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Resumo

Este protocolo descreve a purificação de F1-ATPase do palco inseto cultivado de Trypanosoma brucei. O procedimento produz um complexo altamente puro, homogêneo e ativo adequado para estudos estruturais e enzimáticos.

Resumo

F1-ATPase é uma membrana-extrínseco subcomplex catalítico de F-tipo ATP sintase, uma enzima que utiliza a força motriz protónica através das membranas biológicas para produzir adenosina trifosfato (ATP). O isolamento do intacta F1-ATPase da sua nascente nativo é um pré-requisito essencial para caracterizar a enzima composição de proteína, parâmetros cinéticos e sensibilidade aos inibidores. Um altamente pura e homogênea F1-ATPase pode ser usada para estudos estruturais, que fornecem a introspecção do mecanismo molecular da síntese de ATP e hidrólise. Este artigo descreve um procedimento para a purificação do F1-ATPase de Trypanosoma brucei, o agente causador da trypanosomiases africanos. A F-1-ATPase é isolada de vesículas mitocondriais, que são obtidas por lise hipotónica de tripanosomas em vitro cultivadas. As vesículas são mecanicamente fragmentadas por sonication e o F1-ATPase é liberada a partir da membrana mitocondrial interna pela extração de clorofórmio. O complexo enzimático é mais purificado por aniões consecutivos e cromatografia de exclusão de tamanho. Técnicas de espectrometria de massa sensível mostraram que o complexo purificado é desprovido de praticamente qualquer contaminantes de proteína e, portanto, representa o material adequado para a determinação de estrutura por cristalografia de raios x ou microscopia cryo-elétron. O isolado F1-ATPase apresenta atividade hidrolítica de ATP, que pode ser totalmente inibida por azida sódica, um inibidor potente do F-tipo ATP sintases. O complexo purificado permanece estável e ativo pelo menos três dias à temperatura ambiente. Precipitação de sulfato de amônio é usada para o armazenamento a longo prazo. Procedimentos semelhantes têm sido utilizados para a purificação de F1- ATPase de tecidos de mamíferos e vegetais, leveduras ou bactérias. Assim, o protocolo apresentado pode servir como uma diretriz para a F-1-isolamento de ATPase de outros organismos.

Introdução

Os F-tipo ATP sintases estão ligados a membrana rotativa complexos Multiproteicos translocação de prótons que casal entre energia-transducing membranas de cloroplastos, mitocôndrias e bactérias com a formação de ATP. Detalhes moleculares do mecanismo rotacional da síntese de ATP são conhecidos principalmente por causa de estudos estruturais de purificado bacteriana e mitochondrial ATP sintases e seus subcomplexes1. F-tipo ATP sintase está organizado em partes da membrana-intrínsecos e extrínsecos-membrana. A parte da membrana-extrínseco, conhecida como F1-ATPase, contém três sites catalíticos, onde ocorre a fosforilação de difosfato de adenosina (ADP) para ATP ou a reação inversa. F1-ATPase pode ser libertada experimentalmente o moiety intrínsecas da membrana mantendo sua capacidade de hidrolisar, mas não sintetizar, ATP. O setor de membrana-limite, chamado Fó, Medeia a translocação da proteína, que leva a rotação da parte central da enzima. Os setores deó de F e F1 são conectados pelos talos centrais e periféricos.

O primeiro tenta purificar o F1-ATPase do fermento de brotamento e coração bovinos mitocôndrias data voltar à década de 1960. Estes protocolos usados extraído de mitocôndrias, que foram interrompidas pelo sonication, fracionado por precipitação de sulfato de amônio ou protamina, seguida da execução opcional cromatografia e tratamento térmico2,3,4 ,5,6. A purificação foi grandemente melhorada e simplificada pelo uso de clorofórmio, que prontamente libera o F1-ATPase da membrana mitocondrial fragmentos7. A extração de clorofórmio foi então usada para extrair F1- ATPase de vários animal, vegetal e bacterianas fontes (por exemplo, fígado de ratos8, milho9, Arum maculatum10e Escherichia coli 11). Mais purificação do clorofórmio-lançado F1-ATPase por cromatografia de afinidade ou tamanho-exclusão (SEC) rendeu uma proteína altamente pura complexa, que era adequada para a determinação da estrutura de alta resolução por cristalografia de raios x, como documentado pelas estruturas de F1-ATPase de coração bovino12,13 e Saccharomyces cerevisiae14. F1-estruturas de ATPase determinaram-se também de organismos que são difíceis de cultivar e, assim, a quantidade de matéria biológica inicial foi limitada. Neste caso, a F-1-subunidades ATPase foram artificialmente expressa e montados para o complexo em e. coli, e a enzima heteróloga toda foi purificada por afinidade cromatografia através de uma subunidade marcada. Tal abordagem levou à determinação de F1-estruturas de ATPase de duas espécies de bactérias termofílicas, Geobacillus stearothermophilus15 e Caldalkalibacillus thermarum16, 17. no entanto, esta metodologia é bastante inadequada para eucariontes F1- ATPase desde que baseia-se no aparelho protheosynthetic procarióticas, processamento pós-traducional e montagem complexa.

A extração baseado em clorofórmio foi usada anteriormente para isolar F1- ATPase de digenetic unicelulares parasitas Trypanosoma cruzi18 e T. brucei19, importantes patógenos mamíferos causando americano e Trypanosomiases africanos, respectivamente e de monogénicas inseto parasita Crithidia fasciculata20. Estas purificações levaram apenas para uma simples descrição do F1- ATPase, desde que não há aplicações a jusante foram usadas para caracterizar plenamente a composição, estrutura e propriedades enzimáticas do complexo. Este artigo descreve um método otimizado para F1-purificação ATPase desde a fase do ciclo de vida de inseto culta de T. brucei. O método é desenvolvido com base em protocolos estabelecidos para isolamento de bovinos e levedura F1- ATPase21,22. O procedimento produz altamente pura e homogênea enzima apropriada para em vitro enzimática e inibitórios ensaios, caracterização detalhada proteomic por espectrometria de massa23e de determinação de estrutura24. O protocolo de purificação e o conhecimento da F1-estrutura ATPase do nível atômico abre uma possibilidade para a concepção de telas para identificar inibidores da pequeno-molécula e ajuda no desenvolvimento de novas drogas contra trypanosomiases africanos. Além disso, o protocolo pode ser adaptado para purificar F1-ATPase de outros organismos.

Protocolo

1. buffers e soluções

  1. Prepare as soluções listadas abaixo. Desgaseifica todos os buffers para cromatografia líquida. Adicione inibidores da protease, Benzamidina e ADP imediatamente antes da utilização.
    1. Prepare o tampão de tampão a: 50 mM Tris com ácido clorídrico (Tris-HCl) pH 8.0, 0,25 M de sacarose, Benzamidina de 5 mM, 5 mM aminocaproico ácido (ACA) e protease inibidores (10 µM amastatin, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatin, 50 leupeptin µM e 50 µM diprotin A).
    2. Prepare o tampão b: 50 mM Tris-HCl pH 8.0, 0,25 M de sacarose, ácido de 4mm ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), Benzamidina 5 mM, 5 mM ACA, 1mm ADP e ao inibidores de protease (10 µM amastatin, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatin, 50 leupeptin µM e 50 µM diprotin A).
    3. Preparar o tampão de Q-coluna: 20 mM Tris-HCl pH 8.0, 4 mM de EDTA, 10 mM de MgSO4, 5mm benzamidina, 5mm ACA e 1 mM ADP.
    4. Preparar o tampão de eluição de Q-coluna: buffer de Q-coluna com 1 M de NaCl.
    5. Preparar o tampão do SEC: pH 20 mM Tris-HCl 8.0, 10 mM de MgSO4, 100 mM de NaCl, 1 mM ADP.
    6. Prepare o clorofórmio saturado com 2 M Tris-HCl pH 8,5. Misture o clorofórmio com 2 M Tris-HCl pH 8,5 em aproximadamente a proporção 1:1 em um frasco de tampa de rosca, agitar, deixar as fases orgânicas e aquosas separadas e medir o pH na camada aquosa superior com uma tira de papel indicador de pH. Armazenar em temperatura ambiente. Imediatamente antes da utilização, agitar novamente e deixe as fases separadas. Use a camada inferior de clorofórmio.
      Cuidado: Clorofórmio é volátil e irritante para os olhos e pele. Trabalho em uma coifa. Use óculos de segurança quando a tremer.

2. preparação de partículas submitocondrial

  1. Resuspenda vesículas mitocondriais (mitoplasts) isoladas por lise hipotónica25 de 1 x 1011 a 2 x 1011 células de procyclic T. brucei em 5 mL de tampão gelada r. manter a amostra refrigerada até o passo 3.2.
  2. Determine a concentração de proteína na suspensão pelo bicinchoninic ácido (BCA) proteína ensaio26 de acordo com as instruções do fabricante.
    1. Use uma série de diluições de albumina de soro bovino (BSA) em água ultrapura para construir a curva padrão. Dilua uma pequena quantidade de amostra 20 - 100 vezes com água ultrapura para encaixar nos padrões da gama de BSA.
    2. Calcular a quantidade de proteína total na amostra e trazer a concentração de proteína de 16 mg/mL, diluindo-lo com buffer adicionais A.
  3. Fragmentar mitoplasts em vesículas invertidas e pedaços de membrana por sonication da suspensão 7 x 15 s com uma energia total de 70 a 100 J por impulso com um microtip de 3,9 mm de diâmetro. Se o homogenizador Ultrassônico não exibir a saída de energia, comece a otimização em 50% da potência máxima. Incubar a amostra em gelo por 30 s entre impulsos. Após o sonication, a suspensão torna-se um pouco mais escura.
  4. Fragmentos de sedimentos da membrana por ultracentrifugação a 54.000 x g, durante 16 h ou a 98.000 x g, durante 5 h a 4 ° C. Decante o sobrenadante e prosseguir com a extração de clorofórmio, ou congelam o sedimento em nitrogênio líquido e armazená-lo a-80 ° C.

3. liberação de F1-ATPase de membrana por clorofórmio

  1. Resuspenda o pellet de membranas mitocondriais em buffer B com o auxílio de um pequena homogenizacao homogenizador. Calcular o volume de tampão B com base no montante total do buffer de um usado na fórmula de passos 2.1 e 2.2, usando o seguinte: volume (tampão B) = volume (tampão A) x 12/21. Transferi a suspensão para um tubo cônico de 15 ou 50 mL.
  2. Retire a amostra de gelo e, de agora em diante, manter a amostra e todas as soluções para ser usado em temperatura ambiente.
  3. Adicionar clorofórmio saturado com 2 M Tris-HCl pH 8,5; o volume de clorofórmio a ser adicionado é igual a metade do volume da suspensão. Feche a tampa firmemente. Agitá-lo vigorosamente para exatamente 20 s. centrifugá-lo imediatamente a 8.400 x g durante 5 min à temperatura ambiente.
  4. Transferi a fase aquosa superior nublada para microtubos de 1,6 mL. Adicione inibidores de protease (10 µM amastatin, 50 µM Bestatina, 50 µM pepstatin, 50 leupeptin µM e 50 µM diprotin A) para substituir os inibidores removidos pelo tratamento clorofórmio. Centrifugar as amostras a 13.000 x g durante 30 min à temperatura ambiente. Transferir o sobrenadante para microtubos frescos e repetir a centrifugação para remover qualquer material insolúvel.

4. permutadora cromatografia

  1. Equilibrar a coluna de troca (Q) 5 mL ânion conectada a um sistema de cromatografia líquida de rápido-proteína com o buffer Q-coluna a uma taxa de fluxo de 5 mL/min até a absorbância em 280 nm e a condutividade estabilizar (aproximadamente 50 mL de tampão).
  2. Carregar o sobrenadante da etapa 3.3 na coluna equilibrada em uma taxa de fluxo de 1 mL/min. espere até a absorbância em 280 nm estabiliza em segundo plano. Aplica um gradiente linear de 25 mL do buffer Q-coluna eluição de 0% a 100% a uma taxa de fluxo de 0,5 mL/min. coletar frações de 1 mL.
  3. Ensaio as frações individuais correspondente ao pico de eluição principais para a atividade hidrolítica de ATP pelo ensaio Pullman ATPase2 em pH 8.0. Use 10 µ l de cada fração por 1 mL da mistura de reação. As frações que apresentam atividade ATPase do pool. Opcionalmente, separe 10 µ l de cada fração em eletroforese em gel de poliacrilamida fosfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE) e manchar o gel por Coomassie Blue Visualizar individual F1-subunidades ATPase e proteínas contaminantes.
  4. Concentre-se as amostras por ultrafiltração de membrana com uma coluna de rotação com um filtro de PES MWCO 100.000 de 200-500 µ l. proceder à SEC ou loja da amostra durante a noite em temperatura ambiente.

5. tamanho-exclusão cromatografia

  1. Equilibrar a coluna SEC conectada a um sistema de cromatografia líquida pelo menos 48 mL (dois volumes de coluna) do buffer SEC com um caudal de 0,5 mL/min.
  2. Aplique a amostra na coluna e executar cromatografia com um caudal de 0,25 mL/min. coletamos frações de 0,25 mL.
  3. Execute 10 µ l das frações que correspondem aos picos do rastreamento absorvância UV280nm em SDS-PAGE e manchá-las por Coomassie Blue. O primeiro pico principal contém o F1-ATPase. Ensaio as frações correspondentes a este pico para o ATP hidrolítica atividade e azida sensibilidade por ensaio de Pullman ATPase. Determine a concentração de proteína, o ensaio BCA.
  4. Manter o purificada F1-ATPase em temperatura ambiente e usá-lo dentro d 3 após a purificação para aplicações a jusante. Como alternativa, concentrar a amostra com uma coluna de rotação com um filtro de PES MWCO 100.000 > 1,5 mg / ml, precipitado, misturando-o com sulfato de amônio saturado ajustou a pH 8.0 (1.2 x volume) e armazená-lo em 4 ° C.

Resultados

Uma purificação típica (Figura 1) começa com vesículas mitocondriais (mitoplasts) isoladas do gradiente de Percoll de hypotonically lisados 1 x 1011 para 2 x 1011 procyclic T. brucei células25 cultivadas no padrão rico em glicose SDM-79 médio27. Os mitoplasts são fragmentados por sonication, fiado, e o matriz contendo sobrenadante é Descartado. As membranas mitocondriais ...

Discussão

O protocolo para F1-purificação da ATPase de T. brucei foi desenvolvido com base em métodos publicados anteriormente para o isolamento de F1-complexos de ATPase de outras espécies de13,14. O método não requer qualquer modificação genética (por exemplo, marcação) e produz um complexo totalmente ativo com subunidades de todos os presentes. A etapa crucial é o lançamento de clorofórmio-facilitada do F1...

Divulgações

Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pelo Ministério da educação ERC CZ conceder LL1205, o grant Grant agência de República Checa 18-17529S e pelo FEDER/FSE projeto centro de investigação de patogenicidade e virulência de parasitas (n. º CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_019/0000759).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)ApplichemA0948
Amastatin HydrochlorideGlantham Life SciencesGA1330
Aminocaproic AcidApplichemA2266
BCA Protein Assay KitThermoFischer Scientific/Pierce23225
Benzamidine HydrochlorideCalbiochem199001
Bestatin HydrochlorideSigma Aldrich/MerckB8385
ChloroformAny supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-freeRoche4693159001Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)Any supplier
Hydrochloric AcidAny supplierFor pH adjustment
Ile-Pro-IleSigma Aldrich/MerckI9759Alias Diprotin A
LeupeptinSigma Aldrich/MerckL2884
Magnesium Sulfate HeptahydrateAny supplier
Pepstatin ASigma Aldrich/MerckP5318
Protein Electrophoresis SystemAny supplier
Sodium ChlorideAny supplier
SucroseAny supplier
TrisAny supplier
NameCompanyCatalog NumberComments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, PolyallomerBeckman Coulture328874
DounceTissues Homogenizer 2 mLAny supplier
Glass Vacuum Filtration DeviceSartorius516-7017Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mLGE Healthcare Life Sciences17115401Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mmSartorius18406--47------NDegasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GLGE Healthcare Life Sciences29091596Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PESSartoriusVS0641
NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
AKTA Pure 25GE Healthcare Life Sciences29018224Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601ShimadzuOr similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti RotorBeckman CoultureOr similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000BioLogics0-127-0001Or similar ultrasonic homogenizer

Referências

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