マウス頭蓋組織および非除電骨の組織調製と免疫染色

要約

ここでは、マウス頭蓋組織を例に免疫染色することにより、頭蓋顔面形態/病因の間のタンパク質レベルを検出し、定量するための詳細なプロトコルを提示する。また、免疫染色のための若いマウスからの非デカル化された硬質組織の調製および凍結切除の方法について説明する。

要約

組織免疫染色は、所定の組織内の目的のタンパク質の非常に特異的で信頼性の高い検出を提供します。ここでは、マウス頭蓋組織を例にした頭蓋骨形成/病因の間にタンパク質発現を検出するための完全で簡単なプロトコルについて説明する。このプロトコルは、組織の調製および凍結切除、間接免疫蛍光、画像取得、および定量化で構成されます。また、免疫染色のための非デカール化硬組織の調製および凍結切除のための方法が記載されており、例として頭蓋顔面組織および長骨を用いる。これらの方法は、頭蓋骨形成/病因の間に様々な組織におけるタンパク質発現および形態学的/解剖学的変化を決定する鍵となる。それらは適切な変更を加える他の組織にも適用可能である。血管学の知識とセクションの高品質は、実験的な結果から科学的な結論を引き出すために重要です。この方法論の潜在的な制限には、抗体の特異性および定量化の困難が含まれるが、これらに限定されない。

概要

顔は人間のアイデンティティの重要な部分であり、上皮、筋肉、骨、軟骨、歯など、いくつかの異なるタイプの組織で構成されています。これらの組織は、外胚芽、内皮、中胚芽1、2の3つの胚芽層すべてに由来する。頭蓋組織の適切なパターン化と開発のためには、細胞増殖、死亡および分化は、Wnt、Fgf、HhおよびBmp経路3、4^{などの特定のシグナル伝達経路によって高度に調整され、調節される必要がある。、5}.細胞の増殖、生存または分化の欠陥は、最も頻繁に発生する先天性先天性欠損の一つである頭蓋骨の奇形につながります。トランスジェニックマウスは、頭蓋骨形成および病態1、2、3、4、5のメカニズムを研究するのに有用なツールである。発達と病因の間の頭蓋の構造の変化を理解することは、主要な発達原理と頭蓋顔面奇形のメカニズムを明らかにするのに役立ちます^1,2,3 、4、⁵.

特定の抗体を用いたマウント全体または断面組織の染色は、目的のタンパク質6の空間分布を決定するための非常に貴重な技術である。正式には、組織免疫染色は、免疫組織化学(IHC)または免疫蛍光(IF)のいずれかに依存することができます。IHCによる3,3'-Diaminobenziジン(DAB)などの発色基板で生成された不透明反応生成物と比較して、IFは蛍光顕微鏡で見える蛍光コンジュゲートの使用を含む。したがって、IFは明らかにポジティブな細胞をバックグラウンドノイズから区別し、ImageJやAdobe Photoshop 7、8などのソフトウェアによって画像を定量的に分析し、強化することができる。全体のマウント染色アプローチは、セクション9、10からの再建を必要とせずにタンパク質/抗原の位置に関する3次元情報を提供することができ、組織の小さなブロック(厚さ5ミリメートル未満)で動作します。.しかし、組織切片と比較して、マウント免疫染色全体は時間がかかり、大量の抗体溶液を必要とします。すべての抗体が基本的なマウントアプローチと互換性があるわけではありません。さらに、抗体の不完全な浸透は、不均一な染色または偽陰性染色をもたらす。ここでは、切除組織上のタンパク質/抗原の免疫蛍光検出に焦点を当てます。硬い組織(例えば、頭部、歯、長骨)の場合、発症/病因の間のカルシウム沈着は、サンプルを切除しにくくし、免疫染色治療^中に容易にすすいでくるぐる。現在利用可能なプロトコルのほとんどは、セクション化を容易にするために埋め込む前に硬い組織をデカール化し、これは時間がかかり、不適切に扱われた場合、サンプルの形態および抗原を破壊する可能性があります^11,12.この問題を克服するために、脱石せずに硬質組織を凍結切除するアプローチを最適化し、その形態の可視化とシグナル伝達タンパク質の分布を改善しました。

ここで説明するプロトコルは、BMPトランスジェニックマウスの頭蓋骨組織における形態学的および組織学的変化を決定するために使用されている。具体的には、プロトコルは、(1)頭部組織の収穫と解剖、(2)実験マーカーの切片および免疫染色(Ki67、pSmad1/5/9)およびTUNEL染色、(3)蛍光顕微鏡を用いた切片のイメージング、および最後に(4)を含む。結果の分析と定量化を行います。デカル化せずに硬質組織を調作および凍結切除するプロトコルも13について説明する。これらの方法は頭蓋顔面組織用に最適化されています。それらはまた適切な修飾が付いているサンプルのさまざまな年齢からの他のティッシュに適用可能である。

プロトコル

すべてのマウス実験は、ミシガン大学のガイドラインに従って、動物の人道的ケアと研究における動物の使用をカバーして行われました。この研究で使用されるすべての動物の手順は、ミシガン大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されました(プロトコル#PRO00007715)。

1. 組織製剤

1. 胚組織の調製
   1. 10cm皿1枚とリン酸緩衝生理食(PBS)を含む3.5cmの皿を1つと、妊娠マウスごとにPBSに2mL 4%パラホルムアルデヒド(PFA)を含む12ウェル培養プレートを1つ用意します。すべてのペトリ皿とプレートを氷の上に置きます。
      注:ヒュームフードで4%PFAを取り扱います。
   2. 前述の14.14のように、妊娠中のマウスから鉗子とはさみで氷冷PBSで胚を解剖する。
      1. 簡単に言えば、CO2で妊娠マウスを安楽死させ、鉗子で腹の中心の下の皮膚をつかみ、皮膚だけを切り取り、その後、腹部の筋肉壁の下からそれを分離するために皮膚を穏やかに引っ張る。
      2. 次に、皮膚切開の同じラインに続いて腹腔に切り込む。胚の文字列を含む子宮を取り除き、子宮壁をそっと切り取って胚を取り除く。黄身嚢やアムニオンなどの胚外組織が除去されます。
      3. 各胚から頭部を切断し、分離する。
   3. プラスチック転写ピペットまたは鉗子で4%のPFAを含む12ウェルプレートの各ウェルに各ヘッドを転送します。4°Cで4°CのPFAで4°Cのサンプルを4°Cで4°Cで洗浄し、4°Cで4°Cのサンプルを12時間の穏やかな振盪で固定します。
      注:胚の日16.5(E16.5)より若い胚の場合は、単離直後に4%のPFAで胚頭を固定する。E16.5以降の胚の場合は、皮膚および脂肪組織を頭部から廃棄し、固定前に氷冷PBSで数回すすいで除去する。
   4. クライオプロテクトヘッド。
      1. プラスチック転写ピペットまたは鉗子を使用してPBSで30%ショ糖の2 mLを含む新しい12ウェルプレートに各ヘッドを転送します。頭が皿の底に沈むまで4°Cで穏やかに攪拌する。
   5. ヘッドを埋め込む。
      1. 凍結保護されたヘッドを最適な切断温度(OCT)化合物を含む金型に移します。OCTで数分間サンプルを平衡化します。鉗子でサンプルの位置と方向を調整します。
      2. ドライアイスの上に金型を置き、凍結させます。クライオセクションの準備ができるまで、-80°Cのビニール袋に得られたクライオモルドを保管してください。
         注:サンプルのトリミングされた側は、埋め込み金型の底部に面している必要があります。
2. 出生後の非デカール化硬組織の調製
   1. CO2で3週間または3ヶ月齢のマウスで安楽死させる。皮膚と脂肪組織を取り除きます。頭や長い骨をマウスから切り取って分離します。
   2. ステップ1.1.3-1.1.4に記載されているように、マウスの頭部または長い骨を修正し、凍結保護する。
   3. ステップ1.1.5と同様の方法で8%ゼラチンに埋め込む。凍結切除まで-80°Cのビニール袋にクライモルドを保管してください。
      注:ここではデカルシングは必要ありません。8%のゼラチンを調分するには、8gのゼラチンを100mLのPBSと混ぜ、電子レンジで沸騰させます。混合物は簡単に沸騰していることに注意してください。

2. クライオ断面

1. クヨスタット温度を、OCTに埋め込まれた軟部組織の場合は-18 °C、ゼラチンに埋め込まれた非割り分けされた硬質組織の場合は-18 °C に設定します。クライオスタット温度に平衡化するために、約30分間クライオスタット室でサンプルを保持します。
2. ブロックをクライモルドから追い出します。OCTドロップで取り付けによって試料チャック(ティッシュホルダー)にブロックを凍結します。サンプルのトリミングされた側面をチャックから最も遠く(オペレータに向かって)に保ちます。
3. ブロックマウントチャックをクライオスタットオブジェクトホルダーにロードします。ブレードホルダーを調整して、ブレードの角度をサンプルに対して3°~5°にします。
4. コーティングされた顕微鏡スライドに10 μmのセクションを集める。RTで完全に乾燥したセクションを、-80 °Cに保存します。

3. 組織染色と顕微鏡イメージング

1. 免疫蛍光染色
   1. -80 °Cからスライドを取り出します。RTで1時間のスライドをエアドライセクションに保管してください。0.1%PBST(PBSのポリエチレングリコールテルトオクチルフェニルエーテル、材料の表を参照)で0.1%のスライドを洗い流し、OCTを洗い流し、セクションを透過します。
   2. 必要に応じて、抗原検索を実行する(オプション)。
      1. クエン酸バッファー(10mMクエン酸ナトリウムpH6)を蒸し器または水浴で95〜100°Cに染色皿に入れます。ク硝子バッファーにスライドを浸し、10分間インキュベートする。
      2. スチーマーや水風呂からRTに染色皿を取り出し、RTで20分^以上15分のスライドを冷却します。
         注:代替手段として、トリス-EDTAバッファー(10 mMトリスベース、1mM EDTA、0.05%ツイーエン20、pH 9.0)またはEDTAバッファー(1mM EDTA、0.05%トウェン20、pH 8.0)を熱誘発抗原回収に使用します。熱スチーマーに加えて、熱誘発抗原検索には圧力鍋、電子レンジ、または水浴を使用してください。トリプシンまたはペプシンを用いて酵素誘発抗原検索は別の選択肢である。有害なセクションを避けるために酵素検索の濃度と治療時間を最適化します。抗体/抗原の組み合わせごとに抗原検索方法を最適化します。
   3. RTで200μLのブロッキング溶液(0.1%PBSTで希釈した5%)で各スライドをインキュベートし、すすりせずにブロッキング溶液を除去します。
   4. 100 μLの一次抗体または抗体を100μLでインキュベートし、4°CでRTまたはO/Nで1時間のブロッキング溶液で希釈します。RTでそれぞれ10分間、PBSで3回スライドをすすいで下します。
   5. RTで1時間のブロッキング溶液中で希釈した二次抗体の100μLで各スライドを100μLでインキュベートし、RTでそれぞれ10分間PBSのリンススライドを3回、光からスライドを保護します。
   6. スライドをマウントします。
      1. スライド上にDAPI(4'、6-diamidino-2-フェニリンドール)を持つアンチフェード媒体の2滴を追加します。その後、カバースリップでカバーします。
      2. 画像化する準備ができるまで、暗い4°Cで保存します。
         注:代替として、最初にRTでPBSで1:2,000を希釈したDAPIまたはHoechst 33324色素で核を標識し、次にグリセロールでマウントする。
2. 末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼdUTPニックエンドラベリング(TUNEL)染色。
   注:3'-ヒドロキシルターミニニ(3'OH DNAテルミニ)を持つ二本鎖DNAは、細胞内のアポトーシス中に形成されます。ここでは、市販キットを用いて特異的染色によりジゴキシゲニン-ヌクレオチド(TdT)を用いてDNA断片を標識することにより、その中の自由な3'OH DNAターミニーニに標識するプロトコルを提供する(材料の表参照)。 ).
   1. 必要に応じて、TUNEL染色の前に一次およびAlexa Fluor-488標識二次抗体を含む染色セクション。PBSのスライドをそれぞれ10分間3回すすいで下します。
      注:このステップは、同じスライド内のタンパク質とTUNELの二重染色のために任意である。
   2. 100 μL プロテインナーゼ K (10 mM トリス pH 7.5 および 5 mM EDTA で 10 μg/mL) で各スライドを RT で 10 分間 PBS を使用して 5 分間インキュベートします。
      注:組織タイプごとにプロテインタネセKのインキュベーション時間と温度を調整します。4%PFAで固定された胚頭部の10 μmセクションについては、RTで5分間インキュベートする。プロテパラーゼKを使用する方法に加えて、(1)新鮮に調製された0.1%ポリエチレングリコールテルトオクチルフェニルエーテル、0.1%クエン酸ナトリウム、37°Cで10分を含む、必要に応じて代替治療を使用します。(2) HCl中0.25%~0.5%ペプシン(pH2)または0.25%トリプシン、37°Cで10分。(3)0.1Mクレートバッファー(pH6)を含むマイクロ波照射を行った。
   3. 各スライドに200μLのブロッキング溶液(0.1%PBSTで希釈したロバ血清5%)を塗布し、RTで30分間インキュベートし、すすりせずにブロッキング溶液をタップします。
   4. キットが提供する平衡バッファの50 μLをRTの各スライドに少なくとも10s.すすせずにバッファをタップします。
   5. TdT酵素とキットが供給する反応バッファーを3:7の比で混合して反応混合物(作動強度TdT酵素)を調製する。各スライドに反応混合物の50 μLを適用し、37 °Cで1時間インキュベートし、すすせずにバッファーをタップします。
   6. キットが提供するストップバッファの200 μL(ddH2 Oで1:30希釈)を各スライドに塗布し、RTで10分間リンススライドを10分間インキュベートし、それぞれ10分間PBSで3回インキュベートします。
   7. ロダミン抗体を用いた標識。
      1. 各スライドに50 μLの予め温められた(RT)抗ジゴキシゲニンコンジュゲート(ロダミン)(ブロッキング溶液で1:1希釈)を適用します。暗闇の中で30分間RTでインキュベートします。
      2. PBSでスライドを10分間3回ずつすすいで下します。スライドをステップ 3.1.6 としてマウントします。

4. イメージング取得

1. 陽性コントロール(標的抗原に対して陽性の組織)を使用して、シグナル標識および陰性コントロール(一次抗体、アイソタイプコントロール、または標的抗原に対して陰性の組織を省略)をチェックし、蛍光下の画像の背景を評価する。顕微鏡。
2. ネガティブコントロールとポジティブコントロールの信号強度に基づいて、イメージング用の機器とカメラの状態(露出やその他の一般的な設定)を設定します。
   注:これらの条件は、(1)イメージングに使用されるカメラと顕微鏡、(2)抗体、および(3)各実験の組織によって異なります。頭蓋組織に使用される一般的な条件は、抗体の品質および特異性に依存する1/100 sから1sまでの露光時間を持つISO 200である。適切な倍率は、サンプルのサイズと実験の目的によって異なります。
3. 従来のエピ蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡で画像を取得します。各カラーチャンネルの同じ条件で画像(対応するコントロールを含む)を取得します。同じ形式の画像を保存します (tiff は情報を保持するのに最適です)。

5. 蛍光定量

注:異なるグループ間の染色を統計的に比較することは、多くの場合、より有益になります。免疫蛍光画像を用いて、シグナル密度を測定し、陽性細胞を数えたり、陽性領域を計算したりして、タンパク質の相対レベルを定量化する。統計分析の場合、生物学的に独立したサンプルの最小数は 3 です。一般的な方法は、各サンプルから少なくとも 3 つのセクションを生成し、各セクションの少なくとも 3 つの代表的な領域の画像を撮影することです。

1. ImageJを用いた蛍光強度の定量
   1. ソフトウェアを開き、[解析]> [測定値の設定] を使用して、エリアと集積密度のみが選択されていることを確認します。ファイル>を使用して、分析する画像を開きます。
   2. ツールバーを使用して、左端の正方形または円のアイコンを選択します。選択ツールを使用して、画像上で解析する領域を選択します。[分析];[測定]を使用して、[結果]ウィンドウで選択した領域と統合密度の読み出しを取得します。背景を読み取るために蛍光のない正のセルの横の領域を選択します。
   3. 手順 5.1.2 を繰り返して、他の画像を分析します。分析する領域を最初の画像の領域と一致するように調整しました。
   4. [結果] ウィンドウのすべてのデータをコピーし、分析が完了したらスプレッドシートに貼り付けます。
   5. 補正された蛍光強度(CTCF)を統合密度として計算する — (選択した細胞の面積 x バックグラウンド測定値の平均蛍光値)サンプル間の補正された全細胞蛍光の差を比較し、グラフを作成します。
2. ImageJを用いた蛍光画像の陽性細胞数の定量化
   1. 手動セルカウント。
      1. ImageJ > プラグイン >分析を使用して、セルカウンタプラグインをインストールします。
      2. ファイル>を使用して、分析する画像を開きます。プラグイン>分析>セル カウンタを使用して、カウンタ ウィンドウと結果ウィンドウを開きます。
         注:セル カウンタはスタックでは機能しません。スタックをカウントする場合は、プラグインプロット Z 軸プロファイルを使用し、イメージ>スタック> プロットZ 軸プロファイルを使用して、パーティクル トラッキング ツールを使用して移動する ROI の強度を監視します。このツールは、手動または自動のいずれかです。
      3. [カウンター] ウィンドウの下部にあるボタンのいずれかをクリックしてカウントを開始します。終了までカウントするセル/オブジェクトを直接クリックします。
      4. [カウント]ウィンドウの [結果]ボタンをクリックします。カウントされたセルの合計数が [結果]ウィンドウに表示されます。結果ログをスプレッドシートとして保存し、分析します。
   2. 自動セルカウント。
      1. ファイル>を使用して、分析する画像を開きます。続行する前に、RGB イメージをグレースケール イメージに変換します。
      2. [イメージ>しきい値を調整]を使用して、カウントする必要があるすべての領域を選択します。
      3. [解析>パーティクルの分析]を使用して、セル/パーティクルの数を取得します。特定の範囲内のセル/パーティクルをカウントするには、デフォルトの 0-Infinity の代わりに、有効なパーティクル サイズ (100-Infinity など) の範囲を設定します。結果ログをスプレッドシートとして保存し、分析します。
         注:画像からその他の情報を取得するには、エリアの他の情報を取得するには、[測定値を分析] に移動し、必要な情報の横にあるボックスを選択します。

結果

胚頭蓋組織切片
上記のステップに続いて、頭部を対照(P0-Cre)または変異体(神経堤細胞におけるBmpr1a、P0-Cre;caBmpr1a)胚(E)16.5または18.5で解剖した。 4時間のPFAで4%PFAを固定した後、サンプルをOCTに埋め込み、冠状動脈に凍結切除した。得られた切片は、pSmad1/5/9(下流BMPシグナル伝達因子)またはKi67(細胞増殖マーカー)に対する抗体で免疫染色し、...

ディスカッション

ここでは、マウスヘッドと非デカル化された骨組織の調製のための詳細なプロトコルと、細胞増殖、細胞死、およびBMPシグナル伝達マーカーの免疫染色のための凍結切除を提供する。また、免疫蛍光画像から定量的データを得るための戦略についても詳しく述べる。これらの方法は、適切な修飾を有する他の組織にも適用可能である。

組織調製の条件は、組織の大きさ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape	Leica	#39475214
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody	Invitrogen	A-11034
Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen	P36931
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
Coverslips	Fisher Brand	12-545-E
Cryostat	Leica	CM1850
EDTA	Sigma	E6758
Fluorescence microscope	Olympus	BX51
Gelatin	Sigma	G1890
In Situ Cell Death Detection Kit	Millipore	S7165
Microscope slides	Fisher Brand	12-550-15
OCT Compound	Fisher Healthcare	23-730-571
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Sigma	T9284	Triton X-100
Proteinase K	Invitrogen	AM2542
Rabbit anti-Ki67 antibody	Cell Signaling Technology	9129	Lot#:3; RRID:AB_2687446
Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody	Cell Signaling Technology	13820	Lot#:3; RRID:AB_2493181
Sodium citrate	Sigma	1613859
Sucrose	Sigma	S9378
Tris	Sigma	10708976001