Preparación de tejidos e inmunomanchación de tejidos craneofaciales de ratón y hueso no descalcificado

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo detallado para detectar y cuantificar los niveles de proteínas durante la morfogénesis/patogénesis craneofacial mediante inmunoutilización utilizando tejidos craneofaciales de ratón como ejemplos. Además, describimos un método para la preparación y criosección de tejidos duros no descalcificados de ratones jóvenes para inmunostaining.

Resumen

La inmunomanchación de tejidos proporciona una detección muy específica y fiable de proteínas de interés dentro de un tejido determinado. Aquí describimos un protocolo completo y simple para detectar la expresión de proteínas durante la morfogénesis/patogénesis craneofacial utilizando los tejidos craneofaciales de ratón como ejemplos. El protocolo consiste en la preparación y criosección de tejidos, inmunofluorescencia indirecta, adquisición de imágenes y cuantificación. Además, se describe un método para la preparación y criosección de tejidos duros no descalcificados para la inmunomancha, utilizando tejidos craneofaciales y huesos largos como ejemplos. Estos métodos son clave para determinar la expresión de proteínas y los cambios morfológicos/anatómicos en diversos tejidos durante la morfogénesis/patogénesis craneofacial. También son aplicables a otros tejidos con modificaciones apropiadas. El conocimiento de la histología y la alta calidad de las secciones son fundamentales para extraer conclusiones científicas de los resultados experimentales. Las posibles limitaciones de esta metodología incluyen, entre otras, la especificidad de los anticuerpos y las dificultades de cuantificación, que también se discuten aquí.

Introducción

La cara es una parte clave de la identidad humana, y se compone de varios tipos diferentes de tejidos, tales como epitelio, músculo, hueso, cartílago, diente. Esos tejidos se derivan de las tres capas germinales: ectoderm, endoderm y mesodermo^1,2. Para un correcto patrón y desarrollo de los tejidos craneofaciales, la proliferación celular, la muerte y la diferenciación deben estar altamente coordinadas y reguladas por vías de señalización específicas, como las vías Wnt, Fgf, Hh y Bmp^{3,4 ,5}. Los defectos en la proliferación, supervivencia o diferenciación de las células conducirán a malformaciones craneofaciales, que se encuentran entre los defectos congénitos congénitos que ocurren con mayor frecuencia. Los ratones transgénicos son herramientas útiles para estudiar mecanismos de morfogénesis craneofacial y patogénesis^1,2,3,4,5. Comprender los cambios en las estructuras craneofaciales durante el desarrollo y la patogénesis ayudará a aclarar los principios clave del desarrollo, así como los mecanismos de las malformaciones craneofaciales^{1,2,3 ,4,5}.

La tinción de todo el montaje o tejidos seccionados con anticuerpos específicos es una técnica invaluable para determinar la distribución espacial de proteínas de interés ⁶. Formalmente, la inmunomanchación tisular puede depender de la inmunohistoquímica (IHC) o de la inmunofluorescencia (IF). En comparación con el producto de reacción opaco generado con un sustrato cromogénico como 3,3'-Diaminobenzidina (DAB) por IHC, IF implica el uso de conjugados fluorescentes visibles por microscopía de fluorescencia. Por lo tanto, IF puede diferenciar claramente las células positivas del ruido de fondo, y permite que las imágenes sean analizadas cuantitativamente y mejoradas de una manera sencilla por software como ImageJ y Adobe Photoshop^7,8. El enfoque de tinción de montaje completo funciona en pequeños bloques de tejido (menos de 5 mm de espesor),que pueden proporcionar información tridimensional sobre la ubicación de las proteínas/antígenos sin necesidad de reconstrucción de las secciones 9,¹⁰ . Sin embargo, en comparación con las secciones de tejido, la inmunomancha de montaje completo consume mucho tiempo y requiere grandes volúmenes de soluciones de anticuerpos. No todos los anticuerpos son compatibles con el enfoque básico de montaje completo. Además, la penetración incompleta de anticuerpos dará lugar a manchas desiguales o falsas manchas negativas. Aquí nos centraremos en la detección de inmunofluorescencia de proteínas/antígenos en tejidos seccionados. Para los tejidos duros (por ejemplo, cabeza, diente, hueso largo), la deposición de calcio durante el desarrollo/patogénesis hace que la muestra sea difícil de seccionar y enjuagar fácilmente durante el tratamiento de inmunomancha^11,12. La mayoría de los protocolos actualmente disponibles descalcifican los tejidos duros antes de incrustarlos para facilitar la sección, lo que consume mucho tiempo y puede destruir morfología y antígenos de las muestras si se manipulan incorrectamente^11,12. Para superar los problemas, optimizamos un enfoque para la criosección de tejidos duros sin descalcificación, lo que conduce a una mejor visualización de su morfología y distribución de proteínas de señalización.

El protocolo descrito aquí se utiliza para determinar los cambios morfométricos e histológicos en los tejidos craneofaciales de los ratones transgénicos BMP. Específicamente, el protocolo incluye (1) la cosecha y disección de tejidos de la cabeza, (2) sección e inmunomanchación de marcadores experimentales (Ki67, pSmad1/5/9) junto con la tinción TUNEL, (3) imágenes de las secciones mediante microscopio de fluorescencia, y finalmente (4) analizar y cuantificar los resultados. El protocolo para preparar y criosección de tejidos duros sin descalcificación también se describe¹³. Estos métodos están optimizados para los tejidos craneofaciales. También son aplicables a otros tejidos de varias edades de muestras con modificaciones apropiadas.

Protocolo

Todos los experimentos con ratones se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices de la Universidad de Michigan que cubren el cuidado humano y el uso de animales en la investigación. Todos los procedimientos animales utilizados en este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Michigan (Protocolo #PRO00007715).

1. Preparación de tejidos

1. Preparación de tejidos embrionarios
   1. Preparar un plato de 10 cm y varios platos de 3,5 cm que contengan solución salina tamponada de fosfato (PBS), y una placa de cultivo de 12 pocillos que contenga 2 ml de 4% de paraformaldehído (PFA) en PBS en cada pocil para cada pocto embarazada. Coloque todos los platos de Petri y el plato sobre hielo.
      NOTA: Manipule 4% PFA en una campana de humo.
   2. Diseccionar embriones de ratones embarazadas en PBS helado con fórceps y tijeras como se describió anteriormente¹⁴.
      1. Brevemente, eutanasia un ratónembarazada con CO 2, agarre la piel debajo del centro del vientre con fórceps y corte a través de la piel solamente, luego tire suavemente de la piel para separarla de la pared muscular abdominal subyacente.
      2. A continuación, cortar en la cavidad abdominal siguiendo la misma línea de la incisión de la piel. Retire el útero que contiene una cadena de embriones y retire los embriones cortando suavemente la pared uterina. Se extirparán los tejidos extraembrionarios, como el saco de yema y el amnion.
      3. Cortar y aislar la cabeza de cada embrión.
   3. Transfiera cada cabeza a cada pocal de una placa de 12 pocillos que contenga un 4% de PFA con una pipeta de transferencia de plástico o fórceps. Fijar las muestras en 4% pfA a 4 oC durante 4 h. Enjuague las muestras en PBS a 4 oC con un suave temblor durante 12 h.
      NOTA: Para embriones menores que el día embrionario 16.5 (E16.5), fije cabezas de embrionario con 4% pfa directamente después del aislamiento. Para embriones a E16.5 o posterior, retire para desechar la piel y el tejido adiposo de la cabeza y enjuague varias veces en PBS helado antes de la fijación.
   4. Cabezas de crioprotección.
      1. Transfiera cada cabeza a una nueva placa de 12 pocillos que contenga 2 ml de sacarosa al 30% en PBS utilizando una pipeta de transferencia de plástico o fórceps. Agitar suavemente a 4 oC hasta que la cabeza se hunda hasta la parte inferior del plato.
   5. Cabezales incrustados.
      1. Transfiera la cabeza crioprotegida a un molde que contenga el compuesto de temperatura de corte óptima (OCT). Equilibrar muestras en OCT durante varios minutos. Ajuste la ubicación y la dirección de las muestras con fórceps.
      2. Coloque el molde sobre hielo seco para congelarlo. Almacene los criomoldes resultantes en una bolsa de plástico a -80 oC hasta que estén listos para la criosección.
         NOTA: El lado recortado de las muestras debe estar frente a la parte inferior del molde de incrustación.
2. Preparación de tejidos duros no descalcificados postnatales
   1. Eutanasia a 3 semanas o 3 meses de edad ratón con CO₂. Retire la piel y los tejidos adiposos. Cortar y aislar la cabeza o huesos largos del ratón.
   2. Fijar y crioproteger la cabeza o hueso largo de los ratones como se describe en los pasos 1.1.3–1.1.4.
   3. Incruste en un 8% de gelatina de manera similar al paso 1.1.5. Mantener los criomoldes en una bolsa de plástico a -80 oC hasta la criosección.
      NOTA: La descalcificación no es necesaria aquí. Para preparar 8% gelatina, mezcle 8 g de gelatina con 100 ml de PBS y hierva con un microondas. Tenga en cuenta que la mezcla hierve fácilmente.

2. Criosección

1. Establezca la temperatura del criostato en -18 oC para los tejidos blandos incrustados en LOS PTU o a -25 oC y más bajo para los tejidos duros no descalcificados incrustados en la gelatina. Mantenga las muestras en la cámara de criostato durante unos 30 minutos para equilibrar las temperaturas del criostato.
2. Expulsar el bloque del criomold. Congele el bloque en el mandril de la muestra (soporte de tejido) mediante el montaje con una gota de OCT. Mantenga el lado recortado de la muestra más alejado del mandril (frente al operador).
3. Cargue el mandril montado en bloque en el soporte del objeto criostato. Ajuste el soporte de la hoja para que el ángulo de la hoja sea de 3 a 5o en relación con la muestra.
4. Recoger secciones de 10 m en portaobjetos recubiertos del microscopio. Seque completamente las secciones en RT, luego guárdelas a -80 oC.

3. Tinción histológica e imágenes microscópicas

1. Tinción de inmunofluorescencia
   1. Saca las diapositivas de -80oC. Mantenga los portaobjetos en RT durante 1 h a secciones secas. Enjuague las diapositivas en 0,1% PBST (0,1% éter de polietilenglicol tert-octilfenilo en PBS; ver Tabla de materiales)tres veces durante 5 minutos cada una para lavar oct y permeabilizar secciones.
   2. Opcionalmente, realice la recuperación de antígenos (opcional).
      1. Tampón de citrato de precalentamiento (10 mM de citrato de sodio pH 6) en el plato de tinción con vapor o baño de agua a 95-100 oC. Sumergir las diapositivas en el tampón de citrato, incubar durante 10 min.
      2. Lleve el plato de tinción de vapor o baño de agua a RT. Enfríe los toboganes a RT durante 20 minutos o más¹⁵.
         NOTA: Como alternativas, utilice el tampón Tris-EDTA (10 mM Tris base, 1mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 9.0) o buffer EDTA (1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 8.0) para la recuperación de antígeno inducido por calor. Utilice una olla a presión, microondas o baño de agua para la recuperación de antígenos inducidos por el calor, además del vapor caliente. Otra alternativa es la recuperación de antígenos inducidos por enzimas mediante tripsina o pepsina. Optimizar la concentración y el tiempo de tratamiento de la recuperación enzimática para evitar dañar las secciones. Optimice el método de recuperación de antígenos para cada combinación de anticuerpos y antígenos.
   3. Incubar cada diapositiva con 200 ml de solución de bloqueo (5% suero de burro diluido en 0,1% PBST) a RT durante 30 minutos, luego retire la solución de bloqueo sin enjuagar.
   4. Incubar cada tobogán con 100 ml de anticuerpo primario o anticuerpos diluidos en solución de bloqueo durante 1 h a RT u O/N a 4 oC. Enjuague los portaobjetos con PBS tres veces durante 10 minutos cada uno en RT.
   5. Incubar cada diapositiva con 100 l de anticuerpo secundario diluido en solución de bloqueo durante 1 h en RT. Enjuague las diapositivas en PBS tres veces durante 10 minutos cada una en RT. Proteja las diapositivas de la luz.
   6. Monte los portaobjetos.
      1. Añadir dos gotas de medio anti-fade con DAPI (4', 6-diamidino-2-phenylindole) en la diapositiva. A continuación, cubrir con un cubreobjetos.
      2. Conservar a 4oC en la oscuridad hasta que esté listo para la imagen.
         NOTA: Como alternativa, etiquete los núcleos con dAPI o hoechst 33324 diluido 1:2.000 en PBS en RT primero, luego montar con glicerol.
2. Terminal desoxinucleorden transferasa dUTP tinción de filo de nick end (TUNEL).
   NOTA: El ADN de doble cadena con 3'-hidroxilo termini (3'OH DNA termini) se formará durante la apoptosis en la célula. Aquí, proporcionamos un protocolo que etiqueta el 3'OH DNA termini in situ gratuito mediante el etiquetado de fragmentos de ADN con el digoxigenin-nucleótido utilizando la transferasa de desoxinucleotidyl terminal (TdT) mediante tinción específica utilizando un kit comercial (ver Tabla de Materiales ).
   1. Opcionalmente, las secciones de manchas con anticuerpos secundarios primarios y Alexa Fluor-488 etiquetados antes de la tinción TUNEL. Enjuague las diapositivas en PBS tres veces durante 10 minutos cada una.
      NOTA: Este paso es opcional para una doble tinción de una proteína y TUNEL en la misma diapositiva.
   2. Incubar cada tobogán con 100 l de proteinasa K (10 g/ml en 10 mM Tris pH 7,5 y 5 mM EDTA) durante 5 min a RT. Enjuague los portaobjetos con PBS tres veces durante 10 minutos cada uno a RT.
      NOTA: Ajuste el tiempo de incubación y la temperatura de Proteinase K para cada tipo de tejido. Para secciones de 10 m de cabezas de embriones fijadas en 4% pfa, incubar durante 5 min a RT. Además del método que utilice Proteinase K, utilice tratamientos alternativos según sea necesario, incluyendo (1) éter de polietilenglicol tert-octilfenilo recién preparado, 0,1% de citrato de sodio, 10 min a 37 oC; (2) 0,25%–0,5% Pepsina en HCl (pH 2) o 0,25% de trippsina, 10 min a 37oC; y (3) irradiación por microondas con tampón de citrato de 0,1 M (pH 6).
   3. Aplicar 200 l de solución de bloqueo (5% suero de burro diluido en 0,1% PBST) a cada diapositiva, incubar a RT durante 30 minutos, toque la solución de bloqueo sin enjuagar.
   4. Aplicar 50 s del tampón de equilibrio suministrado por el kit a cada diapositiva en RT durante al menos 10 s. Toque fuera del búfer sin enjuagar.
   5. Preparar la mezcla de reacción (enzima TdT de fuerza de trabajo) mezclando TdT Enzyme con el tampón de reacción suministrado por el kit en la proporción de 3:7. Aplicar 50 s de la mezcla de reacción en cada diapositiva e incubar a 37 oC durante 1 h. Toque fuera del tampón sin envolver.
   6. Aplicar 200 l del tampón de parada (1:30 diluido en ddH₂O) suministrado por el kit a cada diapositiva, luego incubar a RT durante 10 min.
   7. Etiqueta con anticuerpo Rhodamine.
      1. Aplicar 50 ml de conjugado antidigoxigenina precalentado (RT) (rhodamina) (1:1 diluido en solución de bloqueo) a cada diapositiva. Incubar a RT durante 30 minutos en la oscuridad.
      2. Enjuague los portaobjetos con PBS tres veces durante 10 minutos cada uno. Monte las diapositivas como paso 3.1.6.

4. Adquisición de imágenes

1. Utilice controles positivos (tejidos positivos para el antígeno objetivo) para comprobar el etiquetado de la señal y los controles negativos (omita el anticuerpo primario, el control de isotipos o los tejidos negativos para el antígeno objetivo) para evaluar el fondo de las imágenes bajo el fluorescente Microscopio.
2. Ajuste las condiciones del equipo y de la cámara (exposiciones y otros ajustes generales) para la toma de imágenes en función de la intensidad de la señal de los controles negativos y positivos.
   NOTA: Estas condiciones varían según (1) las cámaras y microscopios utilizados para la toma de imágenes, (2) anticuerpos y (3) tejidos para cada experimento. Las condiciones comunes utilizadas para los tejidos craneofaciales son ISO 200 con un tiempo de exposición que oscila entre 1/100 s y 1 s dependen de la calidad y especificidad de los anticuerpos. Las ampliaciones adecuadas varían dependiendo del tamaño de las muestras y el propósito de los experimentos.
3. Adquiera imágenes con el microscopio de epifluorescencia convencional o el microscopio confocal. Adquirir imágenes (incluidas las de los controles correspondientes) en las mismas condiciones para cada canal de color. Guardar imágenes con el mismo formato (tiff es mejor conservar la información).

5. Cuantificación de Fluorescencia

NOTA: La comparación estadística de la tinción entre diferentes grupos será más informativa en muchos casos. Con las imágenes de inmunofluorescencia, cuantifique el nivel relativo de la proteína midiendo la densidad de la señal, contando células positivas o calculando áreas positivas. Para el análisis estadístico, el número mínimo de muestras biológicamente independientes es 3. Un método típico consiste en generar al menos tres secciones de cada muestra y tomar imágenes para al menos tres áreas representativas en cada sección.

1. Cuantificación de la intensidad de la fluorescencia utilizando ImageJ
   1. Abra el software y utilice Analizar > Establecer mediciones para comprobar que solo se seleccionan el área y la densidad integrada. Utilice Archivo > Abrir para abrir las imágenes que se van a analizar.
   2. Utilice la barra de herramientas para seleccionar el icono cuadrado o circular en el extremo izquierdo. Seleccione el área que desea analizar en la imagen utilizando la herramienta de selección. Utilice Analizar > Medir para obtener la lectura del área seleccionada y la densidad integrada en la ventana Resultados. Seleccione una región junto a una celda positiva que no tenga fluorescencia para leer el fondo.
   3. Repita el paso 5.1.2 para analizar otras imágenes. Se ha ajustado el área a analizar para que coincida con la de la primera imagen.
   4. Copie todos los datos en la ventana Resultados y péguelos en una hoja de cálculo cuando termine de analizar.
   5. Calcule la intensidad de fluorescencia corregida (CTCF) como Densidad Integrada — (área de la celda seleccionada x Fluorescencia media de las lecturas de fondo). Compare la diferencia de la fluorescencia total de células corregida entre las muestras y haga un gráfico.
2. Cuantificación del número celular positivo de imágenes fluorescentes utilizando ImageJ
   1. Conteo manual de celdas.
      1. Utilice ImageJ > Plugins > Análisis para instalar el plugin Cell Counter.
      2. Utilice Archivo > Abrir para abrir las imágenes que se van a analizar. Utilice Plugins > Análisis > Contador de celdas para abrir la ventana Contador y la ventana Resultados.
         NOTA: El contador de celdas no funciona en pilas. Para contar pilas, plugin Trazar perfil de eje Zy, a continuación, utilice Imagen > Pilas > Trazar perfil de eje Z para supervisar la intensidad de un ROI en movimiento mediante una herramienta de seguimiento de partículas. Esta herramienta puede ser manual o automática.
      3. Haga clic en uno de los botones en la parte inferior de la ventana Contador para iniciar el recuento. Haga clic directamente en una celda/objeto para que esté contando hasta el final.
      4. Haga clic en el botón Resultados de la ventana Recuento. El número total de celdas contadas se mostrará en la ventana Resultados. Guarde el registro de resultados como hoja de cálculo y analice.
   2. Recuento automático de células.
      1. Utilice Archivo > Abrir para abrir las imágenes que se van a analizar. Convierta la imagen RGB en una imagen en escala de grises antes de continuar.
      2. Utilice Imagen > Ajustar > Umbral para seleccionar todas las áreas que deben contarse.
      3. Utilice Analizar > Analizar partículas para obtener el número de celdas/partículas. Establezca un rango del tamaño de partícula válido (por ejemplo, 100-Infinity) en lugar del valor predeterminado de 0-Infinity para contar celdas/partículas dentro de un rango específico. Guarde el registro de resultados como hoja de cálculo y analice.
         NOTA: Para obtener otra información de la imagen, además del área, vaya a Analizar > Establecer medidas y seleccione la casilla junto a la información necesaria.

Resultados

Secciones del tejido craneofacial embrionario
Siguiendo los pasos anteriores, las cabezas fueron diseccionadas del control (P0-Cre) o mutante (activado constitutivamente Bmpr1a en células de cresta neural, P0-Cre; caBmpr1a) embriones en el día embrionario (E) 16.5 o 18.5. Después de la fijación en 4% PFA durante 4 h, las muestras se incrustaron en OCT y crioseccionado coronally. Las secciones resultantes fueron inmunomanchadas con anticuerpos cont...

Discusión

Aquí proporcionamos un protocolo detallado para la preparación de la cabeza del ratón y los tejidos óseos no descalcificados, y la criosección para la inmunopreservación de la proliferación celular, la muerte celular y los marcadores de señalización BMP. También detallamos la estrategia para obtener datos cuantitativos de imágenes inmunofluorescentes. Estos métodos también pueden ser aplicables a otros tejidos con modificaciones apropiadas.

Las condiciones para la preparación del...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape	Leica	#39475214
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody	Invitrogen	A-11034
Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen	P36931
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
Coverslips	Fisher Brand	12-545-E
Cryostat	Leica	CM1850
EDTA	Sigma	E6758
Fluorescence microscope	Olympus	BX51
Gelatin	Sigma	G1890
In Situ Cell Death Detection Kit	Millipore	S7165
Microscope slides	Fisher Brand	12-550-15
OCT Compound	Fisher Healthcare	23-730-571
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Sigma	T9284	Triton X-100
Proteinase K	Invitrogen	AM2542
Rabbit anti-Ki67 antibody	Cell Signaling Technology	9129	Lot#:3; RRID:AB_2687446
Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody	Cell Signaling Technology	13820	Lot#:3; RRID:AB_2493181
Sodium citrate	Sigma	1613859
Sucrose	Sigma	S9378
Tris	Sigma	10708976001