Preparazione dei tessuti e immunostaining dei tessuti craniofacciali del topo e dell'osso non decalcolato

Riepilogo

Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per rilevare e quantificare i livelli di proteine durante la morfogenesi/patogenesi craniofacciale immunostaining usando come esempi i tessuti craniofacciali dei topi. Inoltre, descriviamo un metodo per la preparazione e la criosezione dei tessuti duri non decalcolati dai giovani topi per l'immunostaining.

Abstract

L'immunostaining dei tessuti fornisce un rilevamento altamente specifico e affidabile delle proteine di interesse all'interno di un determinato tessuto. Qui descriviamo un protocollo completo e semplice per rilevare l'espressione proteica durante la morfogenesi/patogenesi craniofacciale usando come esempi i tessuti craniofacciali dei topi. Il protocollo consiste nella preparazione e criosezione dei tessuti, nell'immunofluorescenza indiretta, nell'acquisizione di immagini e nella quantificazione. Inoltre, viene descritto un metodo per la preparazione e la criosezione dei tessuti duri non decalcolati per l'immunostaining, usando come esempi tessuti craniofacciali e ossa lunghe. Questi metodi sono fondamentali per determinare l'espressione proteica e i cambiamenti morfologici/anatomici in vari tessuti durante la morfogenesi craniofacciale/patogenesi. Sono applicabili anche ad altri tessuti con modifiche appropriate. La conoscenza dell'istologia e dell'alta qualità delle sezioni è fondamentale per trarre conclusioni scientifiche da risultati sperimentali. Le potenziali limitazioni di questa metodologia includono, ma non si limitano alla specificità degli anticorpi e alle difficoltà di quantificazione, che sono discusse anche qui.

Introduzione

Il viso è una parte fondamentale dell'identità umana ed è composto da diversi tipi di tessuti, come epitelio, muscoli, ossa, cartilagine, denti. Tali tessuti derivano da tutti e tre gli strati germinali: ectoderma, endoderma e mesoderma^1,2. Per un corretto modello e lo sviluppo di tessuti craniofacciali, la proliferazione cellulare, la morte e la differenziazione devono essere altamente coordinati e regolati da percorsi di segnalazione specifici, come wnt, Fgf, Hh e Bmp percorsi^{3,4 ,5}. Difetti nella proliferazione, nella sopravvivenza o nella differenziazione delle cellule porteranno a malformazioni craniofacciali, che sono tra i difetti congeniti di nascita congeniti più frequenti. I topi transgenici sono strumenti utili per studiare i meccanismi della morfogenesi craniofacciale e della patogenesi^1,2,3,4,5. Comprendere i cambiamenti nelle strutture craniofacciali durante lo sviluppo e la patogenesi aiuterà a chiarire i principi chiave dello sviluppo e i meccanismi delle malformazioni craniofacciali^{1,2,3 ,4,5}.

La colorazione di tessuti interi montati o sezionato con anticorpi specifici è una tecnica inestimabile per determinare la distribuzione spaziale delle proteine di interesse ⁶. Formalmente, l'immunostaining tissutale può basarsi sull'immunosofia (IHC) o sull'immunofluorescenza (IF). Rispetto al prodotto di reazione opaco generato con un substrato cromogenico come 3,3'-Diaminobenzidina (DAB) dall'IHC, IF comporta l'uso di coniugati fluorescenti visibili dalla microscopia a fluorescenza. Pertanto, IF può distinguere chiaramente le cellule positive dal rumore di fondo e consente alle immagini di essere analizzate quantitativamente e migliorate in modo semplice da software come ImageJ e Adobe Photoshop^7,8. L'intero approccio di colorazione del supporto funziona su piccoli blocchi di tessuto (meno di 5 mm di spessore), che possono fornire informazioni tridimensionali sulla posizione di proteine / antigeni senza la necessità di ricostruzione dalle sezioni^9,10 . Tuttavia, rispetto alle sezioni tissutali, l'immunostaining di montaggio completo richiede molto tempo e richiede grandi volumi di soluzioni anticorpali. Non tutti gli anticorpi sono compatibili con l'approccio di base di montaggio completo. Inoltre, la penetrazione incompleta degli anticorpi comporterà macchie irregolari o macchie false negative. Qui ci concentreremo sul rilevamento dell'immunofluorescenza di proteine/antigeni sui tessuti sezionato. Per i tessuti duri (ad esempio, testa, dente, osso lungo), la deposizione di calcio durante lo sviluppo/patogenesi rende il campione difficile da sezionere e facilmente sciacquato durante il trattamento immunostaining^11,12. La maggior parte dei protocolli attualmente disponibili decalcificano i tessuti duri prima dell'incorporamento per rendere più facile la sezionamento, che richiede molto tempo e può distruggere morfologia e antigeni di campioni se gestiti in modo improprio^11,12. Per superare i problemi, abbiamo ottimizzato un approccio per la criosezione dei tessuti duri senza decalcificazione, portando a una migliore visualizzazione della loro morfologia e distribuzione delle proteine di segnalazione.

Il protocollo qui descritto viene utilizzato per determinare i cambiamenti morfometrici e istologici nei tessuti craniofacciali dei topi transgenici BMP. In particolare, il protocollo comprende (1) la raccolta e la dissezione dei tessuti della testa, (2) la sezione e l'immunostaining dei marcatori sperimentali (Ki67, pSmad1/5/9) insieme alla colorazione TUNEL, (3) l'imaging delle sezioni utilizzando il microscopio a fluorescenza e infine (4) l'analisi e la quantificazione dei risultati. Il protocollo per preparare e criosezione tessuti duri senza decalcificazione è anche descritto¹³. Questi metodi sono ottimizzati per i tessuti craniofacciali. Sono applicabili anche ad altri tessuti di varie età di campioni con modifiche appropriate.

Protocollo

Tutti gli esperimenti sui topi sono stati condotti in conformità con le linee guida dell'Università del Michigan che riguardano la cura umana e l'uso degli animali nella ricerca. Tutte le procedure sugli animali utilizzate in questo studio sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università del Michigan (Protocollo #PRO00007715).

1. Preparazione dei tessuti

1. Preparazione dei tessuti embrionali
   1. Preparare un piatto di 10 cm e diversi piatti di 3,5 cm contenenti fosfato tampinato salina (PBS) e una piastra di coltura a 12 pozze contenente 2 mL 4% paraformaldeide (PFA) in PBS in ogni pozzo per ogni topo incinta. Mettere tutti i piatti Petri e il piatto sul ghiaccio.
      NOT: Gestire il 4% di PFA in una cappa di fumi.
   2. Embrioni dissetati da topi in gravidanza in PBS ghiacciati con pinze e forbici, come descritto in precedenza¹⁴.
      1. In breve, eutanasia un topo incinta con CO₂, afferrare la pelle sotto il centro della pancia con pinze e tagliare solo la pelle, quindi tirare delicatamente la pelle per separarla dal sottostante la parete muscolare addominale.
      2. Successivamente, tagliare nella cavità addominale seguendo la stessa linea dell'incisione della pelle. Rimuovere l'utero contenente una serie di embrioni e rimuovere gli embrioni tagliando delicatamente la parete uterina. I tessuti extraembryonici come il sacco del tuorlo e l'amnione saranno rimossi.
      3. Tagliare e isolare la testa da ogni embrione.
   3. Trasferire ogni testa in ogni pozzetto di una piastra da 12 pozzetti contenente il 4% di PFA con una pipetta di trasferimento di plastica o pinze. Fissare i campioni in 4% di PFA a 4 gradi centigradi per 4 h. Risciacquare i campioni in PBS a 4 gradi centigradi con agitazione delicata per 12 h.
      NOT: Per gli embrioni più giovani del giorno embrionale 16.5 (E16.5), fissare le teste degli embrioni con il 4% di PFA direttamente dopo l'isolamento. Per gli embrioni a E16.5 o versioni successive, rimuovere per scartare la pelle e il tessuto adiposo dalle teste e risciacquare più volte nella PBS ghiacciata prima della fissazione.
   4. Crioproteggere le teste.
      1. Trasferire ogni testa in una nuova piastra da 12 pozzetti contenente 2 mL del 30% di saccarosio in PBS utilizzando una pipetta di trasferimento di plastica o pinze. Agitare delicatamente a 4 gradi centigradi fino a quando la testa affonda sul fondo del piatto.
   5. Incorpora teste.
      1. Trasferire la testa crioprotetta in uno stampo contenente composto Optimal Cutting Temperature (OCT). Campioni di Equilibrate in OCT per diversi minuti. Regolare la posizione e la direzione dei campioni con le pinze.
      2. Posizionare lo stampo sul ghiaccio secco per congelare. Conservare i criopoli risultanti in un sacchetto di plastica a -80 gradi fino a quando non è pronto per la criosezione.
         NOT: Il lato tagliato dei campioni deve affrontare il fondo dello stampo di incorporamento.
2. Preparazione di tessuti duri postnatali non decalcolivi
   1. Eutanasia a 3 settimane o 3 mesi vecchio mouse con CO₂. Rimuovere la pelle e i tessuti adipose. Tagliare e isolare la testa o le ossa lunghe dal mouse.
   2. Fissare e crioproteggere la testa o l'osso lungo dei topi come descritto nei passaggi 1.1.3–1.1.4.
   3. Incorporare in 8% gelatina in modo simile al passo 1.1.5. Tenere i criomuffsi in un sacchetto di plastica a -80 gradi fino a criosezione.
      NOT: La decalcificazione non è necessaria in questo caso. Per preparare l'8% di gelatina, mescolare 8 g di gelatina con 100 mL di PBS e far bollire con un forno a microonde. Essere consapevoli del fatto che la miscela bolle facilmente.

2. Criosezione

1. Impostare la temperatura criostata a -18 gradi centigradi per i tessuti molli incorporati nello Strumento di personalizzazione di Office o a -25 gradi centigradi e inferiore per i tessuti duri non decalcolati incorporati nella gelatina. Conservare i campioni nella camera criostat per circa 30 min per equilibrate alla temperatura del criostato.
2. Espellete il blocco dal criomuffone. Congelare il blocco sul mandrino del campione (portatessuto) tramite montaggio con una goccia di OCT. Mantenere il lato tagliato del campione più lontano dal mandrino (di fronte all'operatore).
3. Caricare il mandrino montato a blocchi sul supporto dell'oggetto criostato. Regolare il supporto della lama in modo da rendere l'angolo della lama di 3-5 gradi rispetto al campione.
4. Raccogliere 10 sezioni di m su vetrini rivestiti al microscopio. Asciugare completamente le sezioni a RT, quindi conservarle a -80 gradi centigradi.

3. Colorazione istologica e imaging microscopico

1. Colorazione immunofluorescenza
   1. Estrarre gli scivoli da -80 gradi centigradi. Conservare i vetrini a RT per 1 h a sezioni airdry. Risciacquare i vetrini in 0,1% PBST (0,1% Polyethylene glicol tert-octylphenyl ether in PBS; vedere Tabella dei materiali) tre volte per 5 min ciascuno per lavare le sezioni OCT e permeabilizzanza.
   2. Facoltativamente, eseguire il recupero dell'antigene (facoltativo).
      1. Preriscaldare il cuscinetto di citrato (10 mM di citrato di sodio pH 6) nella teglia di colorazione con piroscafo o bagno d'acqua a 95-100 gradi centigradi. Immergere i vetrini nel tampone del citrato, incubare per 10 min.
      2. Prendere il piatto di colorazione fuori dal vapore o bagno d'acqua a RT. Raffreddare gli scivoli a RT per 20 min o più¹⁵.
         NOT: In alternativa, utilizzare il buffer Tris-EDTA (10 mM Tris base, 1mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 9.0) o buffer EDTA (1 mM EDTA, 0.05% Tween 20, pH 8.0) per il recupero dell'antigene indotto dal calore. Utilizzare una pentola a pressione, un forno a microonde o un bagno d'acqua per il recupero dell'antigene indotto dal calore, oltre al piroscafo caldo. Un recupero di antigene indotto da enzimi utilizzando la trypsina o pepsina è un'altra alternativa. Ottimizzare il tempo di concentrazione e trattamento del recupero ezimatico per evitare di danneggiare le sezioni. Ottimizzare il metodo di recupero dell'antigene per ogni combinazione anticorpo/antigene.
   3. Incubare ogni vetrino con 200 gradi di soluzione di blocco (5% di siero d'asino diluito in 0,1% PBST) a RT per 30 min, quindi rimuovere la soluzione di blocco senza risciacquare.
   4. Incubare ogni vetrino con 100 l un anticorpo primario o anticorpi diluiti in soluzione di blocco per 1 h a RT o O/N a 4 gradi centigradi. Sciacquare i vetrini con PBS tre volte per 10 min ciascuno a RT.
   5. Incubare ogni vetrina con 100 lantide secondarie diluito in soluzione di blocco per 1 h a RT. Rinse vetrini in PBS tre volte per 10 min ciascuno a RT. Proteggere i vetrini dalla luce.
   6. Montare scivoli.
      1. Aggiungere due gocce di mezzo anti-dissolvenza con DAPI (4', 6-diamidino-2-fenylindole) sul vetrino. Poi copriconci con una copertina.
      2. Conservare a 4 gradi centigradi al buio fino a quando non si è pronti per l'immagine.
         NOT: In alternativa, etichettare i nuclei con DAPI o Hoechst 33324 tallone diluito 1:2,000 in PBS prima a RT prima, quindi montare con glicerolo.
2. Terminal deoxynucleotidyl transferasye dUTP nick end labeling (TUNEL) colorazione.
   NOT: Il DNA a doppio filamento con 3'-idrossile termini (3'OH DNA termini) si formerà durante l'apoptosi nella cellula. Qui, forniamo un protocollo che etichetta il termine di DNA 3'OH gratuito in situ attraverso l'etichettatura dei frammenti di DNA con la digossigenina-nucleotide utilizzando il deoxynucleotidyl transferase terminale (TdT) con una colorazione specifica utilizzando un kit commerciale (vedi Tabella dei materiali ).
   1. Facoltativamente, colorare le sezioni con gli anticorpi secondari primari e Alexa Fluor-488 prima della colorazione TUNEL. Sciacquare le diapositive in PBS tre volte per 10 min ciascuno.
      NOT: Questo passaggio è facoltativo per una doppia colorazione di una proteina e TUNEL nello stesso vetrino.
   2. Incubare ogni vetrina con 100 s Proteinase K (10 g/mL in 10 mM Tris pH 7,5 e 5 mM EDTA) per 5 min a RT. Vescino con PBS tre volte per 10 min ciascuno a RT.
      NOT: Regolare il tempo di incubazione e la temperatura di Proteinase K per ogni tipo di tessuto. Per 10 sezioni di teste di embrioni fissate nel 4% di PFA, incubare per 5 min a RT. Oltre al metodo di utilizzo di Proteinase K, utilizzare trattamenti alternativi in base alle esigenze, tra cui (1) appena preparato 0,1% Polyethylene glicol tert-octilphenyl ether, 0.1% citrato di sodio, 10 min a 37 gradi centigradi; (2) 0,25%–0,5% Pepsina in HCl (pH 2) o 0,25% trypsin, 10 min a 37 gradi centigradi; e (3) irradiazione a microonde con tampone di citrato da 0,1 m (pH 6).
   3. Applicare 200 ll di soluzione di blocco (5% di siero d'asino diluito in 0.1% PBST) per ogni vetrino, incubare a RT per 30 min, toccare la soluzione di blocco senza risciacquo.
   4. Applicare 50 l del buffer di equilibration fornito dal kit ad ogni vetrino a RT per almeno 10 s. Toccare il buffer senza risciacquare.
   5. Preparare la miscela di reazione (enzima TdT di forza di lavoro) mescolando l'enzima TdT con il buffer di reazione fornito dal kit al rapporto di 3:7. Applicare 50 l della miscela di reazione ad ogni vetrino, quindi incubare a 37 gradi centigradi per 1 h. Salvo il buffer senza risciacquare.
   6. Applicare 200 l del buffer di stop (1:30 diluito in ddH₂O) fornito dal kit per ogni vetrino, quindi incubare a RT per 10 min.
   7. Etichetta con anticorpo di Rhodamine.
      1. Applicare 50 l di coniugato anti-digossigenina preriscaldato (RT) per ogni vetrino. Incubare a RT per 30 min al buio.
      2. Sciacquare i vetrini con PBS tre volte per 10 min ciascuno. Montare le diapositive come passaggio 3.1.6.

4. Acquisizione di imaging

1. Utilizzare controlli positivi (tessuti positivi per l'antigene bersaglio) per controllare l'etichettatura del segnale e i controlli negativi (omettere l'anticorpo primario, il controllo isotipo o i tessuti negativi per l'antigene bersaglio) per valutare lo sfondo delle immagini sotto il fluorescente microscopio.
2. Impostare l'apparecchiatura e le condizioni della fotocamera (esposizioni e altre impostazioni generali) per l'imaging in base all'intensità del segnale dei controlli negativi e positivi.
   NOT: Queste condizioni variano a seconda di (1) telecamere e microscopi utilizzati per l'imaging, (2) anticorpi e (3) tessuti per ogni esperimento. Le condizioni comuni utilizzate per i tessuti craniofacciali sono ISO 200 con un tempo di esposizione compreso tra 1/100 e 1 s e la qualità degli anticorpi. Ingrandimenti appropriati variano a seconda delle dimensioni dei campioni e dello scopo degli esperimenti.
3. Acquisire immagini con microscopio a epifluorescenza convenzionale o microscopio confocale. Acquisire immagini (incluse quelle dei controlli corrispondenti) nelle stesse condizioni per ogni canale di colore. Salvare le immagini con lo stesso formato (tiff è meglio conservare le informazioni).

5. Quantificazione della fluorescenza

NOT: Statisticamente confrontando la colorazione tra i diversi gruppi sarà più informativo in molti casi. Con le immagini dell'immunofluorescenza, quantifica il livello relativo della proteina misurando la densità del segnale, contando le cellule positive o calcolando le aree positive. Per l'analisi statistica, il numero minimo di campioni biologicamente indipendenti è 3. Un metodo tipico consiste nel generare almeno tre sezioni da ogni campione e scattare immagini per almeno tre aree rappresentative in ogni sezione.

1. Quantificazione dell'intensità della fluorescenza mediante ImageJ
   1. Aprire il software e utilizzare Analizza > Imposta misurazioni per verificare che siano selezionate solo l'area e la densità integrata. Utilizzare File > Apri per aprire le immagini da analizzare.
   2. Utilizzare Barra degli strumenti per selezionare l'icona del quadrato o del cerchio all'estrema sinistra. Selezionare l'area da analizzare sull'immagine utilizzando lo strumento di selezione. Utilizzare Analizza > Misura per ottenere la lettura dell'area selezionata e la densità integrata nella finestra Risultati. Selezionare un'area accanto a una cella positiva che non ha fluorescenza per leggere lo sfondo.
   3. Ripetere il passaggio 5.1.2 per analizzare altre immagini. Regolata l'area da analizzare in modo che corrisponda a quella della prima immagine.
   4. Copiare tutti i dati nella finestra Risultati e incollarli in un foglio di calcolo al termine dell'analisi.
   5. Calcolare l'intensità di fluorescenza corretta (CTCF) come Densità integrata (Area della cella selezionata x Fluorescenza media delle letture di sfondo). Confrontare la differenza della fluorescenza totale delle cellule corretta tra i campioni e creare un grafico.
2. Quantificazione del numero di cellule positive delle immagini fluorescenti utilizzando ImageJ
   1. Conteggio manuale delle celle.
      1. Usa ImageJ > Plugin > Analisi per installare il plugin Cell Counter.
      2. Utilizzare File > Apri per aprire le immagini da analizzare. Usa plugin > Analisi > Contatore celle per aprire la finestra Contatore e la finestra Risultati.
         NOT: Il contatore delle celle non funziona sugli stack. Per il conteggio delle pile, plugin Stampa - Profilo asse, quindi utilizzare Immagine > Stack > Traccia - Profilo asse per monitorare l'intensità di un ROI in movimento utilizzando uno strumento di tracciamento delle particelle. Questo strumento può essere manuale o automatico.
      3. Facendo clic su uno dei pulsanti nella parte inferiore della finestra Contatore per avviare il conteggio. Fare clic direttamente su una cella / oggetto da contare fino al termine.
      4. Fare clic sul pulsante Risultati nella finestra Conteggio. Il numero totale di celle conteggiate verrà visualizzato nella finestra Risultati. Salvare il registro dei risultati come foglio di calcolo e analizzarlo.
   2. Conteggio automatico delle celle.
      1. Utilizzare File > Apri per aprire le immagini da analizzare. Convertire l'immagine RGB in un'immagine in scala di grigi prima di procedere.
      2. Usa Immagine > Regola > Soglia per selezionare tutte le aree da contare.
      3. Usa Analizza > Analizza particelle per ottenere il numero di celle/particelle. Impostare un intervallo delle dimensioni valide delle particelle (ad esempio, 100-Infinity) anziché il valore predefinito 0-Infinity per contare le celle/particelle all'interno di un intervallo specifico. Salvare il registro dei risultati come foglio di calcolo e analizzarlo.
         NOTA: per ottenere altre informazioni dall'immagine, oltre all'area, andare su Analizza > Imposta misurazioni e selezionare la casella accanto alle informazioni necessarie.

Risultati

Sezioni di tessuto craniofacciale embrionale
Seguendo i passi precedenti, le teste sono state sezionate dal controllo (P0-Cre) o mutanti (Bmpr1a attivata in modo conto interno negli embrioni della cresta neurale, P0-Cre; caBmpr1a) embrionali al giorno embrionale (E) 16.5 o 18.5. Dopo il fissaggio nel 4% Di PFA per 4 h, i campioni sono stati incorporati nello Strumento di personalizzazione di Office e criosezione coronalmente. Le sezioni risultanti son...

Discussione

Qui forniamo un protocollo dettagliato per la preparazione della testa del topo e dei tessuti ossei non decalcoldatificati, e la criosezione per l'immunostaining della proliferazione cellulare, della morte cellulare e dei marcatori di segnalazione BMP. Inoltre, indettagliamo la strategia per ottenere dati quantitativi dalle immagini immunofluorescenti. Tali metodi possono essere applicabili anche ad altri tessuti con modifiche appropriate.

Le condizioni per la preparazione dei tessuti variano ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesive tape	Leica	#39475214
Alexa fluor 488-goat anti-Rabbit secondary antibody	Invitrogen	A-11034
Antifade Mountant with DAPI	Invitrogen	P36931
Bovine serum albumin	Sigma	A2153
Coverslips	Fisher Brand	12-545-E
Cryostat	Leica	CM1850
EDTA	Sigma	E6758
Fluorescence microscope	Olympus	BX51
Gelatin	Sigma	G1890
In Situ Cell Death Detection Kit	Millipore	S7165
Microscope slides	Fisher Brand	12-550-15
OCT Compound	Fisher Healthcare	23-730-571
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma	P6148
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether	Sigma	T9284	Triton X-100
Proteinase K	Invitrogen	AM2542
Rabbit anti-Ki67 antibody	Cell Signaling Technology	9129	Lot#:3; RRID:AB_2687446
Rabbit anti-pSmad1/5/9 antibody	Cell Signaling Technology	13820	Lot#:3; RRID:AB_2493181
Sodium citrate	Sigma	1613859
Sucrose	Sigma	S9378
Tris	Sigma	10708976001