Fare Kraniyofacial dokularda ve Undecalcified kemik doku hazırlama ve Immünostasyon

Özet

Burada, kraniyofasiyal morphogenesis/patogenezi sırasında protein düzeylerini algılamak ve ölçmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz Buna ek olarak, immünostasyon için genç farelerden undecalcified Sert dokularda hazırlama ve donuk kesit için bir yöntem açıklanmaktadır.

Özet

Doku immünostası, belirli bir doku içinde ilgi proteinlerinin son derece spesifik ve güvenilir tespiti sağlar. Burada, kraniyofasiyal morphogenesis/patogenezi sırasında fare kraniyofasin dokularında örnek olarak protein ifadesini algılamak için tam ve basit bir protokol açıklanmaktadır. Protokol, dokuların preparasyon ve kriyobölümlenmesini, dolaylı immünofluoresesans, görüntü edinme ve miktarlama içerir. Buna ek olarak, immünostasyon için undecalcified Sert dokularda hazırlık ve donuk kesit için bir yöntem tarif edilir, örnek olarak kraniyofasiyal dokular ve uzun kemikler kullanılarak. Bu yöntemler, kraniyofacial morfogenik/patogenezi sırasında çeşitli dokularda protein ifadesi ve morfolojik/anatomik değişikliklerin belirlenmesi için anahtardır. Onlar da uygun modifikasyonlar ile diğer dokular için geçerlidir. Histolojinin bilgi ve yüksek kalite bölümleri deneysel sonuçlardan bilimsel sonuçlar çekmek için önemlidir. Bu metodolojinin potansiyel sınırlamaları şunlardır ancak antikorların özgüllüğü ve burada da tartışılan ölçüme karşı zorluklar ile sınırlı değildir.

Giriş

Yüz insan kimliğinin önemli bir parçasıdır ve epitelyum, kas, kemik, kıkırdak, diş gibi çeşitli farklı dokulardan oluşur. Bu dokular üç germ katmanından türetilmiştir: ectoderm, endoderm, ve mezoderm^1,2. Kraniyofasin dokularının uygun desenleme ve gelişimi için, hücre proliferasyonu, ölüm ve farklılaşma WNT, fgf, hh ve BMP yollar^{3,4 gibi belirli sinyal yolları tarafından son derece koordine ve düzenlenmiş olması gerekir ,5}. Proliferasyon, hayatta kalma veya hücrelerin farklılaşma kusurları, en sık görülen konjenital Doğum kusurları arasında bulunan kraniyofasiyal malformasyonlara yol açacaktır. Transjenik fareler kraniyofasiyal morfogenez ve patogenezi^1,2,3,4,5mekanizmaları çalışma için yararlı araçlardır. Geliştirme ve patogenezi sırasında kraniyofasiyal yapılardaki değişikliklerin anlaşılması, anahtar gelişimsel prensiplerin yanı sıra kraniyofasiyal malformasyonların mekanizmalarının açıklığa kavuşturulmasına yardımcı olacaktır^{1,2,3 ,4,5}.

Tüm montaj veya özel antikorlar ile kesitli dokuların boyama ilgi proteinlerinin uzamsal dağılımı belirlemek için paha biçilmez bir tekniktir ⁶. Resmi olarak, doku immünostans immunhistokimya veya immünofluorescence (IF) üzerine güvenebilir. IFC tarafından 3, 3 '-diaminobenzidin (DAB) gibi bir kromojenik substrat ile oluşturulan opak reaksiyon ürünü ile karşılaştırıldığında, floresan Konjugat floresans mikroskobu ile görülebilir kullanımını içerir. Bu nedenle, Eğer net bir şekilde arka plan gürültüsünden pozitif hücreleri ayırt edebilir ve görüntüler nicekatif olarak analiz ve ımagej ve Adobe Photoshop^7,8gibi yazılım tarafından basit bir moda geliştirilmiş sağlar. Tüm Mount boyama yaklaşımı doku küçük bloklar üzerinde çalışır (daha az 5 mm kalınlığında), hangi bölümlerden yeniden yapılanma için gerek kalmadan proteinlerin/antijenler konumu hakkında üç boyutlu bilgi sağlayabilir^9,10 . Ancak, doku bölümleri ile karşılaştırıldığında, tüm immünostüajlı montaj zaman alıcı ve antikor çözeltileri büyük hacimli gerektirir. Tüm antikorlar temel tüm montaj yaklaşımı ile uyumludur. Buna ek olarak, antikorların tamamlanmamış penetrasyonunu düzensiz boya veya yanlış negatif boyama neden olur. Burada, kesitli dokularda proteinler/antijenlerin immünofluoresesans tespiti üzerine odaklanacağız. Sert dokularda (örn. baş, diş, uzun kemik), gelişim sırasında kalsiyum birikimi/patogenezi numunenin bölüm için zor hale getirir ve immünostam tedavisi sırasında kolayca durulanır^11,12. Şu anda mevcut protokoller çoğu zaman tüketen ve yanlış işlenmiş ise numunelerin Morfoloji ve antijenleri yok edebilir, kesit daha kolay yapmak için katıştırma önce sert dokulara kireçsizleştirir^11,12. Sorunları aşmak için, biz kireç çözücü olmadan sert dokuların donuk kesit için bir yaklaşım optimize, onların Morfoloji ve sinyal proteinlerinin dağılımı geliştirilmiş görselleştirme yol.

Burada açıklanan protokol, BMP transjenik fareler kraniyofacial dokularda morfometrik ve histolojik değişiklikler belirlemek için kullanılmaktadır. Özellikle, protokol (1) hasat ve diseksiyon kafa dokularında, (2) bölümü ve deneysel işaretçileri (Ki67, pSmad1/5/9) ile birlikte TUNEL boyama, (3), floresan mikroskop kullanarak bölümler görüntüleme ve son olarak (4) immünosterleme içerir sonuçları analiz etmek ve ölçmek. Hazırlama ve çürütme olmadan sert dokular kriyosection için protokol de¹³açıklanmıştır. Bu yöntemler kraniyofasiyal dokular için optimize edilmiştir. Onlar da uygun modifikasyonlar ile numunelerin çeşitli yaştan diğer dokular için geçerlidir.

Protokol

Tüm fare deneyler, araştırma hayvanların insani bakım ve kullanımı kapsayan Michigan Üniversitesi kurallarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmada kullanılan tüm hayvan prosedürleri, Michigan Üniversitesi 'nde (protokol #PRO00007715) Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıesuc) tarafından onaylanmıştır.

1. doku hazırlama

1. Embriyonik dokuların hazırlanması
   1. Hazırlamak 1 10 cm çanak ve fosfat tamponlu tuz (PBS) içeren birkaç 3,5 cm yemekler, ve 1 12-iyi kültür plaka içeren 2 ml 4% civarında formaldehite (PFA) her iyi her hamile fare için PBS içinde. Tüm Petri yemekleri ve plaka buzun üzerine yerleştirin.
      Not: Bir duman kaputu içinde% 4 PFA kolu.
   2. Daha önce¹⁴açıklandığı gibi forseps ve makas ile buz-soğuk PBS hamile fareler embriyolar dissect.
      1. Kısaca, CO₂ile hamile bir fare ötenize, forseps ile göbek merkezinin altında cilt kapmak ve sadece cilt üzerinden kesilmiş, sonra yavaşça altta yatan karın kas duvarından ayırmak için cilde çekin.
      2. Sonra, cilt kesi aynı çizgiyi takiben karın boşluğuna kesilmiş. Embriyolar bir dize içeren rahim çıkarın ve nazikçe uterus duvarı keserek embriyoları çıkarın. Sarısı kesesi ve amonyon gibi extraembryonik dokular kaldırılacaktır.
      3. Her embriyonun kafasını kesip izole et.
   3. Her kafasını, plastik transfer pipet veya forseps ile% 4 PFA içeren 12 kuyu plakasının her bir kuyunda aktarın. 4 °C ' de 4 ° ' de 4% PFA 'da numuneleri düzeltin. 4 °C ' de PBS 'de örnekleri 12 saat boyunca nazikçe sallayarak durulayın.
      Not: Embriyonik gün 16,5 (E 16.5) daha genç embriyolar için, izolasyondan sonra doğrudan% 4 PFA ile embriyo kafaları düzeltin. E 16.5 veya sonraki sürümlerde embriyolar için, ciltler ve yağ dokusunu kafadan atmak ve fiksasyon öncesinde buz soğuk PBS 'de birkaç kez durulamak için çıkarın.
   4. Baş kriyokoruma.
      1. Her kafasını, plastik transfer pipet veya forseps kullanarak PBS 'de 2 mL% 30 sukroz içeren yeni 12-kuyu plakasına aktarın. Baş çanak altına batana kadar 4 °C ' de yavaşça karıştırın.
   5. Gömecek kafaları.
      1. Kriyokorumalı kafası optimum kesme sıcaklığı (OCT) bileşiği içeren bir kalıp içine aktarın. Birkaç dakika için OCT örnekleri equilibrate. Numunelerin konumunu ve yönünü forseps ile ayarlayın.
      2. Dondurmak için Kuru buz üzerine kalıp yerleştirin. Elde edilen cryomolds-80 °C ' de plastik bir torbada, kriyobölümleme için hazır olana kadar saklayın.
         Not: Kırpılmış yan örneklerinin gömme kalıp alt yüz gerekir.
2. Postnatal undecalcified sert dokularının hazırlanması
   1. 3 hafta veya 3 ay eski fare CO₂ile euthanize. Cilt ve yağ dokularının çıkarın. Farenin kafasını veya uzun kemikleri kesip ayırın.
   2. Fix ve kroprotect adımları 1.1.3 – 1.1.4 açıklandığı gibi fareler kafa veya uzun kemik korumak.
   3. Embed 8% jelatin adım 1.1.5 gibi benzer bir şekilde. Cryosectioning kadar-80 °C ' de plastik bir torba içinde cryomolds tutun.
      Not: Burada çürütme gerekli değildir. Hazırlamak için 8% jelatin, mix 8 g jelatin ile 100 mL PBS ve kaynatma bir mikrodalga kullanarak. Karışım kolayca üzerinde kaynar unutmayın.

2. kriyobölümleme

1. Ekim veya-25 °c ' de gömülü yumuşak dokularda ve jelatin içine yerleştirilmiş undecalcified sert dokular için daha düşük-18 °c ' de kriyostat sıcaklığını ayarlayın. Kriyostat sıcaklığına doğrultma yaklaşık 30 dakika için crostat odasında örnekleri tutun.
2. Bloğun içinden uzaklaştırın. Bloğu, EKIM damlası ile montaj yoluyla numune aynası (doku tutucu) üzerine dondurun. Numunenin kesilmiş tarafını Chuck 'dan uzak tutun (operatöre bakacak şekilde).
3. Blok monte edilmiş aynası kriyostat nesne tutucusuna yükleyin. Blade tutucuyu, numune ile göreli olarak blade 3 ° – 5 ° açısını yapmak için ayarlayın.
4. Kaplanmış mikroskop slaytları üzerine 10 μm bölüm toplayın. RT 'de tamamen Kuru Bölümler, ardından-80 °C ' de saklayın.

3. histolojik boyama ve mikroskobik görüntüleme

1. İmmünofluorescence boyama
   1. -80 °C arası slaytlar çıkarın. 1 saat boyunca RT 'de slaytları hava kuru bölümlere tutun. Durulama Slaytlar 0,1% PBST (0,1% Polietilen glikol tert-oktylphenyl eter PBS içinde; bkz. malzeme tablosu) üç kez 5 dakıka her Ekim yıkamak ve bölümlere geçirgen.
   2. İsteğe bağlı olarak, Antigen alma (isteğe bağlı) gerçekleştirin.
      1. Preheat sitrat tamponu (10 mM sodyum sitrat pH 6), buharlama veya su banyosu ile 95 – 100 °C arası boyama çanak. Sitrat tamponunun içine daldırın slaytlar, 10 dakika boyunca inküye.
      2. Buharlı ya da su banyosundan RT 'ye kadar boyama tabağı alın. RT 'de 20 dakika veya daha uzun¹⁵' e kadar slaytlar serin.
         Not: Alternatifler olarak, ısı kaynaklı antijen alımı için Tris-EDTA tampon (10 mM Tris tabanı, 1mM EDTA, 0,05% Tween 20, pH 9,0) veya EDTA tampon (1 mM EDTA,% 0,05 Ara 20, pH 8,0) kullanın. Sıcak vapur ek olarak, ısı kaynaklı antijen alımı için bir basınçlı Ocak, mikrodalga veya su banyosu kullanın. Tripsin veya pepsin kullanarak enzim kaynaklı antijen alımı başka bir alternatiftir. Zararlı bölümleri önlemek için enzimatik alımı konsantrasyon ve tedavi süresini optimize edin. Her antikor/antijen kombinasyonu için antijen alma yöntemini en iyi duruma getirin.
   3. Her bir slaytı 200 μL engelleme çözeltisi (0,1% PBST 'de% 5 eşek serumu) ile 30 dakika boyunca RT 'de ereğin, ardından engelleme çözümünü durulama olmadan çıkarın.
   4. Her bir slaydı, 4 °C ' de RT veya O/N 'de 1 h için engelleme çözeltisinde seyreltilmiş primer antikor veya antikorlar 100 μL ile kulbe etme. RT 'de her biri 10 dakika boyunca PBS ile slaytları üç kez durulayın.
   5. Her bir slaytı, RT 'de 1 h için engelleme çözümünde seyreltilmiş ikincil antikor 100 μL ile inküt. PBS 'deki slaytları RT 'de 10 dakika boyunca üç kez durulayın. slaytları ışıkta koruyun.
   6. Slaytlar monte edin.
      1. Slayt üzerinde DAPI (4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) ile Anti-Fade orta iki damla ekleyin. Sonra bir coverslip ile kapak.
      2. Görüntü için hazır olana kadar karanlıkta 4 °C ' de saklayın.
         Not: Alternatif olarak, DAPı veya Hoechst 33324 boya seyreltilmiş 1:2000 RT ilk olarak PBS ile çekirdekleri etiket, sonra gliserol ile monte.
2. Terminal deoksinükleotidil transferaz dUTP Nick End etiketleme (Tunel) boyama.
   Not: Üç '-hidroksil Termini ile çift telli DNA (3 ' OH DNA Termini) hücrede apoptozis sırasında oluşturacaktır. Burada, biz özel bir ticari kiti kullanarak belirli boyama tarafından digoxigenin-nükleotidyl transferaz (TdT) kullanan dızinükenozit ile etiketleme DNA parçaları üzerinden ücretsiz 3 ' OH DNA Termini situ etiket bir protokol sağlamak ( malzeme tablosuna bakın ).
   1. İsteğe bağlı olarak, birincil ve Alexa Fluor-488 ile leke bölümleri TUNEL boyama öncesinde ikincil antikorlar etiketli. Her biri 10 dakika boyunca PBS 'deki slaytları üç kez durulayın.
      Not: Bu adım, aynı slaytta bir protein ve TUNEL çift boyama için isteğe bağlıdır.
   2. RT 'de 5 dakika süreyle 100 μL proteinaz K (10 μg/mL on mM Tris pH 7,5 ve 5 mM EDTA) ile her bir slaytı inkulat
      Not: Her doku tipi için Proteinase K inkübasyon süresini ve sıcaklığını ayarlayın. % 4 PFA 'da sabit olan 10 μm embriyo kafaları için RT 'de 5 dakika boyunca inküye yapın. Proteinaz K kullanarak yönteme ek olarak, gerektiğinde alternatif tedaviler kullanın, dahil olmak üzere (1) taze hazırlanmış 0,1% Polietilen glikol tert-oktylphenyl eter, 0,1% sodyum sitrat, 37 °C ' de 10 dk; (2)% 0.25 – 0.5% HCl 'de pepsin (pH 2) veya 0,25% tripsin, 37 °C ' de 10 dk; ve (3) 0,1 M sitrat tampon (pH 6) ile mikrodalga ışınlama.
   3. Her slayda 200 μL engelleme çözeltisi (% 0,1% PBST 'de seyreltilmiş% 5 eşek serumu) uygulayın, 30 dakika boyunca RT 'de inküye yapın, engelleme çözümünü durulama olmadan kapatın.
   4. En az 10 s için RT 'deki her slayda Kit tarafından sağlanan dengelemesinden arabelleğinin 50 μL 'yi uygulayın. durulama olmadan tampona dokunun.
   5. 3:7 oranı ile kit tarafından sağlanan reaksiyon tampon ile TdT enzim karıştırarak reaksiyon karışımı (çalışma mukavemeti TdT enzim) hazırlayın. Her slayt için reaksiyon karışımından 50 μL uygulayın ve 1 saat için 37 °C ' de inküye yapın. durulama olmadan tampona dokunun.
   6. Her slayda Kit tarafından sağlanan stop tamponunun (1:30 ddH₂O 'da seyreltilmiş) 200 μL 'yi uygulayın, ardından 10 dakıka boyunca RT 'de inküye yapın. her biri 10 dakika boyunca PBS ile kaydırmaları üç kez durulayın.
   7. Rhodamine antikor ile etiket.
      1. Her slayda 50 μL ön ısıtılmış (RT) Anti-digoxigenin Konjugat (Rhodamine) (1:1 engelleme çözeltisinde seyreltilmiş) uygulayın. RT 'de 30 dakika karanlıkta inküye yapın.
      2. Her biri 10 dk için üç kez PBS ile slaytlar durulayın. Slaytlar adım 3.1.6 olarak monte edin.

4. görüntüleme edinme

1. Floresan altında görüntülerin arka planını değerlendirmek için sinyal etiketleme ve negatif kontroller (birincil antikor, izotip kontrolü veya doku hedef antijen negatif) atlamak kontrol etmek için pozitif kontroller (doku hedef antijen için pozitif) kullanın Mikroskop.
2. Negatif ve pozitif kontrollerin sinyal yoğunluğuna göre görüntüleme için ekipman ve kamera koşullarını (pozlama ve diğer genel ayarlar) ayarlayın.
   Not: Bu koşullar, her deney için (1) görüntü, (2) antikorlar ve (3) dokularda kullanılan kamera ve mikroskoplara göre farklılık gösterir. Kraniyofasiyal dokular için kullanılan ortak koşullar, 1/100 s 'den 1 s 'ye kadar olan bir pozlama süresi ile ISO 200, antikorların kalite ve özgüllüğü bağlıdır. Uygun büyütme örnekleri ve deneylerin amacı boyutuna bağlı olarak değişir.
3. Konvansiyonel epifluorescence mikroskop veya Konfokal mikroskop ile görüntü kazanın. Her renk kanalı için aynı koşullarda (karşılık gelen denetimlere dahil) görüntüler edinin. Görüntüleri aynı formatta kaydedin (Tiff bilgileri korumak için en iyisidir).

5. floresans ölçümü

Not: İstatistiksel olarak farklı gruplar arasındaki lekeme karşılaştırılması birçok durumda daha bilgilendirici olacaktır. İmmünofluorescence görüntülerle, sinyal yoğunluğunu ölçerek, pozitif hücreleri sayma veya pozitif alanları hesaplamak suretiyle proteinin göreceli seviyesini ölçmek. İstatistiksel analizler için en az biyolojik bağımsız numune sayısı 3 ' tür. Tipik bir yöntem, her örnekten en az üç bölüm üretecek ve her bölümdeki en az üç temsilci alanı için görüntü alacaktır.

1. Imagej kullanarak floresans yoğunluğunun ölçülmesini
   1. Yazılımı açın ve yalnızca alan ve Tümleşik yoğunluğun seçildiğini kontrol etmek Için analiz > ayarlama ölçümleri kullanın. Analiz edilecek görüntüleri açmak için dosya > Aç kullanın.
   2. Uzak soldaki kare veya daire simgesini seçmek için araç çubuğu 'nu kullanın. Seçim aracını kullanarak görüntüde analiz edilecek alanı seçin. Seçili alanın okunup ve entegre yoğunluğu sonuçları penceresinde almak için analiz > ölçmek kullanın. Arka planı okumak için floresan olmayan pozitif hücrenin yanında bir bölge seçin.
   3. Diğer görüntüleri çözümlemek için, 5.1.2 adımını yineleyin. İlk görüntü ile eşleşecek şekilde analiz edilecek alanı ayarlandı.
   4. Sonuçlar penceresindeki tüm verileri kopyalayın ve çözümleme tamamlandığında bir elektronik tabloya yapıştırın.
   5. Düzeltilmiş floresan yoğunluğunu (CTCF) entegre yoğunluk olarak hesaplayın — (seçilen hücrenin alanı x arka plan okumalarının ortalama floresans). Numuneler arasında düzeltilmiş toplam hücre floresans farkını karşılaştırın ve bir grafik yapın.
2. Imagej kullanarak floresan görüntülerin pozitif hücre sayısının ölçülmesini
   1. Manuel hücre sayımı.
      1. Hücre Counter Plugin yüklemek Için ımagej > plugins > Analizi kullanın.
      2. Analiz edilecek görüntüleri açmak için dosya > Aç kullanın. Sayaç penceresini ve sonuçlar penceresini açmak için eklentiler > Çözümleme > hücre sayacı kullanın.
         Not: Hücre sayacı yığınları üzerinde çalışmaz. Yığınları sayma için, eklenti Plot z eksen profili, sonra bir parçacık izleme aracı kullanarak hareketlı bir YG yoğunluğu Izlemek için görüntü ≫ yığınları > Arsa Z eksen profili kullanın. Bu araç ya manuel veya otomatik olabilir.
      3. Sayım başlatmak için sayaç penceresinin altındaki düğmelerden birini tıklatarak. Bitirme kadar saymak için doğrudan bir hücre/nesne üzerinde tıklatın.
      4. Count penceresinde sonuçlar düğmesini tıklatın. Sayılan hücrelerin toplam sayısı sonuçlar penceresinde gösterilecektir. Sonuç günlüğünü elektronik tablo olarak kaydedin ve analiz edin.
   2. Otomatik hücre sayımı.
      1. Analiz edilecek görüntüleri açmak için dosya > Aç kullanın. Devam etmeden önce RGB görüntüsünü gri ölçekli bir görüntüye dönüştürün.
      2. Sayılması gereken tüm alanları seçmek için ımage > Adjust > Threshold öğesini kullanın.
      3. Hücre/parçacık sayısını almak için analiz ≫ parçacıkları çözümleme kullanın. Belirli bir aralıktaki hücreleri/parçacıkları saymak için varsayılan 0-sonsuzluk yerine geçerli parçacık boyutunun (örn. 100-Infinity) aralığını ayarlayın. Sonuç günlüğünü elektronik tablo olarak kaydedin ve analiz edin.
         Not: görüntüden diğer bilgileri almak için, alanın yanı sıra, analiz et > ölçümleri ayarlayın ve gerekli bilgilerin yanındaki kutuyu seçin.

Sonuçlar

Embriyonik kraniyofasiyal doku bölümleri
Yukarıdaki adımları takiben, kafaları kontrol (P0-CRE) veya Mutant (seçimli aktif Bmpr1a nöral Crest hücrelerinde, P0-CRE; caBmpr1a) embriyonik günde (E) 16,5 veya 18,5 embriyolar disseke edildi. 4 h için 4% PFA sabitleme sonra, numuneler OCT gömülü ve Cor, cryosec,. Sonuçlanan bölümler pSmad1/5/9 (alt BMP sinyal faktörleri) veya Ki67 (bir hücre proliferasyonu işaretçisi) karşı antikorlar...

Tartışmalar

Burada fare kafası ve undecalcified kemik dokularının hazırlanması için ayrıntılı bir protokol ve hücre proliferasyonu, hücre ölümü ve BMP sinyalizasyon işaretçileri immünostasyon için donuk kesit sağlar. Ayrıca immünofluorescent görüntülerden nicel veriler elde etme stratejisini de ayrıntılarıyla biliyoruz. Bu yöntemler, uygun değişikliklerle diğer dokulara da uygulanabilir.

Doku hazırlama koşulları dokuların boyutuna ve tipine göre farklılık gösterir. S...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape	Leica	#39475214
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody	Invitrogen	A-11034
Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen	P36931
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
Coverslips	Fisher Brand	12-545-E
Cryostat	Leica	CM1850
EDTA	Sigma	E6758
Fluorescence microscope	Olympus	BX51
Gelatin	Sigma	G1890
In Situ Cell Death Detection Kit	Millipore	S7165
Microscope slides	Fisher Brand	12-550-15
OCT Compound	Fisher Healthcare	23-730-571
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Sigma	T9284	Triton X-100
Proteinase K	Invitrogen	AM2542
Rabbit anti-Ki67 antibody	Cell Signaling Technology	9129	Lot#:3; RRID:AB_2687446
Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody	Cell Signaling Technology	13820	Lot#:3; RRID:AB_2493181
Sodium citrate	Sigma	1613859
Sucrose	Sigma	S9378
Tris	Sigma	10708976001