JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает очищение F1-АТФазы из искусственного насекомых стадии Трипаносомы brucei. Процедура дает чистый, однородной и активный комплекс подходит для исследования структурных и ферментативные.

Аннотация

F1-АТФазы является мембрана внешняя каталитического подкомплекса F-тип АТФ-синтазы, фермент, который использует Протон движущей силой через биологические мембраны для производства аденозинтрифосфата (АТФ). Изоляции нетронутыми F1-АТФазы от его собственного источника является необходимым условием для характеризуют состав белков, кинетические параметры и чувствительность к ингибиторы фермента. Очень чистые и однородные F1-АТФазы может использоваться для структурных исследований, которые дают понимание молекулярных механизмов синтеза АТФ и гидролиз. Эта статья описывает процедуру для очистки F1-АТФазы от Trypanosoma brucei, возбудителя африканской trypanosomiases. F1-АТФазы изолирован от митохондриальной пузырьки, которые получаются путем гипотонический лизис из трипаносом в vitro культивировали. Везикулы механически фрагментированы, sonication и F1-АТФазы освобождается от внутренней митохондриальной мембраны экстракцией хлороформ. Энзимный комплекс является неразделимая подряд анион обмен и хроматография размер исключение. Чувствительных масс-спектрометрии методы показали, что очищенный комплекс лишена практически любых белковых загрязнений и, таким образом, представляет собой подходящий материал для определения структуры кристаллографии рентгеновского снимка или крио электронной микроскопии. Изолированные F1-АТФазы экспонатов гидролитическая деятельность СПС, которая может быть полностью тормозится азид натрия, мощным ингибитором synthases F-типа СПС. Очищенный комплекс остается стабильным и активным в течение трех дней при комнатной температуре. Количество осадков в сульфат аммония используется для длительного хранения. Аналогичные процедуры используются для очистки F1- ATPases с тканями растений и млекопитающих, дрожди или бактерии. Таким образом, представленные протокол может служить в качестве ориентира для F1-АТФазы изоляции от других живых организмов.

Введение

F-типа СПС synthases мембраны прыгните вращающихся multiprotein комплексов транслокации Протон что пара через преобразователя энергии мембраны бактерий, митохондрий и хлоропластов с образованием АТФ. Молекулярные вращательного механизма синтеза АТФ известно главным образом из-за структурных исследований очищенный бактериальных и митохондриальной synthases СПС и их Субкомплексы1. F-тип АТФ-синтазы организована в внутренние мембраны и мембраны внешняя постановление. Мембраны внешняя часть, известный как F1-АТФазы, содержит три катализатора сайты, где происходит фосфорилирование аденозиндифосфат (ADP) СПС или обратной реакции. F1-АТФазы могут быть освобождены экспериментально от мембраны неотъемлемой части молекулы при сохранении ее способность гидролизуют, но не синтезировать, СПС. Мембраны прыгните сектора, называется Fo, посредником транслокации белка, который управляет вращение центральной частью фермента. F1 и Fo секторов соединены Центральной и периферической стеблей.

Первые попытки очистить F1-АТФазы от начинающего дрожжей и бычьего сердца митохондрий Дата обратно в 1960-х. Эти протоколы, используемые извлечены митохондрий, которые были сорваны sonication, фракционированный высыпанием аммония или протамина сульфат, следуют необязательные хроматографии шаги и термической обработки2,3,4 ,5,6. Очистки была значительно улучшена и упрощена путем использования метилхлороформа, который легко выпускает F1-АТФазы от митохондриальной мембраны фрагменты7. Хлороформ добыча затем используется для извлечения F1- ATPases от различных животных, растений и бактерий источников (например, печени крыс8, кукуруза9, Арум maculatum10и Escherichia coli 11). Дальнейшей очистки хлороформ выпущена F1-АТФазы хромотографией сродства или размер исключение (SEC) принесли очень чистый белок комплекс, который подходит для определения структуры с высоким разрешением, рентгеноструктурного анализа, как документально подтверждено структур F1-АТФазы из сердца быка12,13 и14 Saccharomyces cerevisiae. F1-АТФазы структуры были определены также от организмов, которые трудны для того культивировать и, таким образом, сумма первоначального биологического материала было ограничено. В данном случае, F1-АТФазы подразделения были искусственно выразил смонтирован в комплекс в E. coli, и весь гетерологичных фермента был очищен, близость хроматографии через тегами субъединицы. Такой подход привел к определению F1-АТФазы структур из двух термофильных бактерий видов,15 Geobacillus stearothermophilusи Caldalkalibacillus thermarum16, 17. Однако эта методология довольно непригодна для eukaryotic F1- ATPases, поскольку он опирается на прокариот protheosynthetic аппарат, Посттрансляционная обработки и сложные Ассамблеи.

Добыча на основе хлороформ ранее использовался для изоляции F1- ATPases от digenetic одноклеточными паразитами Trypanosoma cruzi18 и т. brucei19, важные млекопитающих патогенов, вызывая Америки и Африканские trypanosomiases, соответственно и от Моногенные паразитов насекомых Crithidia fasciculata20. Эти очищения привело лишь к простой описание F1- ATPases, так как не нисходящие приложения были использованы в полной мере характеризуют состав, структура и ферментативные свойства комплекса. Эта статья описывает оптимизированный метод для F1-АТФазы очищение от стадии искусственного насекомого жизненного цикла т. brucei. Метод разработан на основании установленных протоколов для изоляции говядину и дрожжи F1- ATPases21,22. Процедура дает очень чистые и однородные фермента подходит для в vitro ферментативные и тормозящий анализов, подробные proteomic характеристика по масс-спектрометрии23и структуры определения24. Протокол очистки и знания о F1-АТФазы структуры на атомном уровне открывает возможность для разработки экранов для определения малых молекул ингибиторов и помощь в разработке новых лекарств против африканских trypanosomiases. Кроме того, этот протокол может быть адаптирована для очистки F1-АТФазы от других живых организмов.

протокол

1. буферов и решения

  1. Подготовка решения, перечисленные ниже. Дега все буферы для жидкостной хроматографии. Добавление ADP, benzamidine и ингибиторы протеазы непосредственно перед использованием.
    1. Подготовка буфера A: 50 мм буфер Tris с соляной кислоты (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 М сахарозы, 5 мм benzamidine, 5 мм Аминокапроновая кислота (ACA) и ингибиторы протеазы (10 мкм amastatin, 50 мкм bestatin, 50 мкм pepstatin, 50 мкм leupeptin и 50 мкм diprotin A).
    2. Подготовка буфера B: 50 мм трис-HCl рН 8,0, 0,25 М сахарозы, 4 мм Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 5 мм benzamidine, 5 мм ACA, 1 ADP и ингибиторы протеазы (10 мкм amastatin, 50 мкм bestatin, 50 мкм pepstatin, 50 мкм leupeptin и 50 мкм diprotin A).
    3. Подготовить Q-столбца буфера: 20 мм трис-HCl рН 8,0, 4 мм ЭДТА, 10 мм MgSO4, 5 мм benzamidine, 5 мм ACA и 1 мм ADP.
    4. Подготовить Q-колонки Элюирующий буфер: Q-столбца буфера с 1 M NaCl.
    5. Подготовить SEC буфера: 20 мм трис-HCl рН 8,0, 10 мм MgSO4, 100 мм NaCl, 1 ADP.
    6. Подготовьте хлороформ, насыщенных с 2 М трис-HCl рН 8,5. Смесь хлороформ с 2 М трис-HCl рН 8,5 в соотношении примерно 1:1 в бутылке колпачок, встряхнуть, пусть органических и водной фазы отдельно, и измерения pH в верхней водный слой с полосы pH индикатор бумаги. Хранить при комнатной температуре. Непосредственно перед использованием встряхнуть снова и пусть отдельных фаз. Используйте нижний слой хлороформа.
      Предупреждение: Хлороформ летучих и раздражает глаза и кожу. Работа в зонта. Используйте очки безопасности при встряхивании.

2. Подготовка суб митохондриальной частиц

  1. Ресуспензируйте митохондриальной везикулы (mitoplasts), изолированные гипотонический лизис25 от 1 х 1011 до 2 х 1011 клетки procyclic т. brucei в 5 мл ледяной буфер A. Держите образец охлажденным до шага 3.2.
  2. Определите концентрацию белка в подвеске, bicinchoninic кислоты (BCA) белка пробирного26 согласно инструкциям производителя.
    1. Используйте серию разрежения бычьим сывороточным альбумином (БСА) в ультрачистая вода для построения калибровочной кривой. Разбавьте небольшим количеством образца 20 - 100 раз с ультрачистая вода вписываются в диапазоне BSA стандартов.
    2. Рассчитать сумму общего белка в образце и довести концентрацию белка до 16 мг/мл путем разбавления с дополнительного буфера а.
  3. Фрагмент mitoplasts в Перевернутый везикулы и мембраны штук, sonication подвески 7 x 15 s с общей энергии от 70 до 100 J за импульса с microtip с диаметром 3,9 мм. Если ультразвуковой гомогенизатор не отображает выход энергии, запустите оптимизацию на 50% максимальной мощности. Проинкубируйте образцы на льду для 30 s между импульсами. После sonication подвеска становится немного темнее.
  4. Отложений мембраны отломков ultracentrifugation на 54000 x g для 16 h или 98 000 x g для 5 h при 4 ° C. Сцеживаться супернатант и продолжить извлечение хлороформ, или отложений флэш замораживание в жидком азоте и храните его при температуре-80 ° C.

3. выпуск F1-АТФазы от мембраны, хлороформе

  1. Ресуспензируйте Пелле митохондриальных мембран в буфере B с помощью небольшой гомогенизатор Dounce. Рассчитать объем буфера B на основе общее количество буфера используется в формуле 2.1 и 2.2, используя следующие шаги: объем (буфера B) = объем (буфер A) x 12/21. Передать подвеска 15 или 50 мл Конические трубки.
  2. Удалить образец из льда и теперь держать образца и все решения для использования при комнатной температуре.
  3. Добавить хлороформ, насыщенных с 2 М трис-HCl рН 8,5; объем хлороформ добавляемый равняется половины объема подвески. Плотно закройте крышку. Встряхнуть ровно 20 s. Центрифуга сразу на 8400 x g 5 мин при комнатной температуре.
  4. Передача верхней облачно водной фазе 1.6-мл пробирок. Добавление ингибиторов протеазы (10 мкм amastatin, 50 мкм bestatin, 50 мкм pepstatin, 50 мкм leupeptin и 50 мкм diprotin A), для замены ингибиторы, удалены, хлороформ лечения. Центрифугуйте образцы на 13 000 x г за 30 мин при комнатной температуре. Передать супернатант свежих пробирок и повторите центрифугирования для удаления любых нерастворимый материал.

4. Анионообменная хроматография

  1. Сбалансировать столбце обмен (Q) 5-мл анион, прилагается к системе быстро белка жидкостной хроматографии с Q-столбца буфера потока скоростью 5 мл/мин до поглощения в 280 Нм и проводимости стабилизации (примерно 50 мл буфера).
  2. Загрузить супернатант из шага 3.3 на столбце уравновешенной потока со скоростью 1 мл/мин ждать до поглощения в 280 Нм стабилизируется на фоне. Примените линейный градиент 25 мл Q-столбца буфера от 0% до 100% при скорости потока сбора фракций 1 мл 0,5 мл/мин.
  3. Анализа отдельных фракций, соответствующих основных элюции пик гидролитическая деятельности СПС Pullman АТФазы пробирного2 при pH 8.0. Использование 10 мкл каждой фракции на 1 мл реакционной смеси. Бильярд фракции, которые проявляют активность АТФ-азы. При необходимости, отделить 10 мкл каждой фракции на натрия Додециловый фосфат электрофореза геля полиакриламида (SDS-PAGE) и пятно гель по Кумасси синий для визуализации отдельных F1-АТФазы субъединиц и загрязняясь протеины.
  4. Концентрат, Объединенный образец ультрафильтрационные мембраны, с помощью столбца спин с 100000 MWCO PES фильтр для 200-500 мкл. приступить к SEC или магазина образца на ночь при комнатной температуре.

5. размер-гель-проникающей хроматографии

  1. Сбалансировать SEC колонки, подключенные к системе жидкостной хроматографии с по крайней мере 48 мл (два столбца томов) SEC буфера со скоростью потока 0,5 мл/мин.
  2. Применение образца на столбце и запуск хроматографии потока со скоростью 0,25 мл/мин сбор 0,25 мл фракций.
  3. Запуск 10 мкл фракций, которые соответствуют вершины трассировки поглощения УФ280nm на SDS-PAGE и выведение их путем Кумасси синим. Первый основной пик содержит F1-АТФазы. Пробирного фракций, соответствующий этот пик для ATP гидролитическая активности и азид чувствительности по Пробирной Pullman АТФазы. Определите концентрацию белка, BCA assay.
  4. Храните очищенную F1-АТФазы при комнатной температуре и использовать его в течение 3 d после очистки для нисходящие приложения. Кроме того концентрат образца с помощью столбца спин с 100000 MWCO PES фильтр > 1,5 мг / мл, осадок его, смешивая его с насыщенным сульфат аммония скорректирована до pH 8.0 (1.2 x тома) и хранить при 4 ° C.

Результаты

Типичный очистки (рис. 1) начинается с митохондриальных везикулы (mitoplasts), изолированные на Percoll градиент от hypotonically лизированных 1 х 1011 11 procyclic 2 x 10 т. brucei клетки25 культивировали в стандарте Глюкоза богатые SDM-79 средних

Обсуждение

Протокол для F1-АТФазы очистки от т. brucei был разработан на основе опубликованных ранее методы для изоляции F1-АТФазы комплексы от других видов13,14. Метод не требует каких-либо генетические модификации (например, маркировка) и дает полно?...

Раскрытие информации

Авторы не имеют ничего сообщать.

Благодарности

Эта работа финансировалась министерством образования КЧП CZ Грант LL1205, Грант Грант агентства Чешской Республики 18-17529S и ЕФРР/ПФ проекта центр исследований патогенности и вирулентности паразитов (No. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)ApplichemA0948
Amastatin HydrochlorideGlantham Life SciencesGA1330
Aminocaproic AcidApplichemA2266
BCA Protein Assay KitThermoFischer Scientific/Pierce23225
Benzamidine HydrochlorideCalbiochem199001
Bestatin HydrochlorideSigma Aldrich/MerckB8385
ChloroformAny supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-freeRoche4693159001Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)Any supplier
Hydrochloric AcidAny supplierFor pH adjustment
Ile-Pro-IleSigma Aldrich/MerckI9759Alias Diprotin A
LeupeptinSigma Aldrich/MerckL2884
Magnesium Sulfate HeptahydrateAny supplier
Pepstatin ASigma Aldrich/MerckP5318
Protein Electrophoresis SystemAny supplier
Sodium ChlorideAny supplier
SucroseAny supplier
TrisAny supplier
NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, PolyallomerBeckman Coulture328874
DounceTissues Homogenizer 2 mLAny supplier
Glass Vacuum Filtration DeviceSartorius516-7017Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mLGE Healthcare Life Sciences17115401Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mmSartorius18406--47------NDegasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences29091596Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PESSartoriusVS0641
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
AKTA Pure 25GE Healthcare Life Sciences29018224Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601ShimadzuOr similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti RotorBeckman CoultureOr similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000BioLogics0-127-0001Or similar ultrasonic homogenizer

Ссылки

  1. Walker, J. E., Wikström, M. Structure, mechanism and regulation of ATP synthases. Mechanisms of Primary Energy Transduction in Biology. , 338-373 (2017).
  2. Pullman, M. E., Penefsky, H. S., Datta, A., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. I. Purification and properties of soluble dinitrophenol-stimulated adenosine triphosphatase. The Journal of Biological Chemistry. 235, 3322-3329 (1960).
  3. Schatz, G., Penefsky, H. S., Racker, E. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. XIV. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2552-2560 (1967).
  4. Racker, E., Horstman, L. L. Partial resolution of the enzymes catalyzing oxidative phosphorylation. 13. Structure and function of submitochondrial particles completely resolved with respect to coupling factor. The Journal of Biological Chemistry. 242 (10), 2547-2551 (1967).
  5. Senior, A. E., Brooks, J. C. Studies on the mitochondrial oligomycin-insensitive ATPase. I. An improved method of purification and the behavior of the enzyme in solutions of various depolymerizing agents. Archives of Biochemistry and Biophysics. 140 (1), 257-266 (1970).
  6. Tzagoloff, A., Meagher, P. Assembly of the mitochondrial membrane system. V. Properties of a dispersed preparation of the rutamycin-sensitive adenosine triphosphatase of yeast mitochondria. The Journal of Biological Chemistry. 246 (23), 7328-7336 (1971).
  7. Beechey, R. B., Hubbard, S. A., Linnett, P. E., Mitchell, A. D., Munn, E. A. A simple and rapid method for the preparation of adenosine triphosphatase from submitochondrial particles. Biochemical Journal. 148 (3), 533-537 (1975).
  8. Tyler, D. D., Webb, P. R. Purification and properties of the adenosine triphosphatase released from the liver mitochondrial membrane by chloroform. Biochemical Journal. 178 (2), 289-297 (1979).
  9. Hack, E., Leaver, C. J. The alpha-subunit of the maize F1-ATPase is synthesised in the mitochondrion. The EMBO Journal. 2 (10), 1783-1789 (1983).
  10. Dunn, P. P., Slabas, A. R., Moore, A. L. Purification of F1-ATPase from cuckoo-pint (Arum maculatum) mitochondria. A comparison of subunit composition with that of rat liver F1-ATPase. Biochemical Journal. 225 (3), 821-824 (1985).
  11. Satre, M., Bof, M., Vignais, P. V. Interaction of Escherichia coli adenosine triphosphatase with aurovertin and citreoviridin: inhibition and fluorescence studies. Journal of Bacteriology. 142 (3), 768-776 (1980).
  12. Abrahams, J. P., Leslie, A. G., Lutter, R., Walker, J. E. Structure at 2.8 Å resolution of F1ATPase from bovine heart mitochondria. Nature. 370 (6491), 621-628 (1994).
  13. Lutter, R., et al. Crystallization of F1-ATPase from bovine heart mitochondria. Journal of Molecular Biology. 229 (3), 787-790 (1993).
  14. Kabaleeswaran, V., Puri, N., Walker, J. E., Leslie, A. G., Mueller, D. M. Novel features of the rotary catalytic mechanism revealed in the structure of yeast F1-ATPase. The EMBO Journal. 25 (22), 5433-5442 (2006).
  15. Shirakihara, Y., et al. Structure of a thermophilic F1-ATPase inhibited by an epsilon-subunit: deeper insight into the epsilon-inhibition mechanism. The FEBS Journal. 282 (15), 2895-2913 (2015).
  16. Stocker, A., Keis, S., Cook, G. M., Dimroth, P. Purification, crystallization, and properties of F1-ATPase complexes from the thermoalkaliphilic Bacillus sp. strain TA2.A1. Journal of Structural Biology. 152 (2), 140-145 (2005).
  17. Ferguson, S. A., Cook, G. M., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Regulation of the thermoalkaliphilic F1-ATPase from Caldalkalibacillus thermarum. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (39), 10860-10865 (2016).
  18. Cataldi de Flombaum, M. A., Frasch, A. C. C., Stoppani, A. O. M. Adenosine triphosphatase from Trypanosoma cruzi: purification and properties. Comparative Biochemistry and Physiology Part B: Comparative Biochemistry. 65 (1), 103-109 (1980).
  19. Williams, N., Frank, P. H. The mitochondrial ATP synthase of Trypanosoma brucei: isolation and characterization of the intact F1 moiety. Molecular and Biochemical Parasitology. 43 (1), 125-132 (1990).
  20. Higa, A. I., Cazzulo, J. J. Mg2+-activated adenosine triphosphatase from Crithidia fasciculata: purification and inhibition by suramin and efrapeptin. Molecular and Biochemical Parasitology. 3 (6), 357-367 (1981).
  21. Walker, J. E., et al. Primary structure and subunit stoichiometry of F1-ATPase from bovine mitochondria. Journal of Molecular Biology. 184 (4), 677-701 (1985).
  22. Mueller, D. M., et al. Ni-chelate-affinity purification and crystallization of the yeast mitochondrial F1-ATPase. Protein Expression and Purification. 37 (2), 479-485 (2004).
  23. Gahura, O., et al. The F1-ATPase from Trypanosoma brucei is elaborated by three copies of an additional p18-subunit. The FEBS Journal. 285 (3), 614-628 (2018).
  24. Montgomery, M. G., Gahura, O., Leslie, A. G. W., Zikova, A., Walker, J. E. ATP synthase from Trypanosoma brucei has an elaborated canonical F1-domain and conventional catalytic sites. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (9), 2102-2107 (2018).
  25. Schneider, A., Charriere, F., Pusnik, M., Horn, E. K. Isolation of mitochondria from procyclic Trypanosoma brucei. Methods in Molecular Biology. 372, 67-80 (2007).
  26. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical Biochemistry. 150 (1), 76-85 (1985).
  27. Wirtz, E., Leal, S., Ochatt, C., Cross, G. A. A tightly regulated inducible expression system for conditional gene knock-outs and dominant-negative genetics in Trypanosoma brucei. Molecular and Biochemical Parasitology. 99 (1), 89-101 (1999).
  28. Speijer, D., et al. Characterization of the respiratory chain from cultured Crithidia fasciculata. Molecular and Biochemical Parasitology. 85 (2), 171-186 (1997).
  29. Nelson, R. E., Aphasizheva, I., Falick, A. M., Nebohacova, M., Simpson, L. The I-complex in Leishmania tarentolae is an uniquely-structured F1-ATPase. Molecular and Biochemical Parasitology. 135 (2), 221-224 (2004).
  30. Carbajo, R. J., et al. How the N-terminal domain of the OSCP subunit of bovine F1Fo-ATP synthase interacts with the N-terminal region of an alpha subunit. Journal of Molecular Biology. 368 (2), 310-318 (2007).
  31. Bowler, M. W., Montgomery, M. G., Leslie, A. G., Walker, J. E. Ground state structure of F1-ATPase from bovine heart mitochondria at 1.9 Å resolution. The Journal of Biological Chemistry. 282 (19), 14238-14242 (2007).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

143F1Trypanosoma brucei

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены