ゼブラフィッシュモデルの筋肉再生を調べる

要約

骨格筋再生は、筋ジストロフィーなどの多くの筋疾患で障害を受ける組織常駐筋幹細胞によって駆動され、筋肉が再生できないことが生じる。ここでは、筋疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋再生の検討を可能にするプロトコルについて述べる。

要約

骨格筋は、組織常駐筋幹細胞によって駆動される傷害後に再生する顕著な能力を有する。傷害後、筋肉幹細胞は活性化され、細胞増殖を受けて筋芽細胞のプールを生成し、その後分化して新しい筋線維を形成する。筋ジストロフィーや老化を含む多くの筋肉の消耗条件では、このプロセスは、再生する筋肉の障害をもたらす損なわれます。ゼブラフィッシュの筋肉再生のプロセスは、筋ジストロフィーなどの筋肉消耗状態で、筋幹細胞機能および再生を研究するための優れたシステムを提供する哺乳類系と高度に保存されています。ここでは、筋疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋再生を検討する方法を紹介する。最初のステップは、損傷を引き起こす前に幼虫の遺伝子型の決定を可能にするジェノタイピングプラットフォームの使用を含む。遺伝子型を決定した後、針刺しを用いて筋肉が傷つい、その後、偏光顕微鏡が筋肉再生の程度を決定するために使用される。したがって、我々は、筋肉疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋肉再生の検査を可能にする高スループットパイプラインを提供する。

概要

骨格筋は人体質量の30~50%を占め、移動に欠かせないだけでなく、重要な代謝・貯蔵器官¹としても機能する。死後であるにもかかわらず、骨格筋は非常に動的であり、傷害後の驚異的な再生能力を保持する。これは、組織常駐幹細胞(衛星細胞とも呼ばれる)の存在に起因し、ミオファイバーの基底層薄層の下に位置し、組み合わされたボックスタンパク質7(pax7)および/またはペアドボックスタンパク質3(pax3)の転写因子によってマークされ、とりわけ^2、3である。傷害後、衛星細胞は活性化され、細胞増殖を受けて筋芽細胞のプールを生成し、その後分化して新しい筋線維を形成する。衛星細胞の活性化および堅牢な筋肉修復を調節する再生前信号の高度に保存されたカスケードは、ミオパチーおよび恒育老化^4、5などの様々な条件で影響を受ける。

このような多様な筋障害のグループの1つは、筋ジストロフィーであり、進行性の筋消耗と変性を特徴とする^6.これらの疾患は、ジストロフィンおよびラミニンα2(LAMA2)を含む主要タンパク質における遺伝子変異の結果であり、細胞外マトリックス^7,8への筋線維の付着を担う。筋ジストロフィーに関与するタンパク質が筋肉構造を維持する上で中心的な役割を果たしていることを考えると、この過程での障害が病態病病の原因となるメカニズムであると長年考えられていた^9。しかし、最近の研究では、筋ジストロフィー^10,11で観察された筋病理の第2の可能な基礎として、筋幹細胞の調節およびそれに続く筋再生の障害を同定した。したがって、筋幹細胞機能の障害および関連するニッチ要素が筋ジストロフィーにどのように寄与するかを調査するために、さらなる研究が必要です。

過去10年間、ゼブラフィッシュ(ダニオ・レリオ)は、疾患モデリング¹²の重要な脊椎動物モデルとして登場しました。これは、ゼブラフィッシュ胚の急速な外部発達に起因し、その光学的明瞭さと相まって、筋肉の形成、成長、および機能を直接視覚化することができる。また、ゼブラフィッシュにおいて高度に保存された筋肉の発達と構造だけでなく、筋肉再生¹³の高度に保存されたプロセスも示している。その結果、ゼブラフィッシュは、筋肉疾患の病理生物学を研究し、筋肉再生がどのように影響を受けるかを探求するための優れたシステムを表しています。そのために、筋疾患のゼブラフィッシュモデルにおける骨格筋再生のタイムリーな研究を可能にする方法を開発しました。この高スループットパイプラインは、生きた胚¹⁴を遺伝子型化する方法を含み、その後、針刺し損傷が行われ、偏光顕微鏡を用いて筋肉再生の程度が画像化される。したがって、この技術の利用は、筋肉疾患のゼブラフィッシュモデルにおける筋肉の再生能力を明らかにする。

プロトコル

ゼブラフィッシュのメンテナンスは、コロニーの飼育ライセンスERM14481の下でモナッシュ大学動物倫理委員会によって承認された標準的な操作手順に従って行われました。

1. 胚遺伝子型プラットフォームを用いた生きた胚の遺伝子型の決定

1. 受精後3日間(dpf)ゼブラフィッシュ胚を、トリケインメタンスルホン酸を胚培地中の0.016%(v/v)の最終濃度(5 mM NaCl、0.17mM KCl、0.33 mM CaCl 2、0.33 mM MgSO₄₎に加えて麻酔を行う。魚が泳ぐのを止めると明らかに、魚が完全に麻酔されていることを確認するために10分待ちます。
2. チップの上面から透明な保護フィルムを剥がして24室DNA抽出チップを用意する(図1A)。
3. 20 μL フィルターチップの先端を切って、開口部を広げます。これを使用して、13 μLの胚培地の1個の胚を選び、チップの第1のチャンバーに負荷を入れます。胚が各チャンバーに分配されるまで、このプロセスを繰り返します。
   注:このステップは、高い空気流が後に胚の遺伝子型形成感度および生存率を低下させる流体の過度の蒸発を引き起こす可能性があるため、空気ドラフトが最小限の領域で行われるべきである。
4. 所望の数の胚がDNA抽出チップにロードされたら、ゼブラフィッシュ胚のジェノタイピングプラットフォームにロードします。これは、最初に片側に配置し、その後に残りの部分を置くことによって最もよく達成されます。
   注: プラットフォームに過度の圧力をかけ過ぎると、基礎となるスプリングが大きく損なわれる可能性があるため、過度の圧力をかけすぎないようにしてください。
5. 磁気プラットフォームの蓋をチップの上に貼り付け、DNA抽出プロトコル中の胚培地の蒸発を防ぎ、プラットフォームの蓋を閉めます。
6. ベースユニットを2.4ボルト、0.051 A、0.12 Wに設定し、「ON/OFF」ボタンを押してDNA抽出プロトコルを開始します。プラットフォームは、蓋を静かに触れることによって評価することができる振動を開始する必要があります。プロトコルは 8 分間実行する必要があります。
   注:激しい振動は、ゲノムDNAが抽出される表皮細胞の脱落をもたらします。
7. プログラムの実行中に、下流のジェノタイピングアッセイが行われている間に個々の胚を分離するために必要な各ウェルに1mLの胚培地を加えることによって24ウェルプレートを準備する。
8. さらに、適切に8ウェルストリップチューブをラベル付けし、各胚からのDNA材料の収集に使用されます。
9. 8分間のプロトコルが完了したら 、ON/OFF ボタンを押してプラットフォームの振動を止めます。
10. プラットフォームの蓋を開け、磁気蓋を静かに取り外し、プラットフォームに最小限の圧力を加えます。
11. 慎重にプラットフォームからDNA抽出チップを取り出し、平らな表面に置きます。
12. 最初のチャンバーから、胚を取り囲む10μLの胚培地を取り除き、8ウェルストリップチューブの適切なウェルに入れます。メディアには、下流のアッセイに使用される胚からの遺伝物質が含まれています。
    注:これは胚を損傷する可能性がありますので、メディア収集中にピペットチップで胚に触れないようにしてください。
13. プラスチック製のピペットを使用して、すぐに同じチャンバーに新鮮な胚培地の2滴を追加します。胚を収集し、24ウェルプレートの最初の井戸に移動します。
14. 残りのすべてのチャンバーについて、ステップ1.12と1.13を繰り返します。この完成時に、生きた胚を含む24のウェルプレートを28°Cインキュベーターに移動させることができる。
15. 適切な下流の遺伝子型アッセイを行い、胚の遺伝子型を決定する。
    注:胚の遺伝子型変換プラットフォームから得られたDNAは、PCRによって正常に増幅することができ、シーケンシング、ゲル電気泳動、または高解像度メルト分析¹⁴を含むその後の分析に使用することができます。代表的な結果に記載の lama2 株を遺伝子型化するために、PCR、制限消化およびゲル電気泳動が使用された。各胚から得られたDNAの濃度が低い場合、下流アッセイのために得られた遺伝物質の大部分を利用することが示唆される。
16. 各幼虫の遺伝子型が特定されたら、それらを90mmのペトリ皿に移し、各遺伝子型を別の皿に入れます。25 mL胚培地で皿を充填し、28°Cインキュベーターに保管します。

2. 針刺しを使用して筋肉損傷を行う

1. 幼虫が4dpfになったら、トリカインメタンスルホン酸を胚培地中の0.016%(v/v)の最終濃度に加えて麻酔します。魚が泳ぐのを止めると明らかに、魚が完全に麻酔されていることを確認するために10分待ちます。
   注意: バイアスを避けるため、遺伝子型のアイデンティティは、刺し傷と下流の分析を行う調査員に対して盲目にする必要があります。
2. この間、1mLの新鮮な胚培地を各ウェルに充填して24のウェルプレートを用意し、黒い背景と高出力光で実体顕微鏡を設定し、スマイト境界の視覚化を容易にする。
3. プラスチック製のピペットを使用して、麻酔をした幼虫を新しいペトリ皿に移します。
4. ピペットで過剰な胚培地を慎重に取り出し、解剖顕微鏡下で、頭が左、尾が左、尾、後側領域が上方および腹側領域下にあるような方向に魚を向けます(図1B)。
5. 解剖顕微鏡の下で働いて、水平骨髄の上にあるepaxial筋肉の速いが正確な刺し傷を行うために30ゲージの針を使用する。前部後部位置の一貫性を確保するために、肛門の上にある1-2のスマイトを目指す(図1B)。
   注:神経管と脊索を刺すことを避け、プロセス中に魚の乾燥を避けるために迅速に作業します。
6. プラスチック製のピペットを使用して、刺されたゼブラフィッシュに胚培地を一滴注ぎ、慎重に24ウェルプレートの井戸に移します。
7. ステップ 2.3 ~ 2.6 を繰り返します。すべての魚が刺されるまで。
   注:いくつかの幼虫は、プロセス中に魚が乾燥しない限り、調査官の処理速度と熟練度に応じて一緒に刺すことができます。
8. すべての幼虫が刺されたら、24ウェルプレートを28°Cインキュベーターに入れ、その後のイメージングが行われるまで行います。

3. 筋肉の損傷と回復のイメージング

1. 傷害後1日(1dpi)で、トリカインメタンスルホン酸塩を胚培地中の0.016%(v/v)の最終濃度に加えることによって、刺された幼虫を麻酔する。魚が泳ぐのを止めると明らかに、魚が完全に麻酔されていることを確認するために10分待ちます。
   注:0 dpiでは、創傷部位に大量の細胞デブリが含まれているため、筋肉損傷の程度を定量化することが困難です(補助図1A-B)。この破片が創傷部位から取り除かれるのに約18〜20時間かかり、したがって、引き出される傷害の程度を決定するために、0 dpiではなく1 dpiで幼虫を画像化する方が信頼性が高い。
2. 偏光顕微鏡のステージ上に清潔で空のガラス底ベースの皿を置き、統合されたソフトウェアを使用して背景を設定します。
   注:プラスチックペトリ皿は屈折光を適切に伝達しないので、複屈折をイメージするために使用しないでください。使用する偏光顕微鏡によっては、メーカーのガイドラインに従って追加の設定が必要な場合があります。
3. 背景を設定し、顕微鏡の段階からガラス底ベースの皿を取り出し、ガラスピペットを使用して、麻酔を受けた刺された魚をガラス底ベースの皿に移します。
4. 慎重にピペットを使用して胚培地の過剰を除去し、2.5に従って魚の向きを変える - 頭は左、尾は右、後部領域は上方および腹側領域を下に向けます。
   注:不均一な取り付けの結果、異なるスマイト間で異なる複屈折強度が生じるので、幼虫をできるだけ平らに取り付けることを確認してください。
5. 麻酔した幼虫を用いたガラス底皿を顕微鏡ステージに置き、偏光を用いて筋肉を画像化する(図1C&1D)。
   注:使用する顕微鏡/偏光レンズの種類に応じて、その前後軸の魚の向きは、全体的な複屈折¹⁵に影響を与える可能性があります。イメージング時に、損傷部位の両側に少なくとも5つのスマイトを含むようにしてください。
6. プラスチック製のピペットを使用して、魚を水分補給するために胚培地の滴を注ぎ、胚培地で満たされた24の井戸プレートの井戸に魚を置きます。
   注:魚の乾燥を防ぐために、できるだけ早くイメージングを行うことが重要です。
7. 手順 3.3 を繰り返します。3.6に。すべての魚が画像化されるまで。
8. すべての画像が取得されたら、後続の解析のために.tiff形式で保存します。
9. 3 dpi (7 dpf)で後のイメージングを行うまで、魚を28°Cインキュベーターに戻します。
10. 魚が3dpiの場合は、3.3〜3.8のごとに魚をイメージします。
11. すべての魚が画像化されたら、トリカインメタンスルホン酸塩を胚培地中の0.2%(v/v)の最終濃度に加えて安楽死させる。少なくとも10分待って、魚が安楽死させられ、水泳能力の低下、ギルカバーのポンピング、タッチ後の飛行応答の欠如によって明らかになります。

4. 筋肉再生の定量化

1. 自由に利用できる Image J ソフトウェアなどのイメージング解析ソフトウェアで 1 dpi 画像を開きます。
2. ポリゴンツールを使用して、創傷部位の周囲を描き、この領域の面積と平均複屈折強度を測定する(図1C&1D)。提供されているテンプレートのセル D3 および E3 にこれらの値をコピーします (補足表 1)。
3. 1-2の無負傷したスマイトにまたがる2つの追加領域を描画し、面積を測定し、これらの領域のそれぞれの複屈折強度を意味する(図1C&1D)。提供されたテンプレートのセル D4-D5 および E4-E5 にこれらの値をコピーします (補足表 1)。
   注:1dpiおよび3dpi画像で同じ損傷していないスマイトを選択することが好ましいが、筋線維の散発的剥離とその後の突然変異体の複屈折の減少はこれを不可能にする可能性がある。したがって、変異体の筋肉の完全性の低下のために1dpiと3dpiで同じスマイトを選択できない場合には、各タイムポイントで2つの異なるが影響を受けない領域を選択する。
4. 各領域の正規化された複屈折を、その領域の平均複屈折強度を領域で割って計算する - 提供されたテンプレートの列Fに表示される(補足表1)。
5. すべての 1 dpi および 3 dpi イメージに対して、手順 4.1 ~ 4.4 を繰り返します。
   注: 提供されるテンプレート (補足表 1)を使用する場合、1 dpi 領域と平均複屈折強度値をそれぞれ列 D と E に挿入し、3 dpi 領域と平均複屈折強度値をそれぞれ列 J および K に挿入する必要があります。
6. 各時点で、2 つの不傷領域の平均正規化複屈折を計算します。この値は、損傷していない筋肉の基準点を提供します。
   注: 提供されるテンプレート (補足表 1)では、この値は、それぞれ 1 dpi および 3 dpi イメージの列 G および M で計算されます。
7. 次に、1dpiでの筋肉損傷の程度を、損傷領域の正常化された複屈折を、損傷していない領域の平均正常化複屈折で割ることによって決定する(4.6で計算)。
   注:上記の詳細な針刺し手順を使用して、野生型幼虫は通常、1 dpiで創傷部位で48.5±14.3%の正規化された複屈折を示し、二屈折が傷つけていないスミテと比較して約50%減少したことを示す。テンプレート (補足表 1) を使用する場合、この値は列 H のパーセンテージとして計算されます。
8. 筋肉再生の程度を決定するために、3dpi画像における傷害領域の正規化された複屈折を、この段階での損傷していない領域の平均正常化された強度で割る。
   注:3dpiでは、野生型幼虫は通常、創傷部位で60±15.3%の正規化された複屈折を示す。1dpiで創傷部位内の正常化された複屈折率が48.5±14.3%(ステップ4.7)であったことを考えると、3dpiでの複屈折の増加率は60±15.3%程度の回復を示す。テンプレート (補足表 1) を使用する場合、この値は列 N のパーセンテージとして計算されます。
9. 各遺伝子型内の魚を分離して、創傷部位の正規化複屈折を3dpi(ステップ4.8)で1dpiの場合と比較する対t検定を行う(ステップ4.7)。これにより、各遺伝子型の各魚が表示する筋再生の軌跡が明らかにされ、各遺伝子型によって表示される筋肉再生の程度が有意に変化しているかどうかを強調します。
10. 最後に、ステップ4.8で得られた値を3dpiで筋肉再生の程度に分けて回生指数を算出し、ステップ4.7で得られた値で、1dpiで筋肉損傷の程度である。1 の回生指数は、1 dpi の傷害が 3 dpi に匹敵し、筋肉の再生が起きていないことを示します。1を超える値は、3dpiで新しい筋肉が創傷部位に形成され、筋肉が再生されたことを強調していることを示します。1未満の再生指数は、3dpiの創傷が1dpiより悪く、筋肉再生が損なわれていることを強調する。t検定または一方向のANOVAを実行して、異なる遺伝子型間の筋肉再生の程度を統計的に比較することができます。提供されたテンプレート (補足表 1) を使用する場合、この値は列 O で計算されます。
    注:偏りを避けるために、異なる生物学的両親から得られた各実験の魚と、各実験が異なる日に実行され、三重で実験全体を実行することをお勧めします。

結果

骨格筋の複屈折を定量化する能力は、筋肉の損傷のレベルを調べて比較し、生体内の筋肉再生を調べるための非侵襲的だが再現性の高い方法を提供する。二屈折は、筋サルコメア¹⁵の擬似結晶配列を通る偏光の回折から生じ、筋肉への傷害または損傷に続いて、複屈折の減少が明らかである。同様に、幹細胞の活性化と分化は、傷害部位内に?...

ディスカッション

骨格筋再生は、筋ジストロフィーなどの多くの筋肉疾患で機能が変化し、その後筋肉再生のプロセスを妨げる義務組織常駐筋幹細胞によって駆動される。ここでは、筋肉疾患の生きているゼブラフィッシュモデルにおける筋肉再生を調べるための高スループットプロトコルについて述べる。パイプラインの第1ステップは、下流再生アッセイを行う前に、生きた幼虫の遺伝子型を決定するユー...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Thermo Fischer	142475
30 gauge needles	Terumo	NN-3013R
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products PT	S9014S20
DNA extraction chips	wFluidx	ZEG chips
Embryo genotyping platform	wFluidx	ZEG base unit	Zebrafish Embryo Genotyper
Glass pipette	Hirschmann	9260101
Glass plate dish	WPI	FD35-100	Commonly referred to as FluoroDish
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
Plastic pipette	Livingstone	PTP03-01
Polarizing microscope	Abrio	N/A