Isolation de F1-ATPase de la protiste parasite Trypanosoma brucei

Résumé

Ce protocole décrit la purification de la F₁-ATPase de la scène des insecte de Trypanosoma brucei. La procédure donne un complexe très pur, homogène et actif adapté aux études structurales et enzymatiques.

Résumé

F₁-ATPase est un complexe catalytique membrane extrinsèques de type F ATP synthase, une enzyme qui utilise la force motrice de proton à travers les membranes biologiques pour produire de l’adénosine triphosphate (ATP). L’isolement de l’intact F₁-ATPase de sa source native est une condition essentielle pour caractériser la composition en protéines, les paramètres cinétiques et sensibilité aux inhibiteurs de l’enzyme. Un très pure et homogène F₁-ATPase peut être utilisé pour les études structurales, qui permettent de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la synthèse d’ATP et d’hydrolyse. Cet article décrit une procédure pour la purification de la F₁-ATPase de Trypanosoma brucei, l’agent causal des trypanosomiases africaines. La F₁-ATPase est isolée des vésicules mitochondriales, qui sont obtenus par lyse hypotonique de in vitro cultivée trypanosomes. Les vésicules sont mécaniquement fragmentées par sonication et le F₁-ATPase est libéré de la membrane mitochondriale interne par l’extraction au chloroforme. Le complexe enzymatique est ensuite purifié par échange d’anions consécutives et chromatographie d’exclusion stérique. Techniques de spectrométrie de masse sensible montrent que le complexe purifié est dépourvue de pratiquement tout contaminant de protéine et représente donc un matériau approprié pour la détermination de la structure par diffraction des rayons x ou cryo-microscopie électronique. L’isolé F₁-ATPase présente une activité hydrolytique ATP, qui peut être inhibée totalement de l’azide de sodium, un puissant inhibiteur de type F ATP synthases. Le complexe purifié reste stable et actif pendant au moins trois jours à température ambiante. Précipitation de sulfate d’ammonium est utilisée pour le stockage à long terme. Des procédures similaires ont été utilisées pour la purification de F₁- ATPases de tissus de mammifères et de plantes, de levures ou de bactéries. Ainsi, le protocole présenté peut servir de modèle pour la F₁-isolement ATPase provenant d’autres organismes.

Introduction

Les type F ATP synthases sont membranaires tournantes complexes multiprotéiques que la translocation de protons couple à travers les membranes transduction de l’énergie des bactéries, des mitochondries et chloroplastes avec la formation d’ATP. Les détails moléculaires du mécanisme de rotation de la synthèse d’ATP sont connus principalement en raison des études structurales de purifiée bactérienne et mitochondrial ATP synthases et leurs subcomplexes¹. F-type ATP synthase est organisé dans les fractions membranaires intrinsèques et extrinsèques à la membrane. La partie membranaire-extrinsèque, appelée F₁-ATPase, contient trois sites catalytiques, où la phosphorylation de l’adénosine diphosphate (ADP) à ATP ou la réaction inverse se produit. F₁-ATPase peut être libéré expérimentalement la portion membranaires intrinsèques tout en conservant sa capacité à hydrolyser, mais pas synthétiser, ATP. Le secteur de membrane-bondissent, dénommé F_o, intervient dans la translocation de la protéine, qui entraîne la rotation de la partie centrale de l’enzyme. Les secteurs de_o F et de F₁ sont reliés par des tiges centrales et périphériques.

La première tente de purifier le F₁-ATPase de la levure de bière et de la date de mitochondries de coeur de boeuf vers les années 1960. Ces protocoles utilisés extraites des mitochondries, qui ont été perturbées par la sonication, fractionnée par précipitation au sulfate d’ammonium ou de protamine, suivie par chromatographie facultatif étapes et traitement thermique^{2,3,4 ,5,6}. La purification a été grandement améliorée et simplifiée par l’utilisation du chloroforme, qui libère facilement le F₁-ATPase de la membrane mitochondriale des fragments⁷. L’extraction de chloroforme a ensuite été utilisée pour extraire des F₁- ATPases de divers animaux, végétaux et des sources bactériennes (p. ex., foie de rat⁸, maïs⁹, Arum maculatum¹⁰et Escherichia coli ¹¹). Outre la purification du chloroforme-sortie F₁-ATPase par chromatographie d’affinité ou exclusion stérique (SEC) a produit une protéine pure hautement complexe, qui convenait pour la détermination de la structure à haute résolution par cristallographie aux rayons x, comme documenté par les structures de F₁-ATPase de coeur bovine^12,13 et¹⁴de la Saccharomyces cerevisiae. F₁-ATPase structures ont été également déterminées d’organismes qui sont difficiles à cultiver et, par conséquent, la quantité de la matière biologique initiale était limitée. Dans ce cas, le F₁-ATPase sous-unités ont été artificiellement exprimées et assemblées dans le complexe chez e. coli, et l’ensemble hétérologue enzyme a été purifiée par affinité Chromatographie via une sous-unité étiquetée. Cette approche a conduit à la détermination de F₁-structures de l’ATPase de deux espèces de bactéries thermophiles, Geobacillus stearothermophilus¹⁵ et thermarum Caldalkalibacillus^{16, 17}. Toutefois, cette méthode est plutôt impropre à eucaryotes F₁- ATPases puisqu’elle s’appuie sur l’appareil protheosynthetic procaryote, transformation post-traductionnelle et assemblage complexe.

L’extraction axée sur le chloroforme a été précédemment utilisée pour isoler F₁- ATPases de digène unicellulaires parasites Trypanosoma cruzi¹⁸ et T. brucei¹⁹, importants pathogènes chez les mammifères d’Amérique et Les trypanosomiases africaines, respectivement et de monogénique insecte parasite Crithidia fasciculata²⁰. Ces purifications conduit seulement à une simple description de la F₁- ATPases, puisqu’aucune demande en aval ont été utilisées pour caractériser complètement la composition, structure et propriétés enzymatiques du complexe. Cet article décrit une méthode optimisée pour F₁-purification de l’ATPase de l’étape de cycle de vie insectes cultivées de T. brucei. La méthode est élaborée selon les protocoles établis pour l’isolement de bovins et la levure F₁- ATPases^21,22. La procédure donne très pure et homogène enzyme appropriée pour in vitro enzymatiques et inhibiteur des dosages, protéomiques détaillées caractérisation par spectrométrie de masse²³et de détermination de structure²⁴. Le protocole de purification et de la connaissance de la F₁-structure de l’ATPase au niveau atomique ouvre une possibilité pour la conception d’écrans pour identifier les inhibiteurs de petites molécules et aider au développement de nouveaux médicaments contre les trypanosomiases africaines. En outre, le protocole peut être adapté pour purifier F₁-ATPase provenant d’autres organismes.

Protocole

1. tampons et Solutions

1. Préparer les solutions énumérées ci-dessous. Une solution contenant toutes les mémoires tampons pour chromatographie en phase liquide. Ajouter juste avant l’utilisation des inhibiteurs de ADP, benzamidine et protéase.
   1. Préparer un tampon tampon A: 50 mM Tris avec l’acide chlorhydrique (Tris-HCl) pH 8,0, 0,25 M de sucrose, benzamidine 5 mM, 5 mM, inhibiteurs d’acide (ACA) et protéase aminocaproïque (10 µM amastatine 50 µM bestatine, 50 µM pepstatine, 50 µM leupeptine et 50 µM diprotin A).
   2. Préparer le tampon B: 50 millimètres Tris-HCl pH 8,0, 0,25 M de sucrose, l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) de 4 mM, benzamidine 5 mM, 5 mM ACA, 1 mM ADP et inhibiteurs de la protéase (10 µM amastatine 50 µM bestatine, 50 µM pepstatine, 50 µM leupeptine et 50 µM diprotin A).
   3. Préparer le tampon Q-colonne : 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 4 mM EDTA, 10 mM MgSO₄, benzamidine 5 mM, 5 mM ACA et 1 mM ADP.
   4. Préparer le tampon d’élution Q-colonne : tampon Q-colonne avec 1 M NaCl.
   5. Préparer le tampon SEC : 20 millimètres Tris-HCl pH 8,0, 10 mM MgSO₄, 100 mM NaCl, 1 mM ADP.
   6. Préparer le chloroforme imprégnée de 2 M Tris-HCl pH 8,5. Mélange de chloroforme avec 2 M Tris-HCl pH 8,5 à environ 1:1 ratio dans un flacon à bouchon vissé, agiter, laisser les phases organiques et aqueuses séparées et mesurer le pH de la couche aqueuse supérieure avec une bande de papier indicateur de pH. Conserver à température ambiante. Juste avant utilisation, agiter à nouveau et laisser les phases distinctes. Utiliser la couche inférieure de chloroforme.
      Attention : Le chloroforme est volatile et irritant pour les yeux et la peau. Travailler sous une hotte. Utiliser des lunettes de sécurité lors de la secouant.

2. préparation des particules sub-mitochondriale

1. Remettre en suspension les vésicules mitochondriales (mitoplasts) isolées par lyse hypotonique²⁵ de 1 x 10¹¹ à 2 x 10¹¹ cellules de procycliques T. brucei dans 5 mL de tampon glacee A. garder l’échantillon réfrigéré jusqu'à l’étape 3.2.
2. Déterminer la concentration de protéines dans la suspension par le bicinchoninic acide (BCA) protéine test²⁶ selon les instructions du fabricant.
   1. Utiliser une série de dilutions de l’albumine sérique bovine (BSA) dans de l’eau ultrapure pour construire la courbe d’étalonnage. Diluer une petite quantité d’échantillon de 20 à 100 fois avec de l’eau ultrapure à s’intégrer dans les normes de la gamme de BSA.
   2. Calculer la quantité de protéines totales dans l’échantillon et abaisser la concentration de protéine à 16 mg/mL en diluant il avec tampon supplémentaire A.
3. Fragment de mitoplasts en vésicules inversées et de morceaux de membrane par sonication de la suspension 7 x 15 s avec une énergie totale de 70 à 100 J par impulsion avec un microtip de 3,9 mm de diamètre. Si l’homogénéisateur ultrasonique n’affiche pas la production d’énergie, démarrer l’optimisation à 50 % de la puissance maximale. Incuber l’échantillon sur la glace pendant 30 s entre les impulsions. Après la sonication, la suspension devient légèrement plus foncée.
4. Sédiments de la membrane des fragments par ultracentrifugation à 54 000 x g pendant 16 h ou à 98 000 x g pendant 5 h à 4 ° C. Éliminer le surnageant et procéder à l’extraction de chloroforme, ou flash-gel le sédiment dans l’azote liquide et conserver à-80 ° C.

3. sortie du F₁-ATPase de la Membrane par le chloroforme

1. Resuspendre le culot des membranes mitochondriales dans tampon B à l’aide d’un petit homogénisateur Dounce. Calculer le volume de tampon B basé sur la quantité totale de mémoire tampon utilisée en formule étapes 2.1 et 2.2 en utilisant ce qui suit : volume (tampon B) = volume (tampons A) x 12/21. Transférer la suspension dans un tube conique 15 ou 50 mL.
2. Retirer l’échantillon de glace et, par la suite, garder l’échantillon et toutes les solutions pour être utilisé à température ambiante.
3. Ajouter chloroforme imprégnée de 2 M Tris-HCl pH 8,5 ; le volume du chloroforme à ajouter est égale à la moitié du volume de la suspension. Bien refermer le bouchon. Agiter vigoureusement pendant exactement 20 s. il centrifuger immédiatement à 8 400 g pendant 5 min à température ambiante.
4. Transférer la phase aqueuse nuageuse supérieure à 1,6 mL microtubes. Ajouter des inhibiteurs de la protéase (10 µM amastatine, 50 µM bestatine, 50 µM pepstatine, 50 µM leupeptine et 50 µM diprotin A) pour remplacer les inhibiteurs éliminés par le traitement de chloroforme. Centrifuger les échantillons à 13 000 x g pendant 30 min à température ambiante. Transférer le surnageant pour microtubes fraîches et répétez la centrifugation pour enlever toute matière insoluble.

4. échange d’anions par chromatographie

1. Équilibrer la colonne d’échangeurs (Q) 5 mL anion attachée à un système de chromatographie liquide rapide-protéine avec le tampon de Q-colonne à un débit de 5 mL/min jusqu'à ce que l’absorbance à 280 nm et la conductivité stabilisent (environ 50 mL de tampon).
2. Charger le surnageant à l’étape 3.3 sur la colonne équilibrée à un débit de 1 mL/min. Attendez jusqu'à ce que l’absorbance à 280 nm se stabilise à l’arrière-plan. Appliquer un dégradé linéaire de 25 mL de la mémoire tampon d’élution Q-colonne de 0 % à 100 % à un débit de 0,5 mL/min. frais virés fractions de 1 mL.
3. Dosage des fractions individuelles correspondant au pic majeur d’élution pour activité hydrolytique de l’ATP par l’ATPase Pullman dosage² à pH 8,0. Utiliser 10 µL de chaque fraction par 1 mL du mélange réactionnel. Mettre en commun les fractions qui présentent une activité ATPasique. Éventuellement, séparer de 10 µL de chaque fraction sur gel de polyacrylamide électrophorèse SDS phosphate (SDS-PAGE) et tacher le gel par le bleu de Coomassie pour visualiser chaque F₁-sous-unités ATPase et protéines contaminantes.
4. Concentré de l’échantillon groupé par ultrafiltration membranaire en utilisant une colonne avec un filtre MWCO PES 100 000 à 200-500 µL. passer à SEC ou au magasin de l’échantillon pendant une nuit à température ambiante.

5. exclusion stérique

1. Equilibrer la colonne SEC attachée à un système de chromatographie en phase liquide avec au moins 48 mL (deux volumes de colonne) du tampon SEC à un débit de 0,5 mL/min.
2. Déposer l’échantillon sur la colonne et exécutez-le chromatographie d’un débit de 0,25 mL/min. fractions de 0,25 mL virées.
3. Exécutez 10 µL des fractions qui correspondent aux sommets de la trace d’absorbance UV_280nm sur SDS-PAGE et leur tache de bleu de Coomassie. Le premier pic majeur contient le F₁-ATPase. Doser les fractions correspondant à ce sommet pour la sensibilité hydrolytique de l’activité et azoture ATP par le dosage de l’ATPase de Pullman. Déterminer la concentration de protéine par le dosage de la BCA.
4. Garder les purifiés F₁-ATPase à température ambiante et l’utiliser au bout de 3 jours après purification pour applications en aval. Vous pouvez également concentrer l’échantillon en utilisant une colonne avec un filtre de 100 000 MWCO PES à > 1,5 mg / mL, précipité il en le mélangeant avec saturée de sulfate d’ammonium ajusté à pH 8,0 (1. 2 x le volume) et conserver à 4 ° C.

Résultats

Une purification typique (Figure 1) commence par des vésicules mitochondriales (mitoplasts) isolés sur le gradient de Percoll du mi-prophase lysé 1 x 10¹¹ à 2 x 10¹¹ procycliques de cellules de T. brucei ²⁵ cultivés dans la norme riche en glucose moyen SDM-79²⁷. Les mitoplasts sont fragmentées par sonication, filée, et le surnageant contenant de matrice est ignoré. Les memb...

Discussion

Le protocole pour F₁-purification de l’ATPase de T. brucei a été développé sur la base des méthodes publiées antérieurement pour l’isolement des F₁-complexes de l’ATPase d’autres espèces^13,14. La méthode ne requiert pas une modification génétique (p. ex., marquage) et conduit un complexe actif complet avec toutes les sous-unités présents. L’étape cruciale est la libération de chloroforme-facilité d...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals
Adenosin Diphosphate Disodium Salt (ADP)	Applichem	A0948
Amastatin Hydrochloride	Glantham Life Sciences	GA1330
Aminocaproic Acid	Applichem	A2266
BCA Protein Assay Kit	ThermoFischer Scientific/Pierce	23225
Benzamidine Hydrochloride	Calbiochem	199001
Bestatin Hydrochloride	Sigma Aldrich/Merck	B8385
Chloroform	Any supplier
cOmplete Tablets, Mini EDTA-free	Roche	4693159001	Protease inhibitor cocktail tablets
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Any supplier
Hydrochloric Acid	Any supplier		For pH adjustment
Ile-Pro-Ile	Sigma Aldrich/Merck	I9759	Alias Diprotin A
Leupeptin	Sigma Aldrich/Merck	L2884
Magnesium Sulfate Heptahydrate	Any supplier
Pepstatin A	Sigma Aldrich/Merck	P5318
Protein Electrophoresis System	Any supplier
Sodium Chloride	Any supplier
Sucrose	Any supplier
Tris	Any supplier
Name	Company	Catalog Number	Comments
Consumables
Centrifuge Tubes for SW60Ti, Polyallomer	Beckman Coulture	328874
DounceTissues Homogenizer 2 mL	Any supplier
Glass Vacuum Filtration Device	Sartorius	516-7017	Degasing solutions for liquid chromatography
HiTrap Q HP, 5 mL	GE Healthcare Life Sciences	17115401	Anion exchange chromatography column
Regenaretad Cellulose Membrane Filters, pore size 0.45 μm, diameter 47 mm	Sartorius	18406--47------N	Degasing solutions for liquid chromatography
Superdex 200 Increase 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	29091596	Size-exclusion chromatography column
Vivaspin 6 MWCO 100 kDa PES	Sartorius	VS0641
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
AKTA Pure 25	GE Healthcare Life Sciences	29018224	Or similar FPLC system
Spectrophotometer Shimadzu UV-1601	Shimadzu		Or similar spectrophotometer with kinetic assay mode
Ultracentrifuge Beckman Optima with SW60Ti Rotor	Beckman Coulture		Or similar ultracentrifuge and rotor
Ultrasonic Homogenizer with Thin Probe, Model 3000	BioLogics	0-127-0001	Or similar ultrasonic homogenizer