마우스 두개안면 조직 및 분해되지 않은 뼈의 조직 준비 및 면역 염색

요약

여기에서, 우리는 마우스 두개안면 조직을 사용하여 면역 염색에 의해 두개안면 형태 형성/병인 동안 단백질 수준을 검출하고 정량화하는 상세한 프로토콜을 제시합니다. 또한, 우리는 면역 염색을 위한 젊은 마우스에게서 decalcified 되지 않은 단단한 조직의 준비 그리고 저온 절제를 위한 방법을 기술합니다.

초록

조직 면역 염색은 주어진 조직 내의 관심 있는 단백질의 고도로 특이하고 믿을 수 있는 검출을 제공합니다. 여기에서 우리는 예를 들면 마우스 두개안면 조직을 사용하여 두개안면 형태 형성/병인 도중 단백질 발현을 검출하는 완전하고 간단한 프로토콜을 기술합니다. 프로토콜은 조직의 준비 및 냉동 부피, 간접 면역 형광, 이미지 수집 및 정량화로 구성됩니다. 또한 면역 염색을위한 비해짐 경조직의 준비 및 냉동 절제 방법은 두개안면 조직과 긴 뼈를 예로 들수 있습니다. 그 방법은 두개안면 형태 형성/병인 동안 다양한 조직에서 단백질 발현 및 형태학적/해부학적 변화를 결정하는 데 핵심적인 것입니다. 그(것)들은 또한 적당한 수정을 가진 그밖 조직에 적용가능합니다. 연구 결과에 대한 지식과 섹션의 높은 품질은 실험 결과에서 과학적 결론을 도출하는 데 중요합니다. 이 방법론의 잠재적 한계는 항체의 특이성 및 정량화의 어려움에 한정되지 않으나, 이는 또한 여기에서 논의된다.

서문

얼굴은 인간 정체성의 중요한 부분이며 상피, 근육, 뼈, 연골, 치아와 같은 여러 가지 유형의 조직으로 구성됩니다. 그 조직은 모든 3개의 세균 층에서 파생됩니다: ectoderm, 내배엽및 중배엽 1,². 두개안면 조직의 적절한 패터닝 및 개발을 위해서는 Wnt, Fgf, Hh 및 Bmp 경로^{3,4와 같은 특정 신호 경로에 의해 세포 증식, 사망 및 분화가 고도로 조정되고 조절되어야 합니다. ,5}. 세포의 증식, 생존 또는 분화의 결함은 가장 자주 발생하는 선천성 선천성 선천적 인 결함 중 하나 인 두개안면 기형으로 이어질 것입니다. 형질전환 마우스는 두개안면 형태 형성 및 병인의 메커니즘을연구하는 데 유용한 도구1, 2,^3,4,5. 발달과 병인 동안 두개안면 구조의 변화를 이해하는 것은 주요 발달 원리뿐만 아니라 두개안면 기형의 메커니즘을 명확히하는 데 도움이 될 것입니다^{1,2,3 ,4},^5.

특정 항체를 가진 전체 마운트 또는 단면 조직의 염색은 관심 있는 단백질의 공간 분포를 결정하기 위한 귀중한 기술이다 ^6. 공식적으로, 조직 면역 염색은 면역 조직 화학 (IHC) 또는 면역 형광 (IF)에 의존 할 수 있습니다. IHC에 의해 3,3'-디아미노벤지딘(DAB)과 같은 발색성 기질로 생성된 불투명 반응 생성물과 비교하여, IF는 형광 현미경 검사법에 의해 보이는 형광 접합체의 사용을 포함한다. 따라서 IF는 배경 잡음으로부터 양성 세포를 명확하게 구별할 수 있으며, ImageJ 및 Adobe Photoshop^7,8과같은 소프트웨어에 의해 이미지를 정량적으로 분석하고 향상시킬 수 있다. 전체 마운트 염색 접근법은 작은 조직 블록 (두께 5mm 미만)에서 작동하며^섹션9, 10에서 재건 할 필요없이 단백질 / 항원의 위치에 대한 3 차원 정보를 제공 할 수^{있습니다.} . 그러나, 조직 단면도와 비교해, 전체 마운트 면역 염색은 시간이 오래 걸리고 항체 해결책의 대량을 요구합니다. 모든 항체가 기본 전체 마운트 접근법과 호환되는 것은 아닙니다. 또한, 항체의 불완전한 침투는 고르지 못한 염색 또는 거짓 음성 염색을 초래할 것이다. 여기에서 우리는 단면조직에 단백질/항원의 면역형광 검출에 집중할 것입니다. 단단한 조직(예를 들어, 머리, 치아, 긴 뼈)의 경우, 발달/병인 동안 칼슘 침착은 면역 염색 치료 동안 시료를 단면화하기 어렵게 하고 쉽게 헹구게 한다^11,12. 현재 이용 가능한 대부분의 프로토콜은 절편을 쉽게 하기 위해 삽입하기 전에 단단한 조직을 decalcify, 이는 시간이 많이 걸리고 부적절하게 처리하는 경우 샘플의 형태 및 항원을 파괴 할 수있다^11,12. 문제를 극복하기 위해, 우리는 decalcification없이 단단한 조직의 냉동 절제에 대한 접근 방식을 최적화, 그들의 형태와 신호 단백질의 분포의 개선 시각화로 이어지는.

여기서 기술된 프로토콜은 BMP 형질전환 마우스의 두개안면 조직에서 형태측정 및 조직학적 변화를 결정하는 데 사용되고 있다. 구체적으로, 이 프로토콜은 (1) 두체 조직을 수확및 해부하는 것, (2) 실험 마커의 절편 및 면역염색(Ki67, pSmad1/5/9)과 TUNEL 염색, (3) 형광 현미경을 사용하여 단면을 이미징하고, 마지막으로 (4) 결과를 분석하고 정량화합니다. 탈석없이 경조직을 준비하고 저온절하는 프로토콜도^기재되어있다. 그 방법은 두개안면 조직에 최적화되어 있습니다. 그(것)들은 또한 적당한 수정을 가진 견본의 각종 나이에서 그밖 조직에 적용가능합니다.

프로토콜

모든 마우스 실험은 연구에서 동물의 인도적 관리 및 사용을 다루는 미시간 대학 지침에 따라 수행되었다. 이 연구에서 사용된 모든 동물 절차는 미시간 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다 (프로토콜 #PRO00007715).

1. 조직 준비

1. 배아 조직의 준비
   1. 10cm 접시 1개, 인산완충식염수(PBS)를 함유한 3.5cm 접시 1개, 임신한 마우스마다 PBS에 2 mL 4% 파라포름알데히드(PFA)가 들어있는 12웰 배양 플레이트 1개를 준비한다. 모든 페트리 요리와 접시를 얼음 위에 놓습니다.
      참고: 연기 후드에 4% PFA를 처리합니다.
   2. 앞서 설명한 바와 같이 집게와 가위로 얼음 차가운 PBS에서 임신 한 마우스에서 배아를 해부^14.
      1. 간단히, CO2로 임신 마우스를 안락사, 집게로 배의 중심 아래 피부를 잡고 피부를 통해 잘라, 다음 부드럽게 기본 복근 벽에서 분리 피부를 당겨.
      2. 다음으로, 피부 절개의 동일한 라인을 따라 복강으로 잘라. 배아의 문자열을 포함하는 자궁을 제거하고 자궁 벽을 부드럽게 절단하여 배아를 제거합니다. 노른자 낭 및 양수와 같은 배아 조직은 제거됩니다.
      3. 각 배아에서 머리를 자르고 분리합니다.
   3. 플라스틱 전사 파이펫 또는 집게로 4% PFA를 포함하는 12웰 플레이트의 각 웰에 각 헤드를 옮김을 옮김을 넣습니다. 4°C에서 4°C의 PFA에서 4%의 시료를 4°C에서 PBS에서 헹구고 12시간 동안 부드럽게 흔들어 시료를 고정합니다.
      참고: 배아일 16.5(E16.5)보다 어린 배아의 경우, 분리 후 직접 4% PFA로 배아 머리를 고정합니다. E16.5 이상 배아의 경우, 피부와 지방 조직을 머리에서 제거하고 고정하기 전에 얼음 차가운 PBS에서 여러 번 헹구십시오.
   4. 냉동 보호 헤드.
      1. 플라스틱 전사 파이펫 또는 집게를 사용하여 PBS에서 30% 자당의 2 mL을 포함하는 새로운 12 웰 플레이트에 각 헤드를 옮김을 옮김. 머리가 접시의 바닥에 가라 앉을 때까지 4 °C에서 부드럽게 교반.
   5. 헤드를 포함합니다.
      1. 최적 절삭 온도(OCT) 화합물이 포함된 금형으로 냉동 보호 헤드를 옮니다. OCT에서 몇 분 동안 샘플을 평형화합니다. 집게로 샘플의 위치와 방향을 조정합니다.
      2. 금형을 드라이 아이스 위에 놓고 얼립니다. 냉동 절편이 준비될 때까지 -80°C의 비닐 봉지에 극저온을 보관하십시오.
         참고: 시료의 트리밍 된 면은 임베딩 금형의 바닥을 향해야 합니다.
2. 출생 후 분신되지 않은 경조직의 준비
   1. CO2를 가진 3 주 또는 3달 오래된 마우스에서 안락사 . 피부와 지방 조직을 제거하십시오. 머리 또는 긴 뼈를 마우스에서 자르고 분리합니다.
   2. 단계 1.1.3-1.1.4에 기재된 바와 같이 마우스의 머리 또는 긴 뼈를 고치고 냉동 보호한다.
   3. 1.1.5단계와 유사한 방식으로 8% 젤라틴에 포함시다. 냉동 부조가 될 때까지 - 80 °C에서 비닐 봉지에 cryomolds을 유지합니다.
      참고: 여기서는 탈석화가 필요하지 않습니다. 8% 젤라틴을 준비하려면 8 g의 젤라틴을 PBS 100 mL와 섞고 전자레인지를 사용하여 끓입니다. 혼합물이 쉽게 끓는다는 점에 유의하십시오.

2. 냉동 부속

1. OCT 또는 -25°C에 내장된 연조직을 위해 저온 온도를 -18°C로 설정하고 젤라틴에 내장된 비정형 경질 조직을 위해 더 낮게 설정합니다. 저온 온도에 평형을 위해 약 30 분 동안 저온 유지 챔버에 샘플을 유지합니다.
2. 극저온에서 블록을 추방하십시오. OCT 드롭으로 장착하여 시편 척(티슈 홀더)에 블록을 고정시. 샘플의 트림된 면을 척에서 가장 멀리 유지합니다(작업자를 향하게 함).
3. 블록 장착 척을 저온 극저온 물체 홀더에 로드합니다. 블레이드 홀더를 조정하여 시료를 기준으로 블레이드의 각도를 3°-5°로 만듭니다.
4. 코팅 된 현미경 슬라이드에 10 μm 섹션을 수집합니다. RT에서 완전히 건조 된 다음 -80 °C에 보관하십시오.

3. 조직학적 염색 및 현미경 이미징

1. 면역형광 염색
   1. -80 °C에서 슬라이드를 꺼내십시오. RT에서 1시간 동안 에어드라이 섹션에 슬라이드를 유지합니다. 0.1% PBST(0.1% 폴리에틸렌 글리콜 테르트-옥틸페닐 에테르PBS; 재료 표참조)에서 0.1%의 슬라이드를 헹구어 OCT를 세척하고 섹션을 투과시하기 위해 각각 5분 동안 세 번 참조하십시오.
   2. 선택적으로, 항원 회수(선택사항)를 수행한다.
      1. 구연산염 완충제 (10 mM 구연산 나트륨 pH 6)를 스테인딩 접시에 증기또는 수조로 95-100 °C로 예열합니다. 구연산염 버퍼에 슬라이드를 담그고 10 분 동안 배양하십시오.
      2. 스티머 나 수조에서 염색 접시를 RT로 가져 가라.
         참고: 대안으로, Tris-EDTA 버퍼(10 mM Tris base, 1mM EDTA, 0.05% 트웬트 20, pH 9.0) 또는 EDTA 버퍼(1 mMEDTA, 0.05% 트웬20, pH 8.0)를 열 유도 항원 회수에 사용한다. 뜨거운 증기선 이외에 열 유도 항원 회수를 위해 압력 밥솥, 전자 레인지 또는 수조를 사용하십시오. 트립신 또는 펩신을 이용한 효소 유도 항원 회수는 또 다른 대안이다. 효소 검색의 농도 및 처리 시간을 최적화하여 손상된 부분을 방지합니다. 각 항체/항원 조합에 대한 항원 검색 방법을 최적화합니다.
   3. 각 슬라이드에 200 μL의 차단 용액 (5 % 당나귀 혈청을 0.1 % PBST로 희석)으로 30 분 동안 RT에서 인큐베이션한 다음 헹구지 않고 차단 용액을 제거하십시오.
   4. 1차 항체 또는 4°C에서 RT 또는 O/N에서 1시간 동안 차단 용액으로 희석된 100 μL의 각 슬라이드를 배양합니다. RT에서 각각 10분 동안 PBS로 슬라이드를 세 번 헹구십시오.
   5. RT. Rinse 슬라이드에서 1시간 동안 차단 용액에 희석된 이차 항체 100 μL로 각 슬라이드를 10분 동안 PBS에서 10분 동안 3회 배양합니다.
   6. 슬라이드를 마운트합니다.
      1. 슬라이드에 DAPI(4', 6-diamidino-2-phenylindole)와 함께 페이드 방지 매체 2방울을 넣습니다. 그런 다음 커버슬립으로 덮습니다.
      2. 이미지가 준비될 때까지 어두운 4°C에서 보관하십시오.
         참고: 대안으로, DAPI 또는 Hoechst 33324 염료로 핵을 라벨을 붙인 후 RT에서 PBS에서 1:2,000을 희석한 다음 글리세롤로 장착합니다.
2. 단말 디옥시클레오디딜 트랜스퍼라제 dUTP 닉 엔드 라벨링(TUNEL) 염색.
   참고: 3'-하이드록실 테르미니(3'OH DNA termini)를 가진 이중 가닥 DNA는 세포에 있는 세포자멸 도중 형성될 것입니다. 여기서, 우리는 상용 키트를 사용하여 특정 염색에 의해 말단 디옥시뉴클레오디딜 트랜스퍼라제(TdT)를 활용한 디곡시게닌-뉴클레오티드와 DNA 단편라벨링을 통해 자리에 자유 3'OH DNA 테르미니를 라벨링하는 프로토콜을 제공한다(재료표 참조) ).
   1. 선택적으로, TUNEL 염색 전에 1차 및 알렉사 플루오르-488 표지된 이차 항체를 가진 얼룩 섹션. 슬라이드를 PBS에서 10분 동안 세 번 헹구십시오.
      참고: 이 단계는 동일한 슬라이드에서 단백질과 TUNEL의 이중 염색에 대한 선택 사항입니다.
   2. RT. 린스 슬라이드에서 RT. 린스 슬라이드에서 5분 동안 100 μL Proteinasae K(10 mMS pH 7.5 및 5 mM EDTA)로 각 슬라이드를 100μl 씩 인큐베이션합니다.
      참고: 각 조직 유형에 대한 단백질분해아제 K의 배양 시간 및 온도를 조정합니다. 4% PFA에 고정된 배아 헤드의 10 μm 섹션의 경우 RT에서 5분 동안 배양합니다. 프로틴라제 K를 사용하는 방법 이외에, 필요에 따라 대체 요법을 사용, 포함 하 여 (1) 갓 제조 0.1% 폴리에틸렌 글리콜 tert-옥틸페닐 에테르, 0.1% 구연산 나트륨, 37°C에서 10 분; (2) HCl (pH 2) 또는 0.25 % 트립신에서 0.25 % 펩신, 37 °C에서 10 분; (3) 0.1 M 구연산염 완충제 (pH 6)로 전자 레인지 조사.
   3. 각 슬라이드에 차단 용액 200 μL (0.1 % PBST로 희석 된 5 % 당나귀 혈청)을 바르고 RT에서 30 분 동안 배양하고 헹구지 않고 차단 용액을 탭하십시오.
   4. 키트에서 공급되는 평형 버퍼의 50 μL을 RT의 각 슬라이드에 10s 이상 적용합니다.
   5. TdT 효소와 키트에 의해 공급되는 반응 완충액을 3:7의 비율로 혼합하여 반응 혼합물(작동 강도 TdT 효소)을 준비합니다. 각 슬라이드에 반응 혼합물의 50 μL을 적용하고, 37 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오. 헹구지 않고 완충액을 탭합니다.
   6. 각 슬라이드에 키트에 의해 공급되는 스톱 버퍼(1:30ddH 2O에서 희석된 1:30)의 200 μL을 적용한 다음 RT에서 10분 동안 인큐베이션합니다.
   7. 로다민 항체로 라벨.
      1. 각 슬라이드에 미리 온난(RT) 안티 디곡시겐 응고체(로다민)(블로킹 용액에 희석된 1:1)를 50 μL을 적용합니다. RT에서 30분 동안 어두운 환경에서 배양합니다.
      2. PBS로 슬라이드를 10분 동안 세 번 헹구십시오. 슬라이드를 3.1.6 단계로 마운트합니다.

4. 이미징 획득

1. 양성 대조군(표적 항원에 대해 양성 조직)을 사용하여 신호 라벨링 및 음성 대조군(표적 항원에 대한 1차 항체, 등형 조절 또는 음성 조직 제외)을 확인하여 형광 아래이미지의 배경을 평가합니다. 현미경.
2. 음극 및 포지티브 컨트롤의 신호 강도를 기반으로 이미징을 위해 장비 및 카메라 조건(노출 및 기타 일반 설정)을 설정합니다.
   참고: 이러한 조건은 (1) 이미징에 사용되는 카메라 및 현미경, (2) 항체 및 (3) 각 실험에 대한 조직에 따라 다릅니다. 두개안면 조직에 사용되는 일반적인 조건은 ISO 200이며 1/100s에서 1s까지의 노출 시간은 항체의 품질과 특이성에 따라 다릅니다. 적절한 배율은 샘플의 크기와 실험 목적에 따라 달라집니다.
3. 기존의 에피오레소레전스 현미경 또는 공초점 현미경으로 이미지를 수집합니다. 각 색상 채널에 대해 동일한 조건에서 이미지(해당 컨트롤 포함)를 수집합니다. 동일한 형식으로 이미지를 저장합니다(tiff는 정보를 보존하는 것이 가장 좋습니다).

5. 형광 정량화

참고: 통계적으로 다른 그룹 사이의 얼룩을 비교하는 것은 많은 경우에 더 유익할 것입니다. 면역형광 이미지를 사용하면 신호 밀도를 측정하거나, 양성 세포를 계산하거나, 양성 영역을 계산하여 단백질의 상대적 수준을 정량화합니다. 통계 분석을 위해, 생물학적으로 독립적인 샘플의 최소 수는 3이다. 일반적인 방법은 각 샘플에서 적어도 3개의 섹션을 생성하고 각 섹션에서 적어도 3개의 대표 영역에 대한 이미지를 찍는 것입니다.

1. ImageJ를 사용하여 형광 강도 정량화
   1. 소프트웨어를 열고 분석 > 측정 설정(값)을 사용하여 면적 및 통합 밀도만 선택되어 있는지 확인합니다. 파일 > 열림을 사용하여 이미지를 열어 분석합니다.
   2. 도구 모음을 사용하여 맨 왼쪽에 있는 사각형 또는 원 아이콘을 선택합니다. 선택 도구를 사용하여 이미지에서 분석할 영역을 선택합니다. 분석 > 측정을 사용하여 선택한 영역의 판독값과 결과 창에서 통합 밀도를 가져옵니다. 배경을 읽을 형광이 없는 양전지 옆의 영역을 선택합니다.
   3. 5.1.2단계를 반복하여 다른 이미지를 분석합니다. 분석할 영역을 첫 번째 이미지의 이미지와 일치하도록 조정했습니다.
   4. 분석이 끝나면 결과 창의 모든 데이터를 복사하고 스프레드시트에 붙여넣습니다.
   5. 보정된 형광 강도(CTCF)를 통합 밀도로 계산합니다(선택한 셀 영역 x 배경 판독값의 평균 형광 영역). 시료 간의 교정된 총 세포 형광의 차이를 비교하고 그래프를 만듭니다.
2. ImageJ를 사용하여 형광 이미지의 양성 세포 수의 정량화
   1. 수동 셀 카운트.
      1. 셀 카운터 플러그인을 설치하려면 ImageJ > 플러그인 > 분석을 사용합니다.
      2. 파일 > 열림을 사용하여 이미지를 열어 분석합니다. 플러그인 > 분석 > 셀 카운터를 사용하여 카운터 창과 결과 창을 엽니다.
         참고: 셀 카운터는 스택에서 작동하지 않습니다. 스택 을 계산하려면 플러그인 플롯 Z 축프로파일을 사용한 다음 이미지 > 스택 > 플롯 Z 축 프로파일을 사용하여 파티클 추적 도구를 사용하여 움직이는 ROI의 강도를 모니터링합니다. 이 도구는 수동 또는 자동 중 하나가 될 수 있습니다.
      3. 카운터 창 하단에 있는 버튼 중 하나를 클릭하여 계산을 시작합니다. 셀/오브젝트를 직접 클릭하여 완료될 때까지 계산합니다.
      4. 카운트 창에서 결과 단추를 클릭합니다. 계산된 총 셀 수는 결과 창에 표시됩니다. 결과 로그를 스프레드시트로 저장하고 분석합니다.
   2. 자동 셀 카운트.
      1. 파일 > 열림을 사용하여 이미지를 열어 분석합니다. 계속하기 전에 RGB 이미지를 회색 배율 이미지로 변환합니다.
      2. 이미지 > 조정 > 임계값을 사용하여 계산해야 하는 모든 영역을 선택합니다.
      3. 분석 > 입자 를 분석하여 셀/파티클 수를 가져옵니다. 특정 범위 내의 셀/파티클을 계산하기 위해 0-Infinity의 기본값 대신 유효한 입자 크기(예: 100-무한대)의 범위를 설정합니다. 결과 로그를 스프레드시트로 저장하고 분석합니다.
         참고: 영역에서 다른 정보를 얻으려면 영역 외에 분석 > 측정 설정으로 이동하여 필요한 정보 옆에 있는 상자를 선택합니다.

결과

배아 두개안면 조직 섹션
상기 단계에 따라, 머리는 배아의 날(E) 16.5 또는 18.5에서대조군(P0-Cre)또는 돌연변이체(신경 문장 세포에서 Bmpr1a, P0-Cre; caBmpr1a)에서배아를 해부하였다. 4 시간 동안 4 % PFA에 고정 한 후, 샘플을 OCT에 내장하고 코로나절하였다. 결과된 절편은 프로토콜에 따라 항원 검색 없이 pSmad1/5/9(다운스트림 BMP 신호 인자) 또는 Ki67(세?...

토론

여기에서 우리는 마우스 헤드 및 dedecalcified 뼈 조직의 준비를 위한 상세한 프로토콜을 제공하고, 세포 증식, 세포 사멸 및 BMP 신호 마커의 면역 염색을 위한 냉동 부피. 우리는 또한 면역 형광 이미지에서 정량적 데이터를 얻기위한 전략을 자세히 설명합니다. 그 방법은 또한 적절한 수정을 가진 그밖 조직에 적용될 수 있습니다.

조직 준비를위한 조건은 조직의 크기와 유형에 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape	Leica	#39475214
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody	Invitrogen	A-11034
Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen	P36931
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
Coverslips	Fisher Brand	12-545-E
Cryostat	Leica	CM1850
EDTA	Sigma	E6758
Fluorescence microscope	Olympus	BX51
Gelatin	Sigma	G1890
In Situ Cell Death Detection Kit	Millipore	S7165
Microscope slides	Fisher Brand	12-550-15
OCT Compound	Fisher Healthcare	23-730-571
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Sigma	T9284	Triton X-100
Proteinase K	Invitrogen	AM2542
Rabbit anti-Ki67 antibody	Cell Signaling Technology	9129	Lot#:3; RRID:AB_2687446
Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody	Cell Signaling Technology	13820	Lot#:3; RRID:AB_2493181
Sodium citrate	Sigma	1613859
Sucrose	Sigma	S9378
Tris	Sigma	10708976001