Изучение регенерации мышц в моделях мышечных заболеваний рыбок данио

Резюме

Регенерация скелетных мышц обусловлена тканевыми мышечными стволовыми клетками, которые нарушаются при многих мышечных заболеваниях, таких как мышечная дистрофия, и это приводит к неспособности мышц к регенерации. Здесь мы опишем протокол, который позволяет идировать регенерацию мышц у рыбок данио моделей мышечных заболеваний.

Аннотация

Скелетные мышцы имеют замечательную способность к регенерации после травмы, которая обусловлена облигатными тканевыми резидентными мышечными стволовыми клетками. После травмы мышечная стволовая клетка активируется и подвергается пролиферации клеток для создания пула миобластов, которые впоследствии дифференцируются с образованием новых мышечных волокон. При многих состояниях мышечного истощения, включая мышечную дистрофию и старение, этот процесс нарушается, что приводит к неспособности мышц к регенерации. Процесс регенерации мышц у рыбок данио хорошо сохраняется с системами млекопитающих, обеспечивающими отличную систему для изучения функции и регенерации мышечных стволовых клеток в условиях мышечного истощения, таких как мышечная дистрофия. Здесь мы представляем метод изучения регенерации мышц в моделях мышечных заболеваний рыбок данио. Первый шаг включает в себя использование платформы генотипирования, которая позволяет определить генотип личинок до получения травмы. Определив генотип, мышцу травмируют с помощью игольчатого удара, после чего для определения степени регенерации мышц используется поляризационная световая микроскопия. Таким образом, мы обеспечиваем высокопроизводительный конвейер, который позволяет проводить исследование регенерации мышц в моделях мышечных заболеваний рыбок данио.

Введение

Скелетные мышцы составляют 30-50% массы тела человека, и не только незаменимы для передвижения, но и служат критическим метаболическим и накопительным^{органом1.} Несмотря на постмитотическую емкость, скелетные мышцы очень динамичны и сохраняют огромную регенеративную способность после травмы. Это объясняется наличием тканевых резидентных стволовых клеток (также называемых клетками-сателлитами), расположенных под базальной пластинкой миофиберов и отмеченных факторами транскрипции парного коробчатого белка 7 (pax7) и / или парного коробчатого белка 3 (pax3), среди прочих^2,3. После повреждения клетка-сателлит активируется и подвергается пролиферации клеток для создания пула миобластов, которые впоследствии дифференцируются с образованием новых мышечных волокон. Высокосохраняющийся каскад прорегенеративных сигналов, регулирующих активацию спутниковых клеток и надежное восстановление мышц, поражается при различных состояниях, таких как миопатии и гомеостатическое старение^4,5.

Одной из таких разнообразных групп миопатий является мышечная дистрофия, характеризующаяся прогрессирующим истощением мышц и дегенерацией^6. Эти заболевания являются следствием генетических мутаций в ключевых белках, включая дистрофин и ламинин-α2 (LAMA2), отвечающих за прикрепление мышечных волокон к внеклеточному матриксу^7,8. Учитывая, что белки, замешанные в мышечной дистрофии, играют такую центральную роль в поддержании мышечной структуры, в течение многих лет считалось, что сбой в этом процессе был механизмом, ответственным за патогенез заболевания^9. Однако последние исследования выявили дефекты регуляции мышечных стволовых клеток и последующее нарушение регенерации мышц как вторую возможную основу мышечной патологии, наблюдаемой при мышечной дистрофии^10,11. Таким образом, необходимы дальнейшие исследования, чтобы выяснить, как нарушение функции мышечных стволовых клеток и связанных с ними нишевых элементов способствует мышечной дистрофии.

За последнее десятилетие рыбка данио(Danio rerio)стала важной моделью позвоночных для моделирования заболеваний^12. Это объясняется быстрым внешним развитием эмбриона рыбки данио в сочетании с его оптической ясностью, которая позволяет непосредственно визуализировать формирование, рост и функцию мышц. Кроме того, у рыбок данио не только высоко сохраняется развитие и структура мышц, но и высоко консервативный процесс регенерации мышц^13. Следовательно, рыбки данио представляют собой отличную систему для изучения патобиологии мышечных заболеваний и изучения того, как в ней влияет регенерация мышц. С этой целью мы разработали метод, позволяющий своевременно изучать регенерацию скелетных мышц у рыбок данио моделей мышечных заболеваний. Этот высокопроизводительный конвейер включает в себя метод генотипирования живых эмбрионов^14,после которого выполняется травма иглой и степень регенерации мышц визуализируется с помощью поляризационной световой микроскопии. Таким образом, использование этого метода выявит регенеративную способность мышц в моделях мышечных заболеваний рыбок данио.

протокол

Уход за рыбками данио осуществлялся в соответствии со стандартными операционными процедурами, утвержденными Комитетом по этике животных Университета Монаш по лицензии племенной колонии ERM14481.

1. Определение генотипа живых эмбрионов с использованием платформы генотипирования эмбрионов.

1. Обезболивать через 3 дня после оплодотворения (dpf) эмбрионы рыбок данио путем добавления трикаина метансульфоната до конечной концентрации 0,016% (v/v) в эмбриональной среде (5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl_2,0,33 мМ MgSO₄ в воде). Подождите 10 минут, чтобы убедиться, что рыба полностью обезболена, что видно, когда рыба перестает плавать.
2. Подготовьте 24-камерный чип для экстракции ДНК, снимая прозрачную защитную пленку с верхней поверхностичипа (рисунок 1A).
3. Отрежьте наконечник наконечника фильтра 20 мкл, чтобы расширить отверстие. Используя это, выберите один эмбрион в объеме эмбриональной среды 13 мкл и загрузите его в первую камеру чипа. Повторяйте этот процесс до тех пор, пока эмбрионы не будут распределены в каждую камеру.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап следует выполнять в области с минимальными воздушными сквозняками, так как высокий поток воздуха может вызвать чрезмерное испарение жидкости, что впоследствии приведет к снижению чувствительности генотипирования и выживанию эмбрионов.
4. После того, как желаемое количество эмбрионов было загружено на чип экстракции ДНК, загрузите его на платформу генотипирования эмбрионов рыбок данио. Этого лучше всего достичь, поместив сначала в одну сторону, а затем в остальную.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте добавления слишком большого давления на платформу, так как это может перенапряжение и повреждение нижележащих пружин.
5. Прикрепите крышку магнитной платформы к чипу, что предотвратит испарение эмбриональных сред во время протокола экстракции ДНК, и закройте крышку платформы.
6. Установите базовый блок на 2,4 вольта, 0,051 А и 0,12 Вт и запустите протокол извлечения ДНК, нажав кнопку «ВКЛ/ВЫКЛ». Платформа должна начать вибрировать, что можно оценить, осторожно прикоснувшись к крышке. Протокол должен быть запущен в течение 8 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сильная вибрация приводит к выбрасывания эпидермальных клеток, из которых извлекается геномная ДНК.
7. Во время работы программы подготовьте пластину из 24 скважин, добавив 1 мл эмбриональной среды в каждую скважину, что необходимо для разделения отдельных эмбрионов во время проведения анализов генотипирования.
8. Кроме того, соответствующим образом маркируют 8 скважин ленточных трубок, которые будут использоваться для сбора материала ДНК у каждого эмбриона.
9. По завершении 8-минутного протокола нажмите кнопку ON/OFF, чтобы остановить вибрацию платформы.
10. Откройте крышку платформы и осторожно снимите магнитную крышку, обеспечив минимальное давление на платформу.
11. Осторожно извлеките чип днк с платформы и поместите его на плоскую поверхность.
12. Из первой камеры удалите 10 мкл эмбриональной среды, окружающей эмбрион, и поместите ее в соответствующий колодец 8-скважинной ленточной трубки. Среда содержит генетический материал из этого эмбриона, который будет использоваться для последующих анализов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте прикосновения к эмбриону кончиком пипетки во время сбора среды, так как это может повредить эмбрион.
13. Используя пластиковую пипетку, сразу же добавьте две капли свежей эмбриональной среды в ту же камеру. Соберите эмбрион и переместите его в первую скважину из 24-й пластины.
14. Повторите шаги 1.12 и 1.13 для всех остальных камер. По завершении этого 24-скважинная пластина, содержащая живые эмбрионы, может быть перемещена в инкубатор с 28 °C.
15. Выполните соответствующие анализы генотипирования для определения генотипа эмбрионов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: ДНК, полученная из платформы генотипирования эмбриона, может быть успешно амплифицирована с помощью ПЦР и может быть использована для последующего анализа, включая секвенирование, гель-электрофорез или анализ расплава высокого разрешения^14. Для генотипа штамма lama2, описанного в репрезентативных результатах, использовали ПЦР, рестрикционный сбраживание и гель-электрофорез. Учитывая, что концентрация ДНК, полученная из каждого эмбриона, низкая, предлагается использовать большинство, если не весь, генетический материал, полученный для последующего анализа.
16. Как только генотип каждой личинки будет идентифицирован, перенесите их в чашки Петри 90 мм, поместив каждый генотип в другую чашку. Наполните блюдо 25 мл эмбриональной средой и держите их в инкубаторе с 28 °C.

2. Выполнение мышечной травмы с помощью удара иглой

1. Как только личинки нарастут 4 dpf, обезболивают их, добавляя трикаин метансульфонат до конечной концентрации 0,016% (v/v) в эмбриональной среде. Подождите 10 минут, чтобы убедиться, что рыба полностью обезболена, что видно, когда рыба перестает плавать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы избежать предвзятости, идентичность генотипа должна быть ослеплена исследователем, выполняющим удары и последующие анализы.
2. За это время подготовьте 24 пластины скважины, заполнив каждую скважину 1 мл свежей эмбриональной среды, и установите стереомикроскоп с черным фоном и мощной подсветкой, чтобы облегчить визуализацию границ сомита.
3. С помощью пластиковой пипетки переложите одну обезболенную личинку в новую чашку Петри.
4. Осторожно удалите лишнюю эмбриональную среду пипеткой, а под рассекающим микроскопом ориентируйте рыбу так, чтобы голова была слева, хвост справа, дорсальная область вверх и вентральная область вниз(рисунок 1B).
5. Работая под рассекающим микроскопом, используйте иглу 30-го калибра для выполнения быстрого, но точного удара в епаксиальную мышцу, расположенную над горизонтальным миосектовым. Для обеспечения консистенции в передне-заднем положении стремитесь к 1-2 сомитам, расположенным над анальной порой(рисунок 1В).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте закалывания нервной трубки и нотохорды и работайте быстро, чтобы избежать высыхания рыбы во время процесса.
6. Используя пластиковую пипетку, налейте каплю эмбриональной среды на заколотую рыбку данио и аккуратно перенесите ее в колодец из 24-й пластины.
7. Повторите шаги 2.3–2.6. до тех пор, пока вся рыба не будет зарезана.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько личинок могут быть заколоты вместе в зависимости от скорости обработки и квалификации исследователя, если рыба не высохнет во время процесса.
8. После того, как все личинки были заколоты, поместите 24-ябойную пластину в инкубатор с 28 °C до тех пор, пока не будет выполнена последующая визуализация.

3. Визуализация мышечной травмы и восстановления

1. Через 1 день после травмы (1 dpi) обезболивают заколотых личинок, добавляя трикаин метансульфонат до конечной концентрации 0,016% (v/v) в эмбриональной среде. Подождите 10 минут, чтобы убедиться, что рыба полностью обезболена, что видно, когда рыба перестает плавать.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При 0 dpi место раны содержит большое количество клеточного мусора, что затрудняет количественную оценку степени повреждения мышц(дополнительный рисунок 1A-B). Для очистки этого мусора от места раны требуется примерно 18-20 часов, и поэтому более надежно визуазировать личинок при 1 dpi, а не 0 dpi, чтобы определить степень полученных травм.
2. Поместите чистую и пустую стеклянную посуду на основе дна на ступень поляризационного микроскопа и установите фон с помощью встроенного программного обеспечения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте пластиковые чашки Петри для изображения двулучепреломления, так как они не пропускают должным образом преломленный свет. В зависимости от используемого поляризованного микроскопа могут потребоваться дополнительные настройки в соответствии с рекомендациями производителя.
3. Заставив фон, снимите стеклянную нижнюю посуду со сцены микроскопа и с помощью стеклянной пипетки перенесите обезболенную, заколотую рыбу на стеклянную нижнюю посуду.
4. Осторожно удалите избыток эмбриональной среды с помощью пипетки, и ориентируйте рыбу по 2,5 – голова слева, хвост справа, дорсальная область вверх и вентральная область вниз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что личинки установлены как можно более плоскими, так как неравномерное крепление приводит к различной интенсивности двулучепреломления на разных сомитах.
5. Поместите стеклянную нижнюю посуду с обезболенные личинки на ступень микроскопа и изобразите мышцу с помощью поляризованного света(рисунки 1C & 1D).
   ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от типа используемого микроскопа/поляризованной линзы ориентация рыбы на ее передне-задней оси может влиять на общее двулучепреломления^15. Убедитесь, что при визуализации необходимо включить не менее 5 сомитов по обе стороны от места травмы.
6. Используя пластиковую пипетку, налейте каплю эмбриональной среды для регидратировать рыбу и поместите рыбу в колодец из 24 язычек, заполненных эмбриональной средой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно выполнить визуализацию как можно быстрее, чтобы предотвратить высыхание рыбы.
7. Повторите шаги 3.3. до 3.6. до тех пор, пока все рыбы не будут сфотожированы.
8. Когда все изображения будут получены, сохраните их в .tiff формате для последующего анализа.
9. Поместите рыбу обратно в инкубатор с 28 °C до выполнения последующей визуализации при 3 dpi (7 dpf).
10. Когда рыба находится в 3 dpi, изобразите рыбу в соответствии с 3,3 до 3,8.
11. После того, как все рыбы были сфовотированы, усыпить их, добавив трикаин метансульфонат до конечной концентрации 0,2% (v / v) в эмбриональной среде. Подождите не менее 10 минут, чтобы убедиться, что рыба усыплена, что проявляется в потере способности плавать, прокачке жаберных крышек и отсутствии реакции полета после прикосновения.

4. Количественная оценка регенерации мышц

1. Откройте изображение с разрешением 1 dpi в программном обеспечении для анализа изображений, таком как свободно доступное программное обеспечение Image J.
2. Используя полигональный инструмент, рисуйте вокруг места раны и измеряйте площадь и среднюю интенсивность двулучепреломления этойобласти (рисунки 1C и 1D). Скопируйте эти значения в ячейки D3 и E3 в предоставленномшаблоне (Дополнительная таблица 1).
3. Нарисуйте две дополнительные области, каждая из которых охватывает 1-2 неповредимых сомита, и измерьте площадь и среднюю интенсивность двулучепреломления каждой из этих областей(рисунки 1C и 1D). Скопируйте эти значения в ячейки D4-D5 и E4-E5 в предоставленномшаблоне (Дополнительная таблица 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя предпочтительно выбирать одни и те же неповреденные сомиты на изображениях 1 dpi и 3 dpi, спорадическая отслойка мышечных волокон и последующее снижение двулучепреломления у мутантов могут сделать это невозможным. Поэтому, если одни и те же сомиты не могут быть выбраны при 1 dpi и 3 dpi из-за снижения целостности мышц у мутантов, выберите две разные, но незатронутые области в каждой из временных точек.
4. Рассчитать нормализованное двулучепреломления для каждого региона, разделив среднюю интенсивность двулучепреломления этой области на площадь, отображаемую в столбце F в предоставленномшаблоне (Дополнительная таблица 1).
5. Повторите шаги 4.1–4.4 для всех изображений с 1 и 3 токи на дюйм.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании предоставленного шаблона(дополнительная таблица 1)значения площади 1 dpi и средней интенсивности двулучепреломления должны быть вставлены соответственно в колонки D и E, а значения площади 3 dpi и средней интенсивности двулучепреломления должны быть вставлены в колонки J и K соответственно.
6. Для каждой точки времени рассчитайте среднее нормализованное двулучепреломления двух неповредимых областей. Это значение обеспечивает точку отсчета неповредимых мышц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В представленномшаблоне (Дополнительная таблица 1)это значение вычисляется в столбцах G и M для изображений с 1 dpi и 3 dpi соответственно.
7. Далее определяют степень повреждения мышц при 1 dpi, разделив нормализованное двулучепреломления области повреждения на среднее нормализованное двулучепреломления неповредимых областей (рассчитано в 4.6).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используя вышеупомязанную подробную процедуру закола иглой, личинки дикого типа обычно показывают нормализованное двулучепреломление 48,5 ± 14,3% в месте раны при 1 dpi, что указывает на то, что двулучепреломение уменьшилось примерно на 50% по сравнению с непоредимыми сомитами. При использовании шаблона (Дополнительная таблица 1) это значение вычисляется в процентах в столбце H.
8. Чтобы определить степень регенерации мышц, разделите нормализованное двулучепреломение травмированной области на изображении 3 dpi на среднюю нормализованную интенсивность неповредимых областей на этом этапе.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При 3 dpi личинки дикого типа обычно показывают нормализованное двулучепреломение 60 ± 15,3% в месте раны. Учитывая, что нормализованное двулучепреломления в месте раны при 1 dpi составило 48,5 ± 14,3% (шаг 4,7), увеличение двулучепреломления при 3 dpi до 60 ± 15,3% указывает на выздоровление примерно на 11,5%. При использовании шаблона (Дополнительная таблица 1) это значение вычисляется в процентах в столбце N.
9. Держа рыб в пределах каждого генотипа отдельно, выполните парный t-тест, сравнивая нормализованное двулучепреломления раневого участка при 3 dpi (шаг 4.8) с 1 dpi (шаг 4.7). Это выявит траекторию регенерации мышц, отображаемую каждой рыбой в каждом генотипе, и подчеркнет, значительно ли изменилась степень регенерации мышц, отображаемая каждым генотипом.
10. Наконец, рассчитайте регенеративный индекс, разделив значение, полученное на шаге 4.8, которое представляет собой степень регенерации мышц при 3 dpi, на значение, полученное на шаге 4.7, которое представляет собой степень мышечной травмы при 1 dpi. Регенеративный индекс 1 указывает на то, что травма при 1 dpi сопоставима с 3 dpi и что регенерация мышц не произошла; значение выше 1 указывает на то, что при 3 dpi в месте раны сформировалась новая мышца, подчеркивая, что мышца восстановилась; и регенеративный индекс менее 1 подчеркивает, что рана при 3 dpi хуже, чем 1 dpi, и что регенерация мышц у нарушена. T-тест или односторонний ANOVA может быть выполнен для статистического сравнения степени регенерации мышц между различными генотипами. При использовании предоставленного шаблона (Дополнительная таблица 1) это значение вычисляется в столбце O.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется проводить весь эксперимент в трех отношениях, с рыбами из каждого эксперимента, полученными от разных биологических родителей, и каждый эксперимент, выполняемый в разные дни, чтобы избежать какой-либо предвзятости.

Результаты

Способность количественно оценивать двулучепреломления скелетных мышц обеспечивает неинвазивный, но высоко воспроизводимый метод для изучения и сравнения уровней повреждения мышц и изучения регенерации мышц in vivo. Двулучепреломение является результатом дифра...

Обсуждение

Регенерация скелетных мышц обусловлена облигатными тканевыми резидентными мышечными стволовыми клетками, функция которых изменяется при многих мышечных заболеваниях, таких как мышечная дистрофия, впоследствии препятствуя процессу регенерации мышц. Здесь мы описываем протокол высо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Thermo Fischer	142475
30 gauge needles	Terumo	NN-3013R
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products PT	S9014S20
DNA extraction chips	wFluidx	ZEG chips
Embryo genotyping platform	wFluidx	ZEG base unit	Zebrafish Embryo Genotyper
Glass pipette	Hirschmann	9260101
Glass plate dish	WPI	FD35-100	Commonly referred to as FluoroDish
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
Plastic pipette	Livingstone	PTP03-01
Polarizing microscope	Abrio	N/A