JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем подробный протокол для обнаружения и количественной оценки уровня белка во время черепно-мозгового морфогенеза / патогенеза путем иммуносохранения с помощью мыши черепно-лицевой ткани в качестве примеров. Кроме того, мы описываем метод приготовления и криоотделения недекальцифицированных твердых тканей у молодых мышей для иммунодефицита.

Аннотация

Ткань иммуностоинга обеспечивает высокоспецифическое и надежное обнаружение белков, представляющих интерес в данной ткани. Здесь мы описываем полный и простой протокол для обнаружения экспрессии белка во время черепно-мозгового морфогенеза/ патогенеза с использованием мышичерепных тканей в качестве примеров. Протокол состоит из подготовки и криоотделения тканей, косвенной иммунофлуоресценции, приобретения изображения и количественной оценки. Кроме того, описан метод подготовки и криоотделения недекальцифицированных твердых тканей для иммуностоинга, в качестве примеров используется черепно-мозговая ткани и длинные кости. Эти методы являются ключевыми для определения экспрессии белка и морфологических / анатомических изменений в различных тканях во время черепно-мозгового морфогенеза / патогенеза. Они также применимы к другим тканям с соответствующими изменениями. Знание гистологии и высокое качество разделов имеют решающее значение для того, чтобы сделать научные выводы из экспериментальных результатов. Потенциальные ограничения этой методологии включают, но не ограничиваются спецификой антител и трудностями количественной оценки, которые также обсуждаются здесь.

Введение

Лицо является ключевой частью человеческой идентичности, и состоит из нескольких различных типов тканей, таких как эпителий, мышцы, кости, хрящи, зуб. Эти ткани являются производными от всех трех слоев зародыша: эктодерм, эндодерм, и мезодерм1,2. Для правильного узорства и развития черепно-мозговых тканей, пролиферации клеток, смерти и дифференциации должны быть высоко скоординированы и регулируются конкретными сигнальными путями, такими как Wnt, Fgf, Hh и Bmp пути3,4 ,5. Дефекты пролиферации, выживания или дифференциации клеток приведут к черепно-мозговым порокам развития, которые являются одними из наиболее часто встречающихся врожденных дефектов. Трансгенные мыши являются полезными инструментами дляизучения механизмов краниофациального морфогенеза и патогенеза1,2,3,4. Понимание изменений в черепно-мозговых структурах во время развития и патогенеза поможет прояснить ключевые принципы развития, а также механизмы черепно-мозговых пороковразвития1,2,3 ,4,5.

Окрашивание целых креплений или секционированных тканей с конкретными антителами является бесценным методом для определения пространственного распределения белков, представляющих интерес 6. Формально иммуностоидирование тканей может опираться либо на иммуногистохимию (IHC), либо на иммунофлуоресценцию (ИФ). По сравнению с непрозрачным продуктом реакции, генерируемым с хромогенным субстратом, таким как 3,3'-Диаминобензидин (DAB) IHC, IF включает в себя использование флуоресцентных конъюгатов, видимых флуоресценцией микроскопии. Таким образом, ЕСЛИ может четко дифференцировать положительные клетки от фонового шума, и позволяет изображения, которые будут количественно проанализированы и расширены в простой моды с помощью программного обеспечения, таких как ImageJ и Adobe Photoshop7,8. Весь подход крепления окрашивания работает на небольших блоках ткани (толщиной менее 5 мм), которые могут предоставить трехмерную информацию о расположении белков/антигенов без необходимости реконструкции из разделов9,10 . Однако, по сравнению с секциями тканей, цельное иммуносирование монтирует много времени и требует больших объемов антител. Не все антитела совместимы с основным подходом всего крепления. Кроме того, неполное проникновение антител приведет к неравномерному окрашиванию или ложному отрицательному окрашиванию. Здесь мы сосредоточимся на иммунофлуоресценции обнаружения белков / антигенов на разделенных тканей. Для твердых тканей (например, головы, зуба, длинной кости), осаждение кальция во время развития / патогенез делает образец трудно сечения и легко промыть во время иммуно-денсивного лечения11,12. Большинство имеющихся в настоящее время протоколов декальцифифицировать твердые ткани перед встраиванием, чтобы сделать секционирование легче, что отнимает много времени и может уничтожить морфологию и антигены образцов, если обращаться неправильно11,12. Чтобы преодолеть проблемы, мы оптимизировали подход к криоотделению твердых тканей без декальцинации, что привело к улучшению визуализации их морфологии и распространению сигнальных белков.

Описанный здесь протокол используется для определения морфометрических и гистологических изменений в черепно-мозговых тканях трансгенных мышей БМП. В частности, протокол включает в себя (1) уборку и вскрытие тканей головы, (2) раздел и иммуностонинг экспериментальных маркеров (Ki67, pSmad1/5/9) наряду с окрашиванием TUNEL, (3) визуализацией секций с использованием флуоресцентного микроскопа и, наконец, (4) анализ и количественная оценка результатов. Протокол для подготовки и криосецификации твердых тканей без декальцинации также описано13. Эти методы оптимизированы для черепно-мозговых тканей. Они также применимы к другим тканям разного возраста образцов с соответствующими модификациями.

протокол

Все эксперименты с мышью проводились в соответствии с руководящими принципами Мичиганского университета, охватывающими гуманный уход и использование животных в исследованиях. Все процедуры для животных, используемые в этом исследовании, были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию (IACUC) при Мичиганском университете (Протокол #PRO00007715).

1. Подготовка тканей

  1. Подготовка эмбриональных тканей
    1. Приготовьте одну тарелку 10 см и несколько 3,5 см блюд, содержащих фосфат буферный солен (PBS), и одну 12-колодую культурную тарелку, содержащую 2 мл 4% параформальдегида (PFA) в PBS в каждой скважине для каждой беременной мыши. Поместите все блюда Петри и тарелку на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка 4% PFA в дым капота.
    2. Вскрыть эмбрионы беременных мышей в ледяной PBS с щипками и ножницами, как ранее описано14.
      1. Кратко, усыпить беременнуюмышь с CO 2, захватить кожу ниже центра живота с щипками и прорезать только кожу, затем осторожно тянуть на кожу, чтобы отделить его от основной стенки мышц живота.
      2. Далее, нарезать брюшной полости после той же линии разреза кожи. Удалить матку, содержащую строку эмбрионов и удалить эмбрионы, мягко отрезав стенки матки. Экстраэмбриональные ткани, такие как желтковый мешок и амнион будут удалены.
      3. Вырезать и изолировать голову от каждого эмбриона.
    3. Перенесите каждую голову в каждую скважину 12-ну хорошей пластины, содержащей 4% PFA с пластиковой передачей пипетки или щипц. Исправьте образцы в 4% ПФА при 4 градусах по Цельсию при 4 ч. Промыть образцы в PBS при 4 градусах Цельсия с нежной тряской в течение 12 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для эмбрионов моложе эмбрионального дня 16,5 (E16.5), исправить эмбриона головы с 4% ПФА непосредственно после изоляции. Для эмбрионов на E16.5 или позже, удалить, чтобы отбросить кожу и жировой ткани из головы и промыть несколько раз в ледяной PBS перед фиксацией.
    4. Криозащита головы.
      1. Перенесите каждую голову в новую 12-ну хорошую пластину, содержащую 2 мл 30% сахарозы в PBS с помощью пластиковой передачи пипетки или щипцы. Агитировать осторожно при 4 градусах Цельсия, пока голова не опустится на дно блюда.
    5. Вставлять головы.
      1. Передача криозащищенной головы в форму, содержащую Оптимальную температуру резки (OCT) соединения. Равновесие образцов в ОКТ в течение нескольких минут. Отрегулируйте расположение и направление образцов с помощью щипков.
      2. Поместите форму на сухой лед, чтобы заморозить. Храните в результате криомольды в полиэтиленовый пакет при -80 градусов по Цельсию до готовности к криоотделению.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Обрезанная сторона образцов должна смотреть на дно встраивающей формы.
  2. Подготовка послеродовых недекалированных твердых тканей
    1. Euthanize на 3 недели или 3 месяца мыши с CO2. Удалите кожу и жировые ткани. Вырезать и изолировать голову или длинные кости от мыши.
    2. Исправить и криозащитить голову или длинную кость мышей, как описано в шагах 1.1.3-1.4.
    3. Встраиваем в 8% желатин таким же образом, как шаг 1.1.5. Храните криомольды в полиэтиленовом пакете при -80 градусов по Цельсию до криосекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Декалькация здесь не нужна. Для приготовления 8% желатина смешайте 8 г желатина со 100 мл PBS и варите с помощью микроволновой печи. Имейте в виду, что смесь кипит легко.

2. Криосекция

  1. Установите температуру криостата до -18 градусов по Цельсию для мягких тканей, встроенных в OCT или -25 градусов по Цельсию и ниже для недекалкированных твердых тканей, встроенных в желатин. Держите образцы в криосаткамере около 30 минут, чтобы уравновесить температуру криостата.
  2. Изгнать блок из криомолд. Заморозить блок на образец патрон (держатель ткани) через монтаж с падением OCT. Держите обрезанную сторону образца дальше от патрона (лицом к оператору).
  3. Загрузите блок-установленный патрон на держатель объекта криостата. Отрегулируйте держатель лезвия, чтобы угол клинка был 3-5 градусов по отношению к образцу.
  4. Соберите 10 мкм разделов на покрытые слайды микроскопа. Сухие секции полностью на RT, а затем хранить их при -80 градусов по Цельсию.

3. Гистологическое окрашивание и микроскопическая визуализация

  1. Иммунофлуоресценция окрашивания
    1. Выньте слайды от -80 градусов по Цельсию. Держите слайды на RT в течение 1 ч до воздушных секций. Промыть слайды в 0,1% PBST (0,1% Полиэтилен гликоль терт-октилфенил эфир в PBS; см. Таблица материалов) три раза в течение 5 мин каждый, чтобы вымыть OCT и permeabilize разделов.
    2. Дополнительно, выполнять антиген поиска (необязательно).
      1. Разогреть цитрат ный буфер (10 мм натрия цитрат рН 6) в окрашивание блюдо с пароходом или водяной бане до 95-100 градусов по Цельсию. Погрузите слайды в цитратный буфер, инкубируют в течение 10 минут.
      2. Возьмите окрашивание блюдо из парохода или водяной ванны для RT. Охладите слайды на RT в течение 20 минут или дольше15.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы используйте буфер Tris-EDTA (база 10 мм Tris, 1mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 9.0) или буфер EDTA (1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 8.0) для поиска антигена, индуцированного в теплом. Используйте скороварку, микроволновую печь или водяную баню для поиска антигена, вызванного теплом, в дополнение к горячему пароходу. Фермент-индуцированной антигена поиска с использованием трипсина или пепсина является еще одной альтернативой. Оптимизируйте концентрацию и время обработки ферментативного поиска, чтобы избежать повреждения секций. Оптимизируйте метод извлечения антигена для каждой комбинации антител/антигенов.
    3. Инкубировать каждый слайд с 200 злителком блокирующего раствора (5% ослиной сыворотки, разбавленной в 0,1% PBST) на RT в течение 30 мин, затем удалите блокирующий раствор без промывки.
    4. Инкубировать каждый слайд с 100 злител первичных антител или антител, разбавленных в блокирующем растворе в течение 1 ч при РТ или O/N при 4 градусах По Цельсию. Промыть слайды с PBS три раза в течение 10 минут каждый на RT.
    5. Инкубировать каждый слайд с 100 л вторичных антител, разбавленных в блокирующем растворе в течение 1 ч на RT. Промыть слайды в PBS три раза в течение 10 минут каждый на RT. Защитите слайды от света.
    6. Горные горки.
      1. Добавьте две капли анти-увядения среды с DAPI (4', 6-диамидино-2-фенилиндол) на слайде. Затем накройте крышкой.
      2. Хранить при 4 градусах по Цельсию в темноте до готовности к изображению.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, этикетка ядра с DAPI или Hoechst 33324 красителя разбавленной 1:2,000 в PBS на RT, а затем смонтировать с глицеролом.
  2. Терминал deoxynucleotidyl transferase dUTP ник конец маркировки (TUNEL) окрашивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Двухцепочечная ДНК с 3'-гидроксил термини (3'OH ДНК termini) будет образовываться во время апоптоза в клетке. Здесь мы предоставляем протокол, который маркирует свободный 3'OH ДНК termini in situ через маркировку фрагментов ДНК с digoxigenin-нуклеотид, используя терминал дезоксинуклеотидидной передачи (TdT) по конкретным окрашивания с помощью коммерческого комплекта (см. Таблица материалов ).
    1. Дополнительно, пятно разделы с первичной и Alexa Fluor-488 помечены вторичные антитела до tuneL окрашивания. Промыть слайды в PBS три раза в течение 10 минут каждый.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг является необязательным для двойного окрашивания белка и TUNEL в том же слайде.
    2. Инкубировать каждый слайд с 100 мл Протеиназа K (10 мкг/мл в 10 мм Tris рН 7,5 и 5 мМ EDTA) в течение 5 минут на RT. Промыть слайды с PBS три раза в течение 10 минут каждый на RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время инкубации и температуру Протеиназа K для каждого типа ткани. Для 10 мкм секций эмбриона головы фиксированной в 4% PFA, инкубировать в течение 5 мин на RT. В дополнение к методу использования Proteinase K, использовать альтернативные методы лечения по мере необходимости, в том числе (1) свежеприготовленные 0,1% Полиэтилен гликоль терт-октилфенил эфир, 0,1% цитрат натрия, 10 мин при 37 градусов по Цельсию; (2) 0,25%-0,5% Пепсина в HCl (pH 2) или 0,25% трипсин, 10 мин при 37 градусах Цельсия; и (3) микроволновое облучение буфером цитрата 0,1 М (pH 6).
    3. Нанесите 200 зл блокирующего раствора (5% сыворотки осла, разбавленной в 0,1% PBST) на каждый слайд, инкубировать на RT в течение 30 минут, сняйте блокирующий раствор без промывки.
    4. Нанесите 50 зл ибуфер аквесибрации, поставляемый комплектом, на каждый слайд на RT не менее 10 с. Нажмите с буфера без промывки.
    5. Подготовьте реакционную смесь (рабочая прочность фермента TdT) путем смешивания фермента TdT с буфером реакции, поставляемым комплектом в соотношении 3:7. Нанесите 50 qL реакции смеси на каждый слайд, и инкубировать при 37 кв кв. м в течение 1 ч. Нажмите с буфера без промывки.
    6. Нанесите 200 л стоп-буфера (1:30, разбавленного в ddH2O), поставляемого комплектом на каждый слайд, затем инкубировать на RT в течение 10 минут. Промыть слайды с PBS три раза в течение 10 минут каждый.
    7. Этикетка с родамин антитела.
      1. Нанесите 50 конъюгина анти-дигоксигенина (родамина) (1:1, разбавленного в блокирующем растворе) на каждый слайд. Инкубировать на RT в течение 30 минут в темноте.
      2. Промыть слайды с PBS три раза в течение 10 минут каждый. Монтировать слайды как шаг 3.1.6.

4. Приобретение изображений

  1. Используйте положительные элементы управления (ткани положительные для целевого антигена), чтобы проверить маркировку сигналов и отрицательный контроль (опустить первичное антитело, контроль изоттипа, или ткани, отрицательные для целевого антигена) для оценки фона изображений под флуоресцентным Микроскоп.
  2. Установите условия оборудования и камеры (экспозиции и другие общие настройки) для визуализации на основе интенсивности сигнала отрицательного и положительного элементов управления.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти условия варьируются в зависимости от (1) камер и микроскопов, используемых для визуализации, (2) антител и (3) тканей для каждого эксперимента. Общие условия, используемые для черепно-лицевой ткани ISO 200 с воздействием времени от 1/100 до 1 с зависит от качества и специфичности антител. Соответствующие увеличения варьируются в зависимости от размера образцов и цели экспериментов.
  3. Приобретайте изображения с помощью обычного эпифлюоресцентного микроскопа или конфокального микроскопа. Приобретайте изображения (в том числе соответствующие элементы управления) в одинаковых условиях для каждого цветного канала. Сохранить изображения в том же формате (tiff лучше всего сохранить информацию).

5. Количественная оценка флуоресценции

ПРИМЕЧАНИЕ: Статистические сравнения окрашивания между различными группами будет более информативным во многих случаях. С изображениями иммунофлуоресценции, количественно относительный уровень белка путем измерения плотности сигнала, подсчета положительных клеток, или расчета положительных областей. Для статистического анализа минимальное число биологически независимых образцов составляет 3. Типичный метод заключается в том, чтобы генерировать по крайней мере три раздела из каждого образца и принимать изображения, по крайней мере, для трех репрезентативных областей в каждом разделе.

  1. Количественная оценка интенсивности флуоресценции с использованием ImageJ
    1. Откройте программное обеспечение, и используйте Анализ (RuGT; Set Measurements), чтобы проверить, что выбираются только область и интегрированная плотность. Используйте файл и открыть для открытия изображения для анализа.
    2. Используйте панель инструментов, чтобы выбрать значок квадрата или круга в крайнем левом конце. Выберите область, которая будет проанализирована на изображении с помощью инструмента выбора. Используйте анализить и измерения, чтобы получить считыватель выбранной области и плотности интегрированной в окно результатов. Выберите область рядом с положительной клеткой, которая не имеет флуоресценции, чтобы зачитать фон.
    3. Повторите шаг 5.1.2 для анализа других изображений. Скорректирована область, которая будет проанализирована, чтобы соответствовать первому изображению.
    4. Копируйте все данные в окне результатов и вставьте в электронную таблицу при завершении анализа.
    5. Рассчитайте скорректированную интенсивность флуоресценции (CTCF) как интегрированная плотность – (Область выбранной ячейки x Средняя флуоресценция фоновых показаний). Сравните разницу исправленной общей флуоресценции клеток между образцами и сделайте график.
  2. Количества положительного количества клеток флуоресцентных изображений с помощью ImageJ
    1. Ручной подсчет ячеек.
      1. Используйте ImageJ , плагины , чтобы установить плагин Cell Counter.
      2. Используйте файл и открыть для открытия изображения для анализа. Используйте плагины (ru) и анализ( а стоильный счетчик, чтобы открыть окно счетчика и окно результатов.
        ПРИМЕЧАНИЕ: Счетчик ячейки не работает на стеках. Для подсчета стеков, плагин Участок и axis профиль, а затем использовать изображение йgt; Стеки »gt; Участок и axis профиль для мониторинга интенсивности движущихся рентабельность инвестиций с помощью инструмента отслеживания частиц. Этот инструмент может быть как ручным, так и автоматическим.
      3. Нажав одну из кнопок в нижней части окна Счетчика, чтобы начать подсчет. Нажмите прямо на ячейку / объект, чтобы рассчитывать до окончания.
      4. Нажмите кнопку «Результаты» в окне Count. Общее количество подсчитанных ячеек будет отображаться в окне результатов. Сохранить журнал результатов в виде электронной таблицы и проанализировать.
    2. Автоматизированный подсчет клеток.
      1. Используйте файл и открыть для открытия изображения для анализа. Перед началом работы преобразуйте изображение RGB в изображение серого масштаба.
      2. Используйте изображение , чтобы скорректировать порог, чтобы выбрать все области, которые должны быть подсчитаны.
      3. Используйте анализить и анализировать частицы, чтобы получить количество клеток / частиц. Установите диапазон допустимого размера частиц (например, 100-Бесконечность) вместо значения 0-Бесконечности для подсчета клеток/частиц в определенном диапазоне. Сохранить журнал результатов в виде электронной таблицы и проанализировать.
        ПРИМЕЧАНИЕ:         Чтобы получить другую информацию из изображения, кроме области, перейдите на анализ и установить измерения и выбрать поле рядом с необходимой информацией.

Результаты

Эмбриональные участки черепно-мозговой ткани
После вышеуказанных шагов, головы были расчленены от управления(P0-Cre) или мутант (в обязательно активированный Bmpr1a в нервных клетках гребня, P0-Cre; caBmpr1a) зародышить на зародышевом дне (E) 16.5 или 18.5. После фик...

Обсуждение

Здесь мы предоставляем подробный протокол для подготовки головы мыши и недекальцифицированных костных тканей, а также криосекции для иммуносточки зрения клеточной пролиферации, клеточной смерти и сигнальных маркеров БМП. Мы также подробно описываем стратегию получения количественн...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (R01DE020843 до Y.M.), Международной ассоциацией ФОП (Y.M.), а также грантом от Национального фонда естественных наук Китая (31500788 до J.Y.).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Adhesive tapeLeica#39475214
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibodyInvitrogenA-11034
Antifade Mountant with DAPIInvitrogenP36931
Bovine serum albuminSigmaA2153
CoverslipsFisher Brand12-545-E
CryostatLeicaCM1850
EDTASigmaE6758
Fluorescence microscopeOlympusBX51
GelatinSigmaG1890
In Situ Cell Death Detection KitMilliporeS7165
Microscope slidesFisher Brand12-550-15
OCT CompoundFisher Healthcare23-730-571
Paraformaldehyde (PFA)SigmaP6148 
Phosphate buffered saline (PBS)SigmaP4417
Polyethylene glycol tert-octylphenyl etherSigmaT9284Triton X-100
Proteinase KInvitrogenAM2542
Rabbit anti-Ki67 antibodyCell Signaling Technology9129Lot#:3; RRID:AB_2687446
Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibodyCell Signaling Technology13820Lot#:3; RRID:AB_2493181
Sodium citrateSigma1613859
SucroseSigmaS9378
TrisSigma10708976001

Ссылки

  1. Trinh, L. e. A., Fraser, S. E. Imaging the cell and molecular dynamics of craniofacial development: challenges and new opportunities in imaging developmental tissue patterning. Current Topics in Developmental Biology. 115, 599-629 (2015).
  2. Marcucio, R., et al. Facial morphogenesis: physical and molecular interactions between the brain and the face. Current Topics in Developmental Biology. 115, 299-320 (2015).
  3. Graf, D., et al. Common mechanisms in development and disease: BMP signaling in craniofacial development. Cytokine & Growth Factor Reviews. 27, 129-139 (2016).
  4. Snider, T. N., Mishina, Y. Cranial neural crest cell contribution to craniofacial formation, pathology, and future directions in tissue engineering. Birth Defects Research Part C: Embryo Today. 102 (3), 324-332 (2014).
  5. Mishina, Y., Snider, T. N. Neural crest cell signaling pathways critical to cranial bone development and pathology. Experimental Cell Research. 325 (2), 138-147 (2014).
  6. Van Hecke, D. Routine Immunohistochemical Staining Today: Choices to Make, Challenges to Take. Journal of Histotechnology. 1, 45-54 (2002).
  7. Xiao, C., Dan-Bi, C. Double staining immunohistochemistry. North American Journal of Medical Sciences. 2 (5), 241-245 (2010).
  8. Zongli, Q., et al. Comparison of immunofluorescence and immunohistochemical staining with anti-insulin antibodies on formalin-fixed paraffin-embedded human pancreatic tissue microarray sections. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 10 (3), 3671-3676 (2017).
  9. Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole mount dissection and immunofluorescence of the adult mouse cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), e53561 (2016).
  10. Dun, X. P., Parkinson, D. B. Whole mount immunostaining on mouse sciatic nerves to visualize events of peripheral nerve regeneration. Methods in Molecular Biology. 1739, 339-348 (2018).
  11. Akkiraju, H., et al. An Improved Immunostaining and Imaging Methodology to Determine Cell and Protein Distributions within the Bone Environment. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 64 (3), 168-178 (2016).
  12. González-Chávez, S. A., et al. Assessment of different decalcifying protocols on Osteopontin and Osteocalcin immunostaining in whole bone specimens of arthritis rat model by confocal immunofluorescence. International Journal of Clinical and Experimental Pathology. 6 (10), 1972-1983 (2013).
  13. Kapelsohn, K. Improved Methods for Cutting, Mounting, and Staining Tissue for Neural Histology. Protocol Exchange. , (2015).
  14. Kalaskar, V. K., Lauderdale, J. D. Mouse embryonic development in a serum-free whole embryo culture system. Journal of Visualized Experiments. (85), e50803 (2014).
  15. Shi, S. R., et al. Antigen retrieval techniques: current perspectives. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 49 (8), 931-937 (2001).
  16. Adell, T., et al. Immunohistochemistry on paraffin-embedded planarian tissue sections. Methods in Molecular Biology. 1774, 367-378 (2018).
  17. Griffioen, H. A., et al. Gelatin embedding to preserve lesion-damaged hypothalami and intracerebroventricular grafts for vibratome slicing and immunocytochemistry. Journal of Neuroscience Methods. 43, 43-47 (1992).
  18. Sarkar, S., et al. In situ demonstration of Fluoro-Turquoise conjugated gelatin for visualizing brain vasculature and endothelial cells and their characterization in normal and kainic acid exposed animals. Journal of Neuroscience Methods. 219 (2), 276-284 (2013).
  19. Oorschot, V., et al. A novel flat‐embedding method to prepare ultrathin cryosections from cultured cells in their in situ orientation. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 50, 1067-1080 (2002).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

147

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены