigt. Sensible Massenspektrometrie Techniken zeigte, dass die gereinigte Anlage frei von nahezu jedem Protein Verunreinigungen ist und daher, geeignetes Material zur Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie stellt. Die isolierte F₁-ATPase Exponate ATP hydrolytische Aktivität, die voll von Natriumazid, ein potenter Inhibitor der F-Typ-ATP-Synthasen gehemmt werden kann. Die gereinigte Anlage bleibt stabil und aktiv für mindestens drei Tage bei Zimmertemperatur. Niederschlag von Ammoniumsulfat wird für die langfristige Lagerung verwendet. Ähnliche Verfahren werden für die Reinigung von F₁- ATPasen aus Säugetieren und pflanzlichen Geweben, Hefen oder Bakterien. So kann die vorgestellte Protokoll dienen als Richtschnur für die F-₁-ATPase isoliert von anderen Organismen.

Einleitung

Die F-Typ-ATP-Synthasen sind Membrane-springen rotierende Multi-komplexe, dass paar Protonen-Translokation über Energie-transducing Membranen von Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten mit der Bildung von ATP. Molekularen Details des rotierenden Mechanismus der ATP-Synthese sind vor allem wegen der strukturellen Studien des gereinigten Bakterien- und mitochondrialen ATP-Synthasen und ihre Subcomplexes¹bekannt. F-Typ-ATP-Synthase ist in Membran-intrinsische und extrinsische Membran Moieties unterteilt. Der Membran-extrinsische Teil, bekannt als F-₁-ATPase, enthält drei katalytischen Standorte, wo die Phosphorylierung des Adenosin-diphosphat (ADP), ATP oder die umgekehrte Reaktion auftritt. F₁-ATPase kann unter Beibehaltung seiner Fähigkeit, Hydrolyseneigung, aber nicht synthetisieren ATP experimentell aus der Membran-intrinsische glyko-freigesetzt werden. Die Membrane-springen-Sektor, genannt F_o, vermittelt Protein Translokation, die die Drehung des zentralen Teils des Enzyms antreibt. F₁ und F_o Sektoren sind durch die zentrale und periphere Stiele verbunden.

Die ersten Versuche, die F-₁zu reinigen-ATPase aus angehenden Hefe und Rinder Herz Mitochondrien Datum zurück bis in die 1960er Jahre. Diese Protokolle verwendet extrahiert Mitochondrien, die durch Ultraschallbehandlung, fraktioniert durch Ammonium oder Protamin Sulfat-Fällung, gefolgt von optionalen Chromatographie Schritte und Wärmebehandlung^{2,3,4 gestört wurden ,5,6}. Die Reinigung wurde stark verbessert und vereinfacht durch die Verwendung von Chloroform, die bereitwillig die F-₁frei-ATPase aus der mitochondrialen Membran Fragmente⁷. Die Chloroform-Extraktion wurde dann zur F₁Auszug - ATPasen aus verschiedenen Tier-, Pflanzen- und bakteriellen Quellen (z.B., Ratte Leber⁸Mais⁹, Arum Maculatum¹⁰und Escherichia coli ¹¹). Weitere Reinigung des Chloroform veröffentlicht F₁-ATPase durch Affinität oder Größe-Exclusion Chromatography (SEC) ergab eine hochreine Proteinkomplex, der für hochauflösende Strukturaufklärung durch Röntgen-Kristallographie geeignet war, als dokumentiert von den Strukturen des F-₁-ATPase aus bovine Herz^12,13 und Saccharomyces Cerevisiae¹⁴. F₁-ATPase Strukturen wurden auch von Organismen, die schwierig zu kultivieren sind bestimmt und somit beschränkte sich des Betrags des ursprünglichen biologischen Materials. In diesem Fall, die F-₁-ATPase Untereinheiten wurden künstlich zum Ausdruck gebracht und montiert in den Komplex in E. Coli, und das ganze heterologe Enzym durch Affinität Chromatographie über einen tagged Untereinheit gereinigt wurde. Dieser Ansatz führte zu die Bestimmung des F-₁-ATPase Strukturen aus zwei thermophile Bakterien-Spezies, Geobacillus Stearothermophilus¹⁵ und Caldalkalibacillus Thermarum^{16, 17}. diese Methode ist jedoch eher ungeeignet für eukaryotische F₁- ATPasen da es stützt sich auf die prokaryotische Protheosynthetic Apparat, posttranslationale Verarbeitung und aufwändige Montage.

Die Chloroform-basierte Extraktion war früher F₁isolieren - ATPasen aus einzelligen Digenetic Parasiten Trypanosoma Trypanosomen¹⁸ und T. Trypanosomen¹⁹, wichtigen Säugetieren Krankheitserreger verursacht amerikanische und Afrikanische Trypanosomiases bzw. monogenen Insekten Parasiten Crithidia Fasciculata²⁰. Diese Reinigungen führte nur eine einfache Beschreibung des F-₁- ATPasen, da keine downstream-Anwendungen verwendet wurden, um vollständig zu charakterisieren, die Zusammensetzung, Struktur und enzymatischen Eigenschaften des Komplexes. Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Methode für F₁-ATPase Reinigung von der kultivierten Insekt Lebenszyklus von T. Trypanosomen. Die Methode ist basiert auf die etablierte Protokolle zur Isolation von Rindern und Hefe F₁- ATPasen^21,22entwickelt. Das Verfahren liefert sehr reine und homogene Enzym geeignet für in-vitro- enzymatische und hemmenden Assays, detaillierte Proteomic Charakterisierung durch Massenspektrometrie²³und Struktur Entschlossenheit²⁴. Die Reinigung-Protokoll und das Wissen um die F-₁-ATPase-Struktur auf atomarer Ebene öffnet eine Möglichkeit zur Gestaltung von Bildschirme zu identifizieren Small-Molecule-Inhibitoren und Hilfe bei der Entwicklung neuer Medikamente gegen afrikanische Trypanosomiases. Darüber hinaus lässt sich das Protokoll anpassen, F₁zu reinigen-ATPase aus anderen Organismen.

Protokoll

1. Puffer und Lösungen

1. Bereiten Sie die unten aufgeführten Lösungsvorschläge. Entgasen Sie alle Puffer für Flüssigkeitschromatographie. Fügen Sie ADP, Benzamidine und Protease-Inhibitoren, kurz vor dem Einsatz.
   1. Bereiten Sie Puffer A: 50 mM Tris-Puffer mit Salzsäure (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 M Saccharose, 5 mM Benzamidine, 5 mM Aminocaproic Säure (ACA) und Protease-Inhibitoren (10 µM Amastatin, 50 µM Bestatin 50 µM Pepstatin, 50 µM Leupeptin und 50 µM Diprotin A).
   2. Bereiten Sie Puffer B: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,25 M Saccharose, 4 mM Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA), 5 mM Benzamidine, 5 mM ACA, 1 mM ADP, und Protease-Inhibitoren (10 µM Amastatin, 50 µM Bestatin 50 µM Pepstatin, 50 µM Leupeptin und 50 µM Diprotin A).
   3. Q-Spalte Puffer vorzubereiten: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 mM EDTA, 10 mM MgSO₄, 5 mM Benzamidine, 5 mM ACA und 1 mM ADP.
   4. Q-Spalte Elution Buffer vorbereiten: Q-Spalte Puffer mit 1 M NaCl.
   5. SEC-Puffer vorzubereiten: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 10 mM MgSO₄, 100 mM NaCl, 1 mM ADP.
   6. Bereiten Sie Chloroform gesättigt mit 2 M Tris-HCl pH 8,5. Chloroform mischen mit 2 M Tris-HCl pH 8,5 in etwa 1:1 Verhältnis in einem Schraubverschluss-Flasche, schütteln, lassen Sie die organischen und wässrigen Phasen getrennt und in der oberen wässrigen Schicht mit einem Streifen von pH-Indikatorpapier pH messen. Bei Raumtemperatur lagern. Kurz vor dem Einsatz erneut schütteln Sie und lassen Sie die Phasen getrennt. Verwenden Sie die untere Schicht von Chloroform.
      Achtung: Chloroform ist flüchtig und reizend auf Augen und Haut. Arbeiten Sie in einer Dampfhaube. Verwenden Sie Schutzbrillen beim Schütteln.

2. Vorbereitung des Sub-mitochondriale Partikel

1. Aufschwemmen Sie mitochondriale Vesikel (Mitoplasts) durch hypotone Lyse²⁵ von 1 x 10-¹¹ , 2 x 10¹¹ Zellen der prozyklischen T. Trypanosomen in 5 mL eiskaltes Puffer A. halten Sie die Probe erst Schritt 3.2 gekühlt isoliert.
2. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration in der Suspension, durch die Bicinchoninic Säure (BCA) Protein Assay²⁶ nach den Anweisungen des Herstellers.
   1. Verwenden Sie eine Verdünnungsreihe Rinderserumalbumin (BSA) in Reinstwasser, um die Standardkurve zu konstruieren. Verdünnen Sie eine kleine Menge der Probe 20 - 100 Mal mit Reinstwasser in den Bereich der BSA Standards passen.
   2. Berechnen Sie die Gesamt-Protein-Menge in der Probe und bringen Sie die Proteinkonzentration bis 16 mg/mL verdünnt es mit zusätzlichen Puffer A.
3. Fragment Mitoplasts in umgekehrten Vesikel und Membran Stücke durch Ultraschallbehandlung der Suspension 7 X für 15 s mit einer Gesamtenergie von 70 bis 100 J pro Impuls mit einer Microtip mit einem Durchmesser von 3,9 mm. Wenn der Ultraschall Homogenisator die Energieabgabe nicht angezeigt wird, starten Sie die Optimierung bei 50 % der maximalen Leistung. Inkubation die Probe auf dem Eis für 30 s zwischen Impulsen. Nach der Ultraschallbehandlung wird die Federung etwas dunkler.
4. Sediment der Membran Fragmente durch Ultrazentrifugation 54.000 x g für 16 h oder bei 98.000 x g für 5 h bei 4 ° C. Dekantieren Sie des Überstandes und fahren Sie mit dem Chloroform Extraktion oder Schockfrosten Sediment in flüssigem Stickstoff und bei-80 ° c lagern

3. Veröffentlichung von F₁-ATPase aus Membran durch Chloroform

1. Das Pellet der mitochondrialen Membranen im Puffer B mit Hilfe eines kleinen Dounce-Homogenisator aufzuwirbeln. Berechnen Sie das Volumen des Puffers B basierend auf den Gesamtbetrag der Puffer ein gebrauchtes in Schritte 2.1 und 2.2 mithilfe der folgenden Formel: Volumen (Puffer B) = Volumen (Puffer A) x 12/21. Übertragen Sie die Aussetzung auf ein 15 - 50 mL konische Rohr.
2. Entfernen Sie die Probe aus Eis und ab jetzt halten Sie die Probe und alle Lösungen bei Raumtemperatur verwendet werden.
3. Hinzufügen von Chloroform mit 2 M Tris-HCl pH 8,5 gesättigt; das Volumen der Chloroform hinzugefügt werden gleich die Hälfte des Volumens der Suspension. Schließen Sie den Deckel fest. Schütteln Sie sie kräftig für genau 20 s. Zentrifugieren sie sofort bei 8.400 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
4. Übertragen Sie die obere bewölkte wässrige Phase auf 1,6 mL Mikroröhrchen. Fügen Sie Protease-Inhibitoren (10 µM Amastatin, 50 µM Bestatin 50 µM Pepstatin, 50 µM Leupeptin und 50 µM Diprotin A), die Inhibitoren durch Chloroform Behandlung entfernt zu ersetzen. Zentrifugieren Sie die Proben bei 13.000 X g für 30 min bei Raumtemperatur. Übertragen Sie den Überstand auf frische Mikroröhrchen und wiederholen Sie die Zentrifugation um unlösliche Material zu entfernen.

(4) Anion-Austausch-Chromatographie

1. Equilibrate die 5-mL-Anion Austausch (Q) Spalte verbunden zu einem Fast-Protein Flüssigchromatographie-System mit dem Q-Spalte-Puffer mit einer Durchflussrate von 5 mL/min bis die Absorption bei 280 nm und die Leitfähigkeit zu stabilisieren (ca. 50 mL des Puffers).
2. Laden des Überstands von Schritt 3.3 äquilibriert Spalte mit einer Durchflussrate von 1 mL/min warten bis die Absorption bei 280 nm stabilisiert sich auf dem Hintergrund. Gelten Sie einen 25-mL-linearen Verlauf des Puffers Q-Spalte Elution von 0 % bis 100 % bei einer Durchflussmenge von 0,5 mL/min sammeln 1-mL-Fraktionen.
3. Test der einzelnen Fraktionen entsprechend der großen Elution Peak ATP hydrolytische Aktivität durch die Pullman-ATPase Assay² bei pH 8,0. Verwenden Sie 10 µL der einzelnen Fraktionen pro 1 mL des Reaktionsgemisches. Bündeln Sie die Fraktionen, die ATPase-Aktivität aufweisen. Optional 10 µL der einzelnen Fraktionen auf Natrium-Dodecyl-Phosphat-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAGE) zu trennen und färben das Gel von Coomassie Blau, individuelle F₁zu visualisieren-ATPase Untereinheiten und kontaminierende Proteine.
4. Konzentrat die gepoolte Probe durch Membran Ultrafiltration mit einer Spin-Spalte mit einem 100.000 MWCO PES-Filter um 200-500 µL. fahren Sie mit SEC oder laden die Probe über Nacht bei Raumtemperatur.

5. Größe-Exclusion Chromatography

1. Equilibrate der SEC-Spalte ein Flüssigchromatographie-System mit mindestens 48 mL (zwei Spalte Bände) des Puffers SEC mit einer Durchflussrate von 0,5 mL/min angebracht.
2. Wenden Sie die Probe auf die Spalte und laufen Sie Chromatographie mit einer Durchflussrate von 0,25 mL/min sammele 0,25 mL-Fraktionen.
3. Führen Sie 10 µL der Fraktionen, die bis zu den Gipfeln der UV_280nm Extinktion Ablaufverfolgung auf SDS-PAGE entsprechen und ihnen durch Coomassie Blau färben. Die ersten großen Höhepunkt enthält die F-₁-ATPase. Bestimmen Sie die Fraktionen entsprechend dieser Gipfel für die ATP hydrolytische Aktivität und Azid-Empfindlichkeit durch die Pullman-ATPase-Assay. Bestimmen Sie die Proteinkonzentration von der BCA-Test.
4. Halten Sie die gereinigten F₁-ATPase bei Raumtemperatur und innerhalb von 3-d nach der Reinigung für downstream-Anwendungen verwenden. Alternativ, konzentrieren sich die Probe mit einer Spin-Spalte mit einem 100.000 MWCO PES-Filter > 1,5 mg / ml, Niederschlag durch Mischen mit gesättigten Ammoniumsulfat pH 8.0 (1,2 x Volumen) angepasst, und bei 4 ° c lagern

Ergebnisse

Eine typische Reinigung (Abbildung 1) beginnt mit mitochondrialen Vesikel (Mitoplasts) isoliert auf die Percoll Steigung von hypotonically lysierten 1 x 10-¹¹ , 2 x 10¹¹ prozyklischen T. Trypanosomen Zellen²⁵ kultiviert in standard Glukose-reiche SDM-79 mittlere²⁷. Die Mitoplasts sind durch Ultraschallbehandlung, gesponnen, fragmentiert und der Matrix-haltigen Überstand wird verwo...

Diskussion

Das Protokoll für F₁-ATPase Reinigung von T. Trypanosomen wurde entwickelt, basierende auf zuvor veröffentlichte Methoden für die Isolierung von F₁-ATPase komplexe aus anderen Arten^13,14. Die Methode erfordert keine genetische Änderungen (z. B.tagging) und ergibt einen vollaktiven Komplex mit allen Untereinheiten vorhanden. Der entscheidende Schritt ist die Chloroform erleichterte Version von F-₁-ATPase aus d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)	Applichem	A0948
Amastatin Hydrochloride	Glantham Life Sciences	GA1330
Aminocaproic Acid	Applichem	A2266
BCA Protein Assay Kit	ThermoFischer Scientific/Pierce	23225
Benzamidine Hydrochloride	Calbiochem	199001
Bestatin Hydrochloride	Sigma Aldrich/Merck	B8385
Chloroform	Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free	Roche	4693159001	Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Any supplier
Hydrochloric Acid	Any supplier		For pH adjustment
Ile-Pro-Ile	Sigma Aldrich/Merck	I9759	Alias Diprotin A
Leupeptin	Sigma Aldrich/Merck	L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Any supplier
Pepstatin A	Sigma Aldrich/Merck	P5318
Protein Electrophoresis System	Any supplier
Sodium Chloride	Any supplier
Sucrose	Any supplier
Tris	Any supplier
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer	Beckman Coulture	328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL	Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device	Sartorius	516-7017	Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL	GE Healthcare Life Sciences	17115401	Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm	Sartorius	18406--47------N	Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	29091596	Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES	Sartorius	VS0641
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
AKTA Pure 25	GE Healthcare Life Sciences	29018224	Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601	Shimadzu		Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor	Beckman Coulture		Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000	BioLogics	0-127-0001	Or similar ultrasonic homogenizer