Isolamento di F1-ATPasi dal Protista parassita Trypanosoma brucei

Riepilogo

Questo protocollo descrive la purificazione di F₁-ATPase dal palco dell'insetto colta di Trypanosoma brucei. La procedura produce un complesso altamente puro, omogeneo e attivo adatto per studi strutturali ed enzimatici.

Abstract

F₁-atpasi è una membrana-estrinseca ossidrilasico catalitica del F-tipo ATP sintasi, un enzima che utilizza la forza motrice protonica attraverso le membrane biologiche per la produzione di adenosina trifosfato (ATP). L'isolamento del intatta F₁-ATPasi dalla sorgente nativo è un prerequisito essenziale per caratterizzare la composizione proteica, parametri cinetici e sensibilità agli inibitori dell'enzima. Un altamente puro e omogeneo F₁-ATPasi possono essere utilizzato per studi strutturali, che forniscono la comprensione nei meccanismi molecolari di sintesi di ATP e idrolisi. In questo articolo viene descritta una procedura per la purificazione del F₁-ATPase dal Trypanosoma brucei, l'agente causativo di trypanosomiases africano. F₁-atpasi è isolato dalle vescicole mitocondriale, che sono ottenute da Lisi ipotonica da in vitro coltivate trypanosomes. Le vescicole sono frammentate meccanicamente di sonicazione e la F₁-ATPasi viene rilasciato dalla membrana mitocondriale interna mediante l'estrazione di cloroformio. Il complesso enzimatico viene ulteriormente purificato di scambio anionico consecutivi e la cromatografia di esclusione dimensionale. Tecniche di spettrometria di massa sensibile ha mostrato che il complesso purificato è privo di contaminanti virtualmente qualsiasi proteina e, pertanto, rappresenta il materiale adatto per la determinazione della struttura di cristallografia a raggi x o cryo-microscopia elettronica. L'isolato F₁-ATPasi esibisce attività idrolitica di ATP, che può essere inibito completamente da sodio azide, un potente inibitore delle F-tipo ATP sintasi. Il complesso purificato rimane stabile e attiva per almeno tre giorni a temperatura ambiente. Precipitazione con solfato di ammonio è usato per immagazzinaggio a lungo termine. Procedure simili sono state usate per la purificazione di F₁- atpasi da tessuti di mammiferi e vegetali, lieviti o batteri. Così, il protocollo presentato può servire come guida per la F₁-isolamento dell'atpasi da altri organismi.

Introduzione

I tipo F ATP sintasi sono membrana-limitano rotanti complessi multiproteici tale traslocazione del protone di coppia attraverso le membrane trasduzione di energia dei batteri, i mitocondri e cloroplasti con la formazione di ATP. Dettagli molecolari del meccanismo di rotazione di sintesi di ATP sono noti principalmente a causa di studi strutturali di purificato batterica e mitocondriale ATP sintasi e loro subcomplexes¹. F-tipo trifosfato di adenosina synthase è organizzato in membrana-intrinseche ed estrinseche-membrana moiety. Parte della membrana-estrinseco, nota come F₁-atpasi, contiene tre siti catalitici, dove si verifica la fosforilazione dell'adenosina difosfato (ADP) di ATP o la reazione inversa. F₁-ATPasi possono essere rilasciato sperimentalmente da parte dell'intrinseca di membrana pur mantenendo la sua capacità di idrolizzare, ma non sintetizzare, ATP. Il settore di membrana-limita, chiamato F_o, media la traslocazione di proteine, che aziona la rotazione della parte centrale dell'enzima. La F₁ e F_o settori sono collegati da steli centrali e periferici.

I primi tentativi di purificare la F₁-atpasi da lievito e cuore bovino mitocondri data indietro al 1960. Questi protocolli utilizzati estratti di mitocondri, che sono stati interrotti di sonicazione, frazionato da precipitazione del solfato dell'ammonio o protamina, seguita da cromatografia opzionale passo (s) e trattamento termico^{2,3,4 ,5,6}. La purificazione è stato notevolmente migliorata e semplificata mediante l'uso di cloroformio, che prontamente rilascia la F₁-ATPasi dalla membrana mitocondriale frammenti⁷. L'estrazione di cloroformio è stato poi utilizzato per estrarre F₁- atpasi da vari animali, vegetali e fonti batteriche (ad es., del fegato del ratto⁸, mais⁹, Arum maculatum¹⁰e Escherichia coli ¹¹). Ulteriore purificazione del cloroformio-rilasciato F₁-ATPasi mediante cromatografia di affinità o di esclusione (SEC) ha reso una proteina altamente pura complessa, che era adatta per la determinazione della struttura ad alta risoluzione di cristallografia a raggi x, come documentato dalle strutture di F₁-atpasi da cuore bovino^12,13 e¹⁴di Saccharomyces cerevisiae. F₁-strutture dell'atpasi inoltre sono stati determinati da organismi che sono difficili da coltivare e, quindi, la quantità di materiale biologico iniziale era limitata. In questo caso, la F₁-subunità ATPasi sono stati artificialmente espresso e assemblate per formare il complesso dentro e. colie l'enzima intero eterologa è stato purificato mediante cromatografia affinità tramite una subunità taggata. Tale approccio ha portato alla determinazione di F₁-strutture di atpasi da due specie di batteri termofile, Geobacillus stearothermophilus¹⁵ e thermarum Caldalkalibacillus^{16, 17}. Tuttavia, questa metodologia è piuttosto inadatta per eucariotica F₁- ATPasi dato che si basa sull'apparato protheosynthetic procariote, elaborazione post-traduzionale e assiemi complessi.

L'estrazione basata su cloroformio utilizzato in precedenza per isolare F₁- atpasi da unicellulari digenetic parassiti Trypanosoma cruzi¹⁸ e T. brucei¹⁹, importanti patogeni mammiferi causando americano e Trypanosomiases africano, rispettivamente e da malattie monogenica insetto parassita Crithidia fasciculata²⁰. Queste purificazioni ha condotto soltanto a una semplice descrizione del F₁- atpasi, poiché nessuna applicazione a valle sono stata usata per caratterizzare la composizione, struttura e proprietà enzimatiche del complesso. Questo articolo viene descritto un metodo ottimizzato per F₁-purificazione dell'atpasi dalla fase del ciclo di vita dell'insetto colta di T. brucei. Il metodo è sviluppato basato su protocolli stabiliti per l'isolamento di bovini e lievito F₁- ATPasi^21,22. La procedura produce altamente puro e omogeneo enzima adatto in vitro enzimatico e inibitorio saggi, proteomica dettagliata caratterizzazione mediante spettrometria di massa²³e struttura determinazione²⁴. Il protocollo di purificazione e la conoscenza del F₁-ATPasi struttura a livello atomico si apre la possibilità di progettare le schermate per identificare piccole molecole inibitori e facilitare lo sviluppo di nuovi farmaci contro trypanosomiases africano. Inoltre, il protocollo può essere adattato per purificare F₁-atpasi da altri organismi.

Protocollo

1. tamponi e soluzioni

1. Preparare le soluzioni elencate di seguito. Degassare tutti i buffer per cromatografia liquida. Aggiungere gli inibitori di proteasi, benzamidine e ADP appena prima dell'uso.
   1. Preparare il tampone di buffer a: 50 mM Tris con acido cloridrico (Tris-HCl) pH 8.0, saccarosio 0,25 M, 5 mM benzamidine, 5mm aminocaproico acido (ACA) e proteasi inibitori (10 amastatin µM, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatina, 50 µM leupeptina e 50 µM diprotin A).
   2. Preparare di tampone b: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0.25 M saccarosio, acido etilendiamminotetracetico 4mm (ed), 5 mM benzamidine, 5mm ACA, 1mm ADP e inibitori della proteasi (10 amastatin µM, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatina, 50 µM leupeptina e 50 µM diprotin A).
   3. Preparare il tampone di Q-colonna: 20 mM Tris-HCl a pH 8.0, 4 mM EDTA, 10mm MgSO₄, 5mm benzamidine, 5mm ACA e 1 mM ADP.
   4. Preparare il tampone di eluizione di Q-colonna: buffer di Q-colonna con NaCl di 1m.
   5. Preparare il tampone di SEC: 20 mM Tris-HCl a pH 8.0, 10mm MgSO₄, 100 mM NaCl, 1 mM ADP.
   6. Preparare il cloroformio saturata con 2 M Tris-HCl pH 8,5. Mescolare il cloroformio con 2 M Tris-HCl pH 8,5 in rapporto di circa 1:1 in una bottiglia con tappo a vite, agitare, let fasi organiche ed acquose separate e misurare il pH nello strato acquoso superiore con una striscia di carta indicatore di pH. Conservare a temperatura ambiente. Appena prima dell'uso, agitare nuovamente e lasciare che le fasi separate. Utilizzare lo strato inferiore di cloroformio.
      Attenzione: Il cloroformio è volatile ed irritante per gli occhi e la pelle. Lavorare in una cappa aspirante. Usare occhiali di sicurezza quando l'agitazione.

2. preparazione di particelle sub-mitocondriali

1. Risospendere le vescicole mitocondriale (mitoplasts) isolate da Lisi ipotonica²⁵ da 1 x 10¹¹ a 2 x 10¹¹ celle di prociclico T. brucei in 5 mL di tampone ghiacciata r. Keep il campione refrigerato fino al punto 3.2.
2. Determinare la concentrazione di proteina nella sospensione di bicinconinico acido (BCA) proteine dosaggio²⁶ secondo le istruzioni del produttore.
   1. Utilizzare una serie di diluizioni di albumina di siero bovino (BSA) in acqua ultrapura per costruire la curva standard. Diluire una piccola quantità di campione 20 - 100 volte con acqua ultrapura per adattarsi gli standard di gamma di BSA.
   2. Calcolare la quantità di proteine totali nel campione e portare la concentrazione nella proteina a 16 mg/mL diluendo con buffer aggiuntivo A.
3. Frammento di mitoplasts in vescicole invertite e pezzi di membrana di sonicazione della sospensione 7 x per 15 s con un'energia totale di 70 a 100 J per impulso con un microtip con un diametro di 3,9 mm. Se l'omogeneizzatore ad ultrasuoni non Visualizza l'output di energia, avviare l'ottimizzazione al 50% della potenza massima. Incubare il campione in ghiaccio per 30 s tra gli impulsi. Dopo la sonicazione, la sospensione diventa leggermente più scura.
4. Frammenti di sedimento la membrana dall'ultracentrifugazione a 54.000 x g per 16 h o a 98.000 x g per 5 ore a 4 ° C. Decantare il supernatante e procedere con l'estrazione di cloroformio, o flash-congelare il sedimento in azoto liquido e conservare a-80 ° C.

3. rilascio di F₁-ATPasi dalla membrana di cloroformio

1. Risospendere il pellet delle membrane mitocondriali nel buffer B con l'ausilio di un omogeneizzatore lisata piccolo. Calcolare il volume di tampone B basato sull'importo totale del buffer di un usato nella formula di punti 2.1 e 2.2, utilizzando il seguente: volume (tampone B) = volume (tampone A) x 12/21. Trasferire la sospensione in una provetta conica da 15 o 50 mL.
2. Rimuovere il campione dal ghiaccio e, da questo momento in poi, tenere il campione e tutte le soluzioni per essere utilizzato a temperatura ambiente.
3. Aggiungere cloroformio saturata con 2 M Tris-HCl pH 8,5; il volume di cloroformio da aggiungere è uguale a metà del volume della sospensione. Chiudere il tappo. Agitare vigorosamente per esattamente 20 s. e centrifugare immediatamente a 8.400 x g per 5 min a temperatura ambiente.
4. Trasferire la fase acquosa nuvolosa superiore a 1,6 mL microprovette. Aggiungere gli inibitori di proteasi (10 amastatin µM, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatina, 50 µM leupeptina e 50 µM diprotin A) per sostituire gli inibitori rimossi mediante il trattamento di cloroformio. Centrifugare i campioni a 13.000 x g per 30 min a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante per microprovette fresco e ripetere la centrifugazione per rimuovere qualsiasi materiale insolubile.

4. cromatografia di scambio anionico

1. Equilibrare la colonna di scambio (Q) 5 mL anione collegata ad un sistema di cromatografia liquida fast-proteina con il buffer di Q-colonna ad un flusso di 5 mL/min fino a quando l'assorbanza a 280 nm e la conducibilità stabilizzare (circa 50 mL di tampone).
2. Caricare il surnatante da passo 3.3 sulla colonna equilibrata ad un flusso di 1 mL/min aspettare fino a quando l'assorbanza a 280 nm si stabilizza a background. Applicare una sfumatura lineare di 25 mL di tampone di eluizione di Q-colonna da 0% a 100% a una portata di raccogliere frazioni di 1 mL 0,5 mL/min.
3. Analisi di singole frazioni corrispondente al picco di eluizione principali per attività idrolitica di ATP dai Pullman ATPasi dosaggio² pH 8.0. Utilizzare 10 µ l di ciascuna frazione per 1 mL di miscela di reazione. Piscina le frazioni che presentano l'attività dell'atpasi. Facoltativamente, separare 10 µ l di ciascuna frazione su elettroforesi di sodio dodecil fosfato del gel di poliacrilammide (SDS-PAGE) e macchia il gel da Blue di Coomassie visualizzare singoli F₁-subunità atpasi e proteine contaminanti.
4. Concentrato il campione mediante ultrafiltrazione di membrana con una colonna di spin con un filtro di MWCO PES 100.000 a 200-500 µ l. procedere al SEC o store il campione durante la notte a temperatura ambiente.

5. size exclusion Chromatography

1. Equilibrare la colonna SEC collegata ad un sistema di cromatografia liquida con almeno 48 mL (due volumi di colonna) del buffer SEC ad una portata di 0,5 mL/min.
2. Applicare il campione sulla colonna ed eseguire cromatografia ad una portata di 0,25 mL/min raccogliere 0.25 mL frazioni.
3. Eseguire 10 µ l delle frazioni che corrispondono alle vette della traccia di assorbanza UV_280nm su SDS-PAGE e li macchia di azzurro di Coomassie. Il primo picco principale contiene la F₁-atpasi. Analisi delle frazioni corrispondenti a questo picco per la sensibilità di attività e azide idrolitica di ATP mediante il saggio dell'atpasi Pullman. Determinare la concentrazione di proteina dall'analisi di BCA.
4. Mantenere la purificato F₁-ATPasi a temperatura ambiente e utilizzarlo all'interno di 3 d dopo purificazione per applicazioni a valle. In alternativa, concentrare il campione con una colonna di spin con un filtro di MWCO PES 100.000 a > 1,5 mg / mL, precipitato e mescolandolo con solfato di ammonio saturo regolata a pH 8.0 (1.2 x il volume) e conservare a 4 ° C.

Risultati

Una purificazione tipica (Figura 1) inizia con vescicole mitocondriale (mitoplasts) isolate sul gradiente di Percoll dal lisato hypotonically 1 x 10¹¹ a 2 x 10¹¹ prociclico di cellule di T. brucei ²⁵ coltivate nello standard glucosio-ricco SDM-79 media²⁷. I mitoplasts sono frammentati di sonicazione, filata, e il supernatante contenente matrice viene scartato. Le membrane mitocondr...

Discussione

Il protocollo per F₁-purificazione dell'atpasi da T. brucei è stato sviluppato precedentemente pubblicati basata su metodi per l'isolamento di F₁-complessi di atpasi da altre specie^13,14. Il metodo non richiede alcuna modificazione genetica (ad es., tagging) e produce un complesso completamente attivo con tutte le subunità presenti. Il punto cruciale è il rilascio di cloroformio-facilitato di F₁-ATPasi dalla p...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)	Applichem	A0948
Amastatin Hydrochloride	Glantham Life Sciences	GA1330
Aminocaproic Acid	Applichem	A2266
BCA Protein Assay Kit	ThermoFischer Scientific/Pierce	23225
Benzamidine Hydrochloride	Calbiochem	199001
Bestatin Hydrochloride	Sigma Aldrich/Merck	B8385
Chloroform	Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free	Roche	4693159001	Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Any supplier
Hydrochloric Acid	Any supplier		For pH adjustment
Ile-Pro-Ile	Sigma Aldrich/Merck	I9759	Alias Diprotin A
Leupeptin	Sigma Aldrich/Merck	L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Any supplier
Pepstatin A	Sigma Aldrich/Merck	P5318
Protein Electrophoresis System	Any supplier
Sodium Chloride	Any supplier
Sucrose	Any supplier
Tris	Any supplier
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer	Beckman Coulture	328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL	Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device	Sartorius	516-7017	Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL	GE Healthcare Life Sciences	17115401	Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm	Sartorius	18406--47------N	Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	29091596	Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES	Sartorius	VS0641
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
AKTA Pure 25	GE Healthcare Life Sciences	29018224	Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601	Shimadzu		Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor	Beckman Coulture		Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000	BioLogics	0-127-0001	Or similar ultrasonic homogenizer