Gewebevorbereitung und Immunostainierung von Craniofacial Tissues und unkalkulierten Knochen

Zusammenfassung

Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Erkennung und Quantifizierung des Proteinspiegels während der craniofacialmorphogenese/pathogenese durch Immunfärbung anhand von Maus-Craniofacial-Geweben als Beispiele vor. Darüber hinaus beschreiben wir eine Methode zur Herstellung und Kryosektion von nicht verkalkten harten Geweben von jungen Mäusen zur Immunfärbung.

Zusammenfassung

Die Gewebeimmunostainierung ermöglicht einen hochspezifischen und zuverlässigen Nachweis von Proteinen, die innerhalb eines bestimmten Gewebes von Interesse sind. Hier beschreiben wir ein vollständiges und einfaches Protokoll zum Nachweis der Proteinexpression während der craniofacialmorphogenese/pathogenese anhand von Maus-Craniofacial-Geweben als Beispiele. Das Protokoll besteht aus der Aufbereitung und Kryosektion von Geweben, indirekter Immunfluoreszenz, Bildaufnahme und Quantifizierung. Darüber hinaus wird eine Methode zur Herstellung und Kryosektion von nicht verkalkten harten Geweben zur Immunfärbung beschrieben, bei der craniofacial Gewebe und lange Knochen als Beispiele verwendet werden. Diese Methoden sind der Schlüssel zur Bestimmung der Proteinexpression und morphologischen/anatomischen Veränderungen in verschiedenen Geweben während der kraniofazianischen Morphogenese/Pathogenese. Sie gelten auch für andere Gewebe mit entsprechenden Modifikationen. Kenntnisse der Histologie und eine hohe Qualität der Abschnitte sind entscheidend, um wissenschaftliche Schlussfolgerungen aus experimentellen Ergebnissen zu ziehen. Mögliche Einschränkungen dieser Methodik sind unter anderem die Spezifität von Antikörpern und Quantifizierungsschwierigkeiten, die auch hier erörtert werden.

Einleitung

Das Gesicht ist ein wichtiger Teil der menschlichen Identität, und besteht aus verschiedenen Arten von Geweben, wie Epithel, Muskel, Knochen, Knorpel, Zahn. Diese Gewebe werden aus allen drei Keimschichten abgeleitet: Ektoderm, Endoderm und Mesoderm^1,2. Für die richtige Musterung und Entwicklung von craniofacial Geweben, Zellproliferation, Tod und Differenzierung müssen stark koordiniert und reguliert werden durch spezifische Signalwege, wie Wnt, Fgf, Hh und Bmp Wege^{3,4 ,5}. Defekte in der Proliferation, Überleben oder Differenzierung von Zellen führen zu craniofacial Fehlbildungen, die zu den am häufigsten auftretenden angeborenen Geburtsfehlern gehören. Transgene Mäuse sind nützliche Werkzeuge, um Mechanismen der craniofacial Morphogenese und Pathogenese^1,2,3,4,5zu untersuchen. Das Verständnis der Veränderungen der craniofacial Strukturen während der Entwicklung und Pathogenese wird dazu beitragen, die wichtigsten Entwicklungsprinzipien sowie die Mechanismen der craniofacial Mformationen^{1,2,3 zu klären ,4,5}.

Die Färbung ganzer Reit- oder Schnittgewebe mit spezifischen Antikörpern ist eine unschätzbare Technik zur Bestimmung der räumlichen Verteilung von Proteinen von Interesse ⁶. Formal kann sich die Gewebeimmunfärbung entweder auf die Immunhistochemie (IHC) oder die Immunfluoreszenz (IF) stützen. Im Vergleich zu dem opaken Reaktionsprodukt, das mit einem chromogenen Substrat wie 3,3'-Diaminobenzidin (DAB) von IHC erzeugt wird, beinhaltet IF die Verwendung von fluoreszierenden Konjugaten, die durch Fluoreszenzmikroskopie sichtbar sind. Daher kann IF positive Zellen deutlich von Hintergrundrauschen unterscheiden und ermöglicht es, Bilder auf einfache Weise durch Software wie ImageJ und Adobe Photoshop^7,8zu analysieren und zu verbessern. Der gesamte Mount-Färbungsansatz funktioniert auf kleinen Gewebeblöcken (weniger als 5 mm dick), die dreidimensionale Informationen über die Lage von Proteinen/Antigenen liefern können, ohne dass eine Rekonstruktion aus den Abschnitten^9,10 erforderlich ist. . Im Vergleich zu Gewebeabschnitten ist die Immunfärbung ganzer Halterungen jedoch zeitaufwändig und erfordert große Mengen an Antikörperlösungen. Nicht alle Antikörper sind mit dem grundlegenden Gesamtmontageansatz kompatibel. Darüber hinaus führt das unvollständige Eindringen von Antikörpern zu ungleichmäßigen Färbungen oder falsch negativen Färbungen. Hier konzentrieren wir uns auf den Immunfluoreszenznachweis von Proteinen/Antigenen auf geschnittenen Geweben. Bei hartem Gewebe (z.B. Kopf, Zahn, langer Knochen) erschwert die Kalziumablagerung während der Entwicklung/Pathogenese die Entnahme der Probe und wird während der Immunfärbung semmen1,¹²leicht abspült. Die meisten der derzeit verfügbaren Protokolle entkalken harte Gewebe vor der Einbettung, um das Teilen zu erleichtern, was zeitaufwändig ist und Morphologie und Antigene von Proben zerstören kann, wenn sie unsachgemäß behandelt werden^11,12. Um die Probleme zu überwinden, optimierten wir einen Ansatz für das Kryosektionen von hartem Gewebe ohne Entkalkung, was zu einer verbesserten Visualisierung ihrer Morphologie und Verteilung von Signalproteinen führte.

Das hier beschriebene Protokoll wird verwendet, um morphometrische und histologische Veränderungen im craniofaziale Gewebe von Transgenen Von BMP-Mäusen zu bestimmen. Konkret umfasst das Protokoll (1) Ernte und Sezieren von Kopfgeweben, (2) Abschnitt und Immunostainierung von experimentellen Markern (Ki67, pSmad1/5/9) zusammen mit TUNEL-Färbung, (3) Abbildung der Abschnitte mit Fluoreszenzmikroskop und schließlich (4) Analyse und Quantifizierung der Ergebnisse. Das Protokoll zur Vorbereitung und Kryosektion von hartem Gewebe ohne Entkalkung wird ebenfalls beschrieben¹³. Diese Methoden sind für craniofacial Gewebe optimiert. Sie gelten auch für andere Gewebe aus verschiedenen Altersgruppen von Proben mit entsprechenden Modifikationen.

Protokoll

Alle Mausexperimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien der University of Michigan durchgeführt, die die humane Pflege und den Einsatz von Tieren in der Forschung betreffen. Alle in dieser Studie verwendeten tierischen Verfahren wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Michigan (Protokoll #PRO00007715) genehmigt.

1. Gewebevorbereitung

1. Herstellung von embryonalen Geweben
   1. Bereiten Sie eine 10 cm Schale und mehrere 3,5 cm Teller mit Phosphat gepufferter Kochsaline (PBS) und eine 12-Well-Kulturplatte mit 2 ml 4% Paraformaldehyd (PFA) in PBS in jedem Brunnen für jede schwangere Maus zu. Legen Sie alle Petri-Gerichte und den Teller auf Eis.
      HINWEIS: Behandeln Sie 4% PFA in einer Dunstabzugshaube.
   2. Sezieren Sie Embryonen von trächtigen Mäusen in eiskaltem PBS mit Zangen und Schere, wie zuvor beschrieben¹⁴.
      1. Kurz, einschläfern eine schwangere Maus mit CO₂, greifen Sie die Haut unter der Mitte des Bauches mit Zange und schneiden Sie durch die Haut nur, dann ziehen Sie sanft an der Haut, um es von der darunter liegenden Bauchmuskelwand zu trennen.
      2. Als nächstes in die Bauchhöhle nach der gleichen Linie des Hautschnitts geschnitten. Entfernen Sie die Gebärmutter, die eine Reihe von Embryonen enthält, und entfernen Sie die Embryonen, indem Sie die Gebärmutterwand vorsichtig abschneiden. Die extraembryonalen Gewebe wie der Dottersack und das Amnion werden entfernt.
      3. Kopf von jedem Embryo schneiden und isolieren.
   3. Übertragen Sie jeden Kopf in jeden Brunnen einer 12-Well-Platte, die 4% PFA mit einer Kunststoff-Transferpipette oder Zange enthält. Proben in 4% PFA bei 4 °C für 4 h fixieren. Proben in PBS bei 4 °C mit sanftem Schütteln für 12 h abspülen.
      HINWEIS: Bei Embryonen, die jünger als embryonaler Tag 16.5 (E16.5) sind, fixieren Embryoköpfe mit 4% PFA direkt nach der Isolierung. Bei Embryonen bei E16.5 oder höher entfernen, um Haut und Fettgewebe aus den Köpfen zu entsorgen und vor der Fixierung mehrmals in eiskaltem PBS zu spülen.
   4. Cryoprotect Köpfe.
      1. Übertragen Sie jeden Kopf in eine neue 12-Well-Platte mit 2 ml 30% Saccharose in PBS mit einer Kunststoff-Transferpipette oder Zange. Rühren Sie sanft bei 4 °C, bis der Kopf auf den Boden der Schale sinkt.
   5. Einbetten von Köpfen.
      1. Übertragen Sie den kryogeschützten Kopf in eine Form mit optimaler Schnitttemperatur (OCT) Verbindung. Gleichgewichtsproben im OCT für mehrere Minuten. Passen Sie die Position und Richtung der Proben mit Zangen an.
      2. Legen Sie die Form auf Trockeneis zum Einfrieren. Die resultierenden Kryomolde in einer Plastiktüte bei -80 °C lagern, bis sie zum Kryosektionen bereit sind.
         HINWEIS: Die getrimmte Seite der Proben muss sich der Unterseite der Einbettform stellen.
2. Vorbereitung von postnatalen undecalcierten Hartgeweben
   1. Euthanisieren bei 3 Wochen oder 3 Monate alte Maus mit CO₂. Entfernen Sie die Haut und Fettgewebe. Schneiden und isolieren Sie den Kopf oder lange Knochen von der Maus.
   2. Fixieren und kryoprochen den Kopf oder langen Knochen von Mäusen, wie in den Schritten 1.1.3–1.1.4 beschrieben.
   3. In ähnlicher Weise wie Schritt 1.1.5 in 8% Gelatine einbetten. Bewahren Sie die Kryomolden in einer Plastiktüte bei -80 °C bis zum Kryosektionen auf.
      HINWEIS: Eine Entkalkung ist hier nicht notwendig. Um 8% Gelatine zuzubereiten, 8 g Gelatine mit 100 ml PBS mischen und mit einer Mikrowelle kochen. Beachten Sie, dass die Mischung leicht überkocht.

2. Kryosektion

1. Setzen Sie die Kryostattemperatur auf -18 °C für Weichgewebe, die in OCT oder -25 °C eingebettet sind, und niedriger für nicht verkalkte harte Gewebe, die in Gelatine eingebettet sind. Halten Sie Proben in der Kryostatkammer für ca. 30 min, um die Kryostattemperatur zu kompensieren.
2. Vertreiben Sie den Block aus dem Kryomold. Einfrieren des Blocks auf das Probenfutter (Gewebehalter) über die Montage mit einem OCT-Tropfen. Halten Sie die getrimmte Seite der Probe am weitesten vom Futter (mit Blick auf den Bediener).
3. Laden Sie das blockmontierte Futter auf den Cryostat-Objekthalter. Passen Sie den Klingenhalter so an, dass der Winkel der Klinge 3°–5° relativ zur Probe ist.
4. Sammeln Sie 10 m Abschnitte auf beschichtete Mikroskopschlitten. Trockene Abschnitte vollständig bei RT, dann lagern Sie sie bei -80 °C.

3. Histologische Färbung und mikroskopische Bildgebung

1. Immunfluoreszenzfärbung
   1. Nehmen Sie Rutschen von -80 °C heraus. Halten Sie die Dias bei RT für 1 h bis airdry Abschnitte. Spülen Sie Dias in 0,1% PBST (0,1% Polyethylenglykoltert-Octylphenylether in PBS; siehe Materialtabelle) dreimal für jeweils 5 min, um OCT- und Permeabilize-Abschnitte auszuwaschen.
   2. Optional führen Sie Antigenabruf (optional) durch.
      1. Citratpuffer (10 mM Natriumcitrat pH 6) in der Färbeschale mit Dampfer oder Wasserbad auf 95–100 °C vorheizen. Tauchen Sie in den Citratpuffer, inkubieren für 10 min.
      2. Nehmen Sie die Färbeschale aus dem Dampfer oder Wasserbad zu RT. Kühlen Sie die Rutschen bei RT für 20 min oder länger¹⁵.
         HINWEIS: Als Alternative verwenden Sie Tris-EDTA-Puffer (10 mM Tris-Basis, 1mM EDTA, 0,05 % Tween 20, pH 9,0) oder EDTA-Puffer (1 mM EDTA, 0,05 % Tween 20, pH 8,0) für die wärmeinduzierte Antigenabrufung. Verwenden Sie einen Schnellkochtopf, eine Mikrowelle oder ein Wasserbad für die wärmeinduzierte Antigenrückgewinnung, zusätzlich zum Heißdampfer. Eine Enzym-induzierte Antigen-Retrieval mit Trypsin oder Pepsin ist eine weitere Alternative. Optimieren Sie die Konzentration und Behandlungszeit des enzymatischen Abrufs, um schädliche Abschnitte zu vermeiden. Optimieren Sie die Antigen-Retrieval-Methode für jede Antikörper-Antigen-Kombination.
   3. Inkubieren Sie jeden Schlitten mit 200 l Blockierlösung (5% Eselserum in 0,1% PBST verdünnt) bei RT für 30 min, dann entfernen Sie die Blockierlösung ohne Spülung.
   4. Inkubieren Sie jeden Schlitten mit 100 l Primärantikörpern oder Antikörpern, die in einer Blockierlösung für 1 h bei RT oder O/N bei 4 °C verdünnt werden. Spülen Sie Dias mit PBS dreimal für jeweils 10 min bei RT.
   5. Inkubieren Sie jeden Schlitten mit 100 l Sekundärantikörper in Blockierlösung für 1 h bei RT verdünnt. Spülen Sie diagleitet in PBS dreimal für jeweils 10 min bei RT. Schützen Sie Dias vor Licht.
   6. Montieren Sie Rutschen.
      1. Fügen Sie zwei Tropfen Anti-Fade-Medium mit DAPI (4', 6-Diamidino-2-Phenylindole) auf der Folie. Dann mit einem Coverslip abdecken.
      2. Bei 4 °C im Dunkeln lagern, bis es bildbereit ist.
         HINWEIS: Als Alternative, beschriften Sie die Kerne mit DAPI oder Hoechst 33324 Farbstoff verdünnt 1:2.000 in PBS bei RT zuerst, dann mit Glycerin montieren.
2. Terminal desoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL) Färbung.
   HINWEIS: Doppelsträngige DNA mit 3'-Hydroxyl-Termini (3'OH DNA termini) bildet sich während der Apoptose in der Zelle. Hier stellen wir ein Protokoll zur Verfügung, das die kostenlosen 3'OH DNA-Termini in situ durch Kennzeichnung von DNA-Fragmenten mit dem Digoxigenin-Nukleotid unter Verwendung von Terminal-Deoxynukleotidyl-Transferase (TdT) durch spezifische Färbung mit einem kommerziellen Kit kennzeichnen (siehe Tabelle der Materialien ).
   1. Optional sind Fleckenabschnitte mit primärer und Alexa Fluor-488 als Sekundärantikörper vor der TUNEL-Färbung gekennzeichnet. Spülen Sie die Dias in PBS dreimal für jeweils 10 min.
      HINWEIS: Dieser Schritt ist optional für eine doppelte Färbung eines Proteins und TUNEL in der gleichen Folie.
   2. Inkubieren Sie jeden Schlitten mit 100 l Proteinase K (10 g/ml in 10 mM Tris pH 7,5 und 5 mM EDTA) für 5 min bei RT. Spülen Sie Dias mit PBS dreimal für 10 min jeweils bei RT.
      HINWEIS: Passen Sie die Inkubationszeit und Temperatur von Proteinase K für jeden Gewebetyp an. Für 10 m Abschnitte von Embryoköpfen, die in 4% PFA fixiert sind, inkubieren Sie für 5 min bei RT. Zusätzlich zu der Methode mit Proteinase K, verwenden Sie alternative Behandlungen nach Bedarf, einschließlich (1) frisch zubereitet 0,1% Polyethylenglykol tert-octylphenylether, 0,1% Natriumcitrat, 10 min bei 37 °C; (2) 0,25%–0,5% Pepsin in HCl (pH 2) oder 0,25% Trypsin, 10 min bei 37 °C; und (3) Mikrowellenbestrahlung mit 0,1 M Citratpuffer (pH 6).
   3. Tragen Sie 200 l Blockierlösung (5% Eselsserum in 0,1% PBST verdünnt) auf jeden Schlitten auf, inkubieren Bei RT für 30 min, tippen Sie die Blockierlösung ohne Spülung ab.
   4. Tragen Sie 50 l des vom Kit bereitgestellten Ausgleichspuffers auf jede Folie bei RT für mindestens 10 s auf. Tippen Sie den Puffer ohne Spülung ab.
   5. Vorbereiten Sie das Reaktionsgemisch (Arbeitsstärke TdT-Enzym) durch Mischen von TdT-Enzym mit dem vom Kit gelieferten Reaktionspuffer im Verhältnis 3:7. 50 l des Reaktionsgemisches auf jeden Schlitten auftragen und bei 37 °C für 1 h inkubieren. Tippen Sie den Puffer ohne Spülung ab.
   6. Tragen Sie 200 l des vom Kit gelieferten Stop-Puffers (1:30 in ddH₂O) auf jede Rutsche auf, und inkubieren Sie dann bei RT 10 min. Spülen Sie Dias mit PBS dreimal für jeweils 10 min.
   7. Etikett mit Rhodamine Antikörper.
      1. Tragen Sie 50 l vorgewärmtes (RT) Anti-Digoxigenin-Konjugat (Rhodamine) (1:1 in Blockierlösung verdünnt) auf jede Rutsche auf. Inkubieren bei RT für 30 min in dunkel.
      2. Spülen Sie Dias mit PBS dreimal für jeweils 10 min. Gleitet als Schritt 3.1.6 montieren.

4. Imaging Acquisition

1. Verwenden Sie positive Kontrollen (Gewebe positiv für das Zielantigen), um die Signalkennzeichnung und negative Kontrollen (auslassen sie den primären Antikörper, die Isotypkontrolle oder das Gewebe negativ für das Zielantigen) zu überprüfen, um den Hintergrund von Bildern unter dem fluoreszierenden mikroskop.
2. Stellen Sie die Geräte- und Kamerabedingungen (Belichtungen und andere allgemeine Einstellungen) für die Bildgebung basierend auf der Signalintensität negativer und positiver Steuerungen ein.
   HINWEIS: Diese Bedingungen variieren je nach (1) Kameras und Mikroskopen, die für die Bildgebung verwendet werden, (2) Antikörpern und (3) Geweben für jedes Experiment. Häufige Bedingungen für craniofacial Gewebe sind ISO 200 mit einer Expositionszeit von 1/100 s bis 1 s abhängig von der Qualität und Spezifität von Antikörpern. Die entsprechenden Vergrößerungen variieren je nach Größe der Proben und Zweck der Experimente.
3. Erfassen Sie Bilder mit konventionellem Epifluoreszenzmikroskop oder Konfokalmikroskop. Erfassen Sie Bilder (einschließlich der entsprechenden Steuerelemente) unter den gleichen Bedingungen für jeden Farbkanal. Speichern Sie Bilder mit demselben Format (tiff ist am besten, um Informationen zu bewahren).

5. Fluoreszenzquantifizierung

HINWEIS: Der statistische Vergleich der Färbung zwischen verschiedenen Gruppen wird in vielen Fällen informativer sein. Mit den Immunfluoreszenzbildern quantifizieren Sie den relativen Gehalt des Proteins, indem Sie die Signaldichte messen, positive Zellen zählen oder positive Bereiche berechnen. Für die statistische Analyse beträgt die Mindestanzahl biologisch unabhängiger Proben 3. Eine typische Methode besteht darin, aus jeder Stichprobe mindestens drei Abschnitte zu generieren und Bilder für mindestens drei repräsentative Bereiche in jedem Abschnitt zu erstellen.

1. Quantifizierung der Fluoreszenzintensität mit ImageJ
   1. Öffnen Sie die Software, und verwenden Sie Analysieren > Messungen festlegen, um zu überprüfen, ob nur Fläche und integrierte Dichte ausgewählt sind. Verwenden Sie Datei > Öffnen, um zu analysierende Bilder zu öffnen.
   2. Verwenden Sie die Symbolleiste, um entweder das Quadrat- oder Kreissymbol ganz links auszuwählen. Wählen Sie den Bereich aus, der auf dem Bild analysiert werden soll, indem Sie das Auswahlwerkzeug verwenden. Verwenden Sie Analysieren > Messen, um das Auslesen des ausgewählten Bereichs und der integrierten Dichte im Ergebnisfenster abzulesen. Wählen Sie einen Bereich neben einer positiven Zelle aus, der keine Fluoreszenz zum Auslesen des Hintergrunds hat.
   3. Wiederholen Sie Schritt 5.1.2, um andere Bilder zu analysieren. Der zu analysierende Bereich wurde an die Fläche angepasst, die mit der des ersten Bildes übereinstimmt.
   4. Kopieren Sie alle Daten im Ergebnisfenster, und fügen Sie sie nach Abschluss der Analyse in eine Kalkulationstabelle ein.
   5. Berechnen Sie die korrigierte Fluoreszenzintensität (CTCF) als integrierte Dichte — (Fläche der ausgewählten Zelle x Mittlere Fluoreszenz von Hintergrundwerten). Vergleichen Sie die Differenz der korrigierten Gesamtzellfluoreszenz zwischen Denproben, und erstellen Sie ein Diagramm.
2. Quantifizierung der positiven Zellzahl von fluoreszierenden Bildern mit ImageJ
   1. Manuelle Zellzählung.
      1. Verwenden Sie ImageJ > Plugins > Analysis, um das Cell Counter Plugin zu installieren.
      2. Verwenden Sie Datei > Öffnen, um zu analysierende Bilder zu öffnen. Verwenden Sie Plugins > Analyse > Zellenzähler, um das Fenster Zähler und das Ergebnisfenster zu öffnen.
         HINWEIS: Der Zellenzähler funktioniert nicht auf Stapeln. Zum Zählen von Stacks, Plugin Plot Z Achsenprofil, verwenden Sie dann Bild > Stapel > Plot Z Achsenprofil, um die Intensität eines sich bewegenden ROI mit einem Partikel-Tracking-Tool zu überwachen. Dieses Tool kann manuell oder automatisch sein.
      3. Klicken Sie auf eine der Schaltflächen am unteren Rand des Schalterfensters, um die Zählung zu initiieren. Klicken Sie direkt auf eine Zelle/ein Objekt, die bis zum Abschluss gezählt werden soll.
      4. Klicken Sie im Fenster Anzahl auf die Schaltfläche Ergebnisse. Die Gesamtzahl der gezählten Zellen wird im Fenster Ergebnisse angezeigt. Speichern Sie das Ergebnisprotokoll als Kalkulationstabelle und analysieren Sie es.
   2. Automatisierte Zellzählung.
      1. Verwenden Sie Datei > Öffnen, um zu analysierende Bilder zu öffnen. Konvertieren Sie das RGB-Bild in ein Graustufenbild, bevor Sie fortfahren.
      2. Verwenden Sie Bild > Anpassen > Schwellenwert, um alle Bereiche auszuwählen, die gezählt werden müssen.
      3. Verwenden Sie Analysieren > Partikel analysieren, um die Anzahl der Zellen/Partikel abzubekommen. Legen Sie einen Bereich der gültigen Partikelgröße (z. B. 100-Infinity) anstelle der Standardeinstellung 0-Infinity fest, um Zellen/Partikel innerhalb eines bestimmten Bereichs zu zählen. Speichern Sie das Ergebnisprotokoll als Kalkulationstabelle und analysieren Sie es.
         HINWEIS: Um weitere Informationen aus dem Bild zu erhalten, gehen Sie neben dem Bereich zu Analysieren > Messungen festlegen und wählen Sie das Feld neben den benötigten Informationen aus.

Ergebnisse

Embryonale craniofacial Gewebeabschnitte
Nach den obigen Schritten wurden die Köpfe am embryonalen Tag (E) 16,5 oder 18,5 von der Kontrolle (P0-Cre) oder mutierten (konstitutiv aktivierten Bmpr1a in neuralen Kammzellen, P0-Cre; caBmpr1a) Embryonen seziert. Nach der Fixierung in 4% PFA für 4 h wurden die Proben in OCT eingebettet und koronal kryosectioniert. Die ergebnisseweise Abschnitte wurden mit Antikörpern gegen pSmad1/5/9 (nachgeschaltete BMP-...

Diskussion

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung von Mauskopf und nicht verkalkten Knochengeweben und Kryosektionen zur Immunfärbung der Zellproliferation, des Zelltodes und der BMP-Signalmarker. Wir beschreiben auch die Strategie zur Gewinnung quantitativer Daten aus immunfluoreszierenden Bildern. Diese Methoden können auch auf andere Gewebe mit entsprechenden Modifikationen anwendbar sein.

Die Bedingungen für die Gewebevorbereitung variieren je nach Größe und Art des Ge...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape	Leica	#39475214
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody	Invitrogen	A-11034
Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen	P36931
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
Coverslips	Fisher Brand	12-545-E
Cryostat	Leica	CM1850
EDTA	Sigma	E6758
Fluorescence microscope	Olympus	BX51
Gelatin	Sigma	G1890
In Situ Cell Death Detection Kit	Millipore	S7165
Microscope slides	Fisher Brand	12-550-15
OCT Compound	Fisher Healthcare	23-730-571
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Sigma	T9284	Triton X-100
Proteinase K	Invitrogen	AM2542
Rabbit anti-Ki67 antibody	Cell Signaling Technology	9129	Lot#:3; RRID:AB_2687446
Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody	Cell Signaling Technology	13820	Lot#:3; RRID:AB_2493181
Sodium citrate	Sigma	1613859
Sucrose	Sigma	S9378
Tris	Sigma	10708976001