检查斑马鱼肌肉疾病模型中的肌肉再生

摘要

骨骼肌再生是由组织常驻肌肉干细胞驱动的，这些干细胞在许多肌肉疾病（如肌肉萎缩症）中受损，这导致肌肉无法再生。在这里，我们描述了一个协议，允许检查肌肉再生的斑马鱼模型的肌肉疾病。

摘要

骨骼肌在受伤后具有非凡的再生能力，这是由强制性组织常驻肌肉干细胞驱动的。受伤后，肌肉干细胞被激活，并经历细胞增殖，以产生肌质池，随后分化形成新的肌肉纤维。在许多肌肉浪费条件下，包括肌肉萎缩和老化，这个过程是受损的，导致肌肉无法再生。斑马鱼的肌肉再生过程高度保守，哺乳动物系统为研究肌肉干细胞功能和再生提供了一个极好的系统，在肌肉消耗条件下，如肌肉萎缩症。在这里，我们提出了一种方法来检查肌肉再生在斑马鱼模型的肌肉疾病。第一步涉及使用基因分型平台，允许在引起伤害之前确定幼虫的基因型。在确定基因型后，肌肉被针刺受伤，然后用偏振光显微镜确定肌肉再生的程度。因此，我们提供了一个高吞吐量管道，允许检查肌肉再生的斑马鱼模型的肌肉疾病。

引言

骨骼肌占人体质量的30-50%，不仅对运动不可或缺，而且作为关键的代谢和储存器官^1。尽管是后体，骨骼肌是高度动态的，并保留巨大的再生能力后受伤。这是由于组织常驻干细胞（也称为卫星细胞）的存在，位于肌瘤的基底拉米纳下，并标有转录因子配对盒蛋白7（pax7）和/或配对盒蛋白3（pax3），等等^2，3。受伤后，卫星细胞被激活，并经历细胞增殖，以产生肌质池，随后分化形成新的肌肉纤维。调节卫星细胞激活和强健肌肉修复的高度保存的亲再生信号级联在各种条件下受到影响，如肌病和静止老化^4，5。

一个如此多样化的肌病组是肌肉萎缩症，其特点是渐进性肌肉浪费和退化^6。这些疾病是关键蛋白质的基因突变的结果，包括肌营养不良素和层压素-2 （LAMA2），负责将肌肉纤维附着在细胞外基质^7，8。鉴于与肌肉营养不良有关的蛋白质在维持肌肉结构方面起着如此核心的作用，多年来人们一直认为，这一过程中的失....

研究方案

斑马鱼的饲养是按照莫纳什大学动物伦理委员会根据繁殖区许可证ERM14481批准的标准操作程序进行的。

1. 使用胚胎基因型平台确定活胚胎的基因型。

1. 麻醉受精后3天（dpf）斑马鱼胚胎，在胚胎介质（5 mM NaCl，0.17m KCl，0.33 m CaCl₂，0.33m MgSO_4） 中加入三甲烷硫酸盐的最终浓度。等待10分钟，以确保鱼完全麻醉，当鱼停止游泳时明显。
2. 通过从芯片顶部表面剥开透明保护膜（图1A），准备24室DNA提取芯片。
3. 切割 20 μL 滤芯的尖端以扩大开口。使用此，在 13 μL 的胚胎介质体积中选择单个胚胎并加载到芯片的第一个腔室中。重复此过程，直到胚胎被分配到每个腔室。
   注：此步骤应在空气流最少的区域执行，因为高气流可能导致液体过度蒸发，从而降低基因型敏感性和胚胎的存活率。
4. 一旦所需的胚胎数量被装载到DNA提取芯片上，将其加载到斑马鱼胚胎基因分型平台上。最好先放在一边，然后放在另一边。
   注意：避免在平台上增加太大的压力，因为这可能会过度应力并损坏底层弹簧。
5. 在芯片上贴上磁平台盖，防止胚胎介质在DNA提取过程中蒸发，并关闭平台盖。
6. 将基座单位设置为 2.4 伏特、0.051 A 和 0.12 W，并通过按下"开/关"按钮....

结果

能够量化骨骼肌的双裂，提供了一个非侵入性，但高度可重复的方法来检查和比较肌肉损伤水平，并检查肌肉再生在体内。双裂是由于极化光通过肌肉肉瘤¹⁵的伪晶体阵列衍射而成，在肌肉受伤或损伤后，双极化明显减少。同样，干细胞的激活和分化导致在损伤部位形成新的肌肉纤维，从而增加该区域内的双性恋强度。利用这个系统，我们检查了?.......

讨论

骨骼肌再生是由强制性组织常驻肌肉干细胞驱动的，其功能在许多肌肉疾病（如肌肉萎缩症）中改变，从而阻碍肌肉再生的过程。在这里，我们描述了一个高吞吐量协议，以检查肌肉疾病的活斑马鱼模型的肌肉再生。管道的第一步利用胚胎基因分型平台^14，这是一个用户友好和准确的方法来确定活幼虫的基因型，然后再进行下游再生测定。其直接好处是，它允许选择仅感兴趣的?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Thermo Fischer	142475
30 gauge needles	Terumo	NN-3013R
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products PT	S9014S20
DNA extraction chips	wFluidx	ZEG chips
Embryo genotyping platform	wFluidx	ZEG base unit	Zebrafish Embryo Genotyper
Glass pipette	Hirschmann	9260101
Glass plate dish	WPI	FD35-100	Commonly referred to as FluoroDish
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
Plastic pipette	Livingstone	PTP03-01
Polarizing microscope	Abrio	N/A