근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생 검토

요약

골격 근 재생 조직 상주 근육 줄기 세포에 의해 구동, 근육 이영양증 등 많은 근육 질환에서 손상 되는, 그리고이 재생 하는 근육의 무능력 결과. 여기서는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생을 검사할 수 있는 프로토콜을 설명합니다.

초록

골격 근은 의무 조직 상주 근육 줄기 세포에 의해 구동 되는 부상 다음 재생 하는 놀라운 능력을 가지고. 부상 후, 근육 줄기 세포는 활성화 하 고 myoblasts의 풀을 생성 하는 세포 증식을 겪고, 이후 새로운 근육 섬유를 형성 하기 위해 분화. 많은 근육 낭비 조건에서, 근육 이영양증과 노화를 포함 하 여, 이 과정은 재생 하는 근육의 무능력의 결과 손상. 제브라피시의 근육 재생 과정은 근육 이영양증과 같은 근육 낭비 조건에서 근육 줄기 세포 기능 및 재생을 연구할 수 있는 우수한 시스템을 제공하는 포유류 시스템과 매우 잘 보존됩니다. 여기서는 근육질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생을 검사하는 방법을 제시한다. 첫 번째 단계는 상해를 유도하기 전에 애벌레의 유전자형의 결정을 허용하는 유전자속 플랫폼의 사용을 포함합니다. 유전자형을 결정한 후, 근육은 바늘 찌르기를 사용하여 부상을 입고, 그 다음에는 편광 광 현미경 검사가 근육 재생의 정도를 결정하는 데 사용된다. 따라서 우리는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 근육 재생의 검사를 할 수있는 높은 처리량 파이프 라인을 제공합니다.

서문

골격 근은 인체 질량의 30-50%를 차지하며, 운동에 필수적일 뿐만 아니라 중요한 대사 및 저장 기관^1의역할을 한다. 미예임에도 불구하고, 골격 근은 매우 역동적이며 부상 후 엄청난 재생 능력을 유지합니다. 이는 조직상상줄기세포(위성세포라고도 함)의 존재에 기인하며, 근섬유의 기저라미나 아래에 위치하며, 전사인인에 의해 박스 단백질 7(pax7) 및/또는 페어링된 상자 단백질 3(pax3) 등 ^2,3. 부상 후, 위성 세포는 활성화 되고 myoblasts의 풀을 생성 하기 위해 세포 증식을 겪고, 이후 새로운 근육 섬유를 형성 하기 위해 분화. 위성 세포 활성화및 견고한 근육 수리를 조절하는 프로 재생 신호의 고도로 보존된 폭포는 근막병증 및 동종성 노화^4,5와같은 다양한 조건에서 영향을 받습니다.

이러한 다양한 근막병증 중 하나는 근육 이영양증으로, 진보적인 근육 낭비와 변성을 특징으로^{한다 6.} 이들 질환은 비스트로핀과 라미닌-α2(LAMA2)를 포함한 주요 단백질의 유전적 돌연변이의 결과이며, 세포외 매트릭스^7,8에근육 섬유를 부착하는 데 책임이 있다. 근육 이영양증에 연루된 단백질이 근육 구조를 유지하는 데 있어 이러한 중심적인 역할을 한다는 점을 감안할 때, 수년 동안 이 과정의 실패는 질병 병인^9에대한 메커니즘이라고 여겨졌다. 그러나, 최근 연구는 근이영양증^10,11에서관찰된 근육 병리학에 대한 두 번째 가능한 기초로서 근육 줄기 세포의 조절 및 근육 재생의 후속 장애에 결함을 확인하였다. 이와 같이, 추가 연구는 근육 줄기 세포 기능 및 관련 된 틈새 요소에 장애 근육 이영양증에 기여 하는 방법을 조사 하는 데 필요한.

지난 10년 동안제브라피쉬(다리오 리오)는질병 모델링^12를위한 중요한 척추동물 모델로 떠올랐다. 이것은 제브라피시 태아의 급속한 외부 발달에 기인합니다, 그것의 광학 선명도와 결합하여, 근육 형성의 직접적인 가시화를 허용하는, 성장 및 기능. 또한, 제브라피시에 보존되는 근육의 발달과 구조뿐만 아니라, 또한 근육 재생의 매우 보존된 과정을^{표시한다 13.} 따라서, 제브라피쉬는 근육 질환의 병리학을 연구하고 근육 재생이 어떻게 영향을 받는지 탐구하는 훌륭한 시스템을 나타냅니다. 이를 위해, 우리는 근육 질환의 제브라피시 모델에서 골격 근육 재생의 적시 연구를 가능하게하는 방법을 개발했다. 이 높은 처리량 파이프라인은 바늘 찌르기 부상이 수행되고 근육 재생의 정도가 편광 광 현미경을 사용하여 이미지되는 다음 인멸형 살아있는^{배아(14)를}유전자형으로 하는 방법을 포함한다. 이 기술의 활용은 그러므로 근육 질병의 제브라피시 모형에 있는 근육의 재생 능력을 드러낼 것입니다.

프로토콜

제브라피쉬 유지보수는 모나시 대학 동물윤리위원회가 승인한 표준 운영 절차에 따라 사육 식민지 면허 ERM14481에 따라 수행되었다.

1. 배아 지노티핑 플랫폼을 사용하여 살아있는 배아의 유전자형 결정.

1. 마취 3일 후 수정(dpf) 제브라피시 배아는 배아 배지(5mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33mM CaCl_2,0.33m MgSO_4)의 최종 농도에 트리카인 메탄술포네이트를 첨가하여 최종 농도0.016%(v/v)를 첨가하였다. 물고기가 수영을 멈출 때 분명 물고기가 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 10 분 동안 기다립니다.
2. 칩의 상단 표면에서 투명 한 보호 필름을 벗겨서 24 챔버 DNA 추출 칩을 준비(도 1A).
3. 20 μL 필터 팁의 끝을 잘라 개구부를 넓게 합니다. 이를 이용하여, 13 μL 부피의 배아 배지로 단일 배아를 선택하고 칩의 제1 챔버로 적재한다. 배아가 각 챔버에 분배 될 때까지이 과정을 반복합니다.
   참고: 이 단계는 최소한의 공기 초안을 가진 지역에서 수행되어야 하며, 높은 공기 흐름이 이후에 유체의 과도한 증발을 일으켜 배아의 기형감과 생존을 감소시킬 수 있습니다.
4. 원하는 수의 배아가 DNA 추출 칩에 적재되면 제브라피시 배아 지노티핑 플랫폼에 적재하십시오. 이것은 가장 먼저 한쪽에 배치하여 달성, 그것의 나머지 다음에.
   참고: 기본 스프링이 과도하게 스트레스를 받고 손상될 수 있기 때문에 플랫폼에 너무 많은 압력을 가하지 마십시오.
5. DNA 추출 프로토콜 동안 배아 미디어의 증발을 방지하고 플랫폼 뚜껑을 닫는 칩 위에 자기 플랫폼 뚜껑을 부착합니다.
6. 기본 유닛을 2.4볼트, 0.051 A 및 0.12W로 설정하고 "ON/OFF" 버튼을 눌러 DNA 추출 프로토콜을 시작합니다. 플랫폼은 진동을 시작해야 하며, 뚜껑을 부드럽게 터치하여 평가할 수 있습니다. 프로토콜은 8분 동안 실행되어야 합니다.
   참고: 격렬한 진동은 게놈 DNA가 추출되는 표피 세포의 흘리기에서 발생합니다.
7. 프로그램이 실행되는 동안, 하류 지노티핑 소약이 수행되는 동안 개별 배아를 분리하는 데 필요한 각 우물에 배아 배지 1 mL을 추가하여 24 개의 웰 플레이트를 준비합니다.
8. 추가적으로, 각 태아에서 DNA 물질의 수집에 사용될 8 잘 스트립 튜브를 적당하게 표시합니다.
9. 8분 프로토콜이 완료되면 ON/OFF 버튼을 눌러 플랫폼의 진동을 차단합니다.
10. 플랫폼의 뚜껑을 열고 자석 뚜껑을 부드럽게 제거하여 최소한의 압력이 플랫폼에 적용됩니다.
11. 조심스럽게 플랫폼에서 DNA 추출 칩을 제거하고 평평한 표면에 배치합니다.
12. 제1 챔버에서 배아를 둘러싼 배아 매체의 10 μL을 제거하고 8웰 스트립 튜브의 적절한 우물에 놓습니다. 매체는 다운스트림 에세이에 사용될 그 태아에서 유전 물질을 포함합니다.
    참고: 미디어 수집 중에 배아를 만지지 마십시오.
13. 플라스틱 파이펫을 사용하여 즉시 동일한 챔버에 신선한 배아 배지 2 방울을 추가하십시오. 배아를 수집하고 24 웰 플레이트의 첫 번째 우물로 이동합니다.
14. 나머지 모든 챔버에 대해 1.12 및 1.13 단계를 반복합니다. 이를 완성하면, 살아있는 배아를 함유하는 24개의 웰 플레이트는 28°C 인큐베이터로 이동할 수 있다.
15. 배아의 유전자형을 결정하기 위해 적절한 하류 유전자 검사를 수행합니다.
    참고: 배아 지노티핑 플랫폼에서 얻은 DNA는 PCR에 의해 성공적으로 증폭될 수 있으며 시퀀싱, 겔 전기포고, 또는 고해상도 용융^{분석(14)을}포함하는 후속 분석에 사용될 수 있다. 대표적인 결과에 기재된 라마2 균주를 유전자형에, PCR, 제한 소화 및 겔 전기포고증이 사용하였다. 각 배아에서 얻은 DNA의 농도가 낮다는 점을 감안할 때, 다운스트림 분석에 대해 수득된 유전 물질의 대부분을 활용하는 것이 좋습니다.
16. 각 애벌레의 유전자형이 확인되면 90mm 페트리 접시로 옮기고 각 유전자형을 다른 접시에 넣습니다. 접시를 25mL 배아 배지로 채우고 28°C 인큐베이터에 보관하십시오.

2. 바늘 찌르기를 사용하여 근육 부상 수행

1. 애벌레가 4dpf인 후, 배아 배지에서 0.016%(v/v)의 최종 농도에 트리카인 메탄술포네이트를 첨가하여 마취한다. 물고기가 수영을 멈출 때 분명 물고기가 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 10 분 동안 기다립니다.
   참고: 편견을 피하기 위해 유전자형의 ID는 찌르기 및 다운스트림 분석을 수행하는 구도자에게 눈을 멀게 해야 합니다.
2. 이 기간 동안, 신선한 배아 배지의 1mL로 각각 을 잘 채우고, 검은 색 배경과 고출력 빛으로 스테레오 현미경을 설정하여 24 개의 잘 플레이트를 준비하여 소미트 테두리의 시각화를 용이하게합니다.
3. 플라스틱 파이펫을 사용하여 마취된 애벌레 하나를 새로운 페트리 접시에 옮기습니다.
4. 파이펫을 가진 과잉 배아 매체를 신중하게 제거하고, 해부 현미경하에서, 머리가 왼쪽에 있는 물고기, 꼬리, 등부 및 복부 부위 를 아래로 오리엔트(도1B)한다.
5. 해부 현미경으로 작업, 수평 근막 위에있는 epaxial 근육에 빠르지만 정확한 찌르기를 수행하기 위해 30 게이지 바늘을 사용합니다. 전방 후방 위치에서 일관성을 보장하기 위해 항문 모공 위에 위치한 1-2 개의솜투(그림 1B)를목표로 합니다.
   참고 : 신경관과 notochord를 찌르지 말고 공정 중에 물고기의 건조를 피하기 위해 신속하게 작동하십시오.
6. 플라스틱 파이펫을 사용하여, 찔린 제브라피시에 배아 배지 한 방울을 붓고 조심스럽게 24 웰 플레이트의 우물로 옮기.
7. 2.3~ 2.6단계를 반복합니다. 모든 물고기가 찔려 때까지.
   참고: 과정에서 물고기가 건조하지 않는 한, 조사관의 처리 속도와 숙련도에 따라 여러 애벌레를 함께 찔릴 수 있습니다.
8. 모든 애벌레가 찔린 후 후속 이미징이 수행될 때까지 28°C 인큐베이터에 24개의 웰 플레이트를 배치합니다.

3. 근육 부상 과 회복의 이미징

1. 1일 사후상해(1dpi)에서 트리카인 메탄술포네이트를 배아 배지에서 0.016%(v/v)의 최종 농도로 첨가하여 찔린 애벌레를 마취한다. 물고기가 수영을 멈출 때 분명 물고기가 완전히 마취되었는지 확인하기 위해 10 분 동안 기다립니다.
   참고: 0 dpi에서 상처 부위에는 많은 양의 세포 이물질이 포함되어 있어 근육 부상의 정도를 정량화하기가 어렵습니다(보조도 1A-B). 이 파편이 상처 부위에서 치워지는 데는 약 18-20 시간이 걸리며, 따라서 0 dpi가 아닌 1 dpi에서 이미지 애벌레를 이미지하여 유도 된 부상의 정도를 결정하는 데 더 신뢰할 수 있습니다.
2. 편광 현미경의 단계에 깨끗하고 빈 유리 바닥 기반 접시를 놓고 통합 소프트웨어를 사용하여 배경을 설정합니다.
   참고: 굴절된 빛을 적절히 전송하지 않기 때문에 플라스틱 페트리 접시를 사용하여 비리음을 이미지화하지 마십시오. 사용되는 편광 현미경에 따라 제조업체의 지침에 따라 추가 설정이 필요할 수 있습니다.
3. 배경을 설정하면 현미경 단계에서 유리 바닥 기반 접시를 제거하고 유리 파이펫을 사용하여 마취된 찔린 생선을 유리 바닥 기반 접시에 전달합니다.
4. 조심스럽게 파이펫을 사용하여 배아 매체의 과잉을 제거하고 2.5 당 물고기를 방향을 지정합니다 - 머리는 왼쪽, 오른쪽에 꼬리, 등쪽 영역 위로 및 복부 부위를 아래로.
   참고: 고르지 않은 장착으로 인해 다양한 소미트에 걸쳐 다양한 자작물이 강화되기 때문에 유충이 가능한 한 평평하게 장착되도록 하십시오.
5. 현미경 단계에 마취 된 애벌레와 유리 바닥 기반 접시를 놓고 편광 광(그림 1C 및 1D)을사용하여 근육을 이미지합니다.
   참고: 사용되는 현미경/편광 렌즈의 종류에 따라 전방 후방 축의 물고기 방향은 전체^{비경작기(15)에}영향을 줄 수 있다. 이미징 할 때 부상 부위의 양쪽에 적어도 5 개의 솜을 포함해야합니다.
6. 플라스틱 파이펫을 사용하여 배아 매체 한 방울을 부어 물고기를 수분을 보충하고 물고기를 배아 매체로 채워진 24 개의 우물 판에 놓습니다.
   참고: 물고기가 건조되는 것을 방지하기 위해 가능한 한 빨리 이미징을 수행하는 것이 중요합니다.
7. 3.3 단계를 반복합니다. 3.6. 모든 물고기가 이미지될 때까지.
8. 모든 이미지를 획득한 경우 후속 분석을 위해 .tiff 형식으로 저장합니다.
9. 물고기를 28°C 인큐베이터에 다시 넣고 후속 이미징을 수행할 때까지 3dpi(7dpf)로 수행합니다.
10. 물고기가 3 dpi인 경우 물고기를 3.3에서 3.8로 이미지합니다.
11. 일단 모든 물고기가 심해졌으면, 배아 매체에 있는 0.2%(v/v)의 최종 농도에 트리카인 메탄술포네이트를 추가하여 안락사하십시오. 수영 능력의 상실, 아가미 커버 펌핑, 터치 후 비행 응답부족으로 인해 물고기가 안락사되도록 최소 10분 이상 기다립니다.

4. 근육 재생의 정량화

1. 자유롭게 사용할 수 있는 Image J 소프트웨어와 같은 이미징 분석 소프트웨어에서 1dpi 이미지를 엽니다.
2. 다각형 도구를 사용하여 상처 부위 주위에 그림을 그리고 이 지역의 면적과 평균 배금강도(그림 1C 및 1D)를측정한다. 제공된 템플릿에서 이러한 값을 D3 및 E3 셀에복사합니다(보충 표 1).
3. 각각 1-2개의 부상되지 않은 소크를 아우르는 두 개의 추가 영역을 그리고 각 지역의 면적과 평균 자른개 강도를 측정합니다(그림1C 및 1D). 이러한 값을 제공된 템플릿에서 D4-D5 및 E4-E5 셀에복사합니다(보충 표 1).
   참고: 1 dpi 및 3 dpi 이미지에서 동일한 미부상 솜투를 선택하는 것이 바람직하지만, 근육 섬유의 산발적 분리 및 돌연변이의 배금기 감소는 이를 불가능하게 만들 수 있습니다. 따라서 돌연변이의 근육 무결성 감소로 인해 동일한 소미트를 1 dpi 및 3 dpi에서 선택할 수 없는 경우 각 타임포인트에서 서로 다르지만 영향을 받지 않는 두 영역을 선택합니다.
4. 제공된 템플릿의 열 F에 표시되는 영역별로 해당 지역의 평균 비리프링스 강도를 분할하여 각 지역의 정규화된 자작나무를계산합니다(보충표 1).
5. 모든 1 dpi 및 3 dpi 이미지에 대해 4.1-4.4 단계를 반복합니다.
   참고: 제공된템플릿(보충표 1)을사용하는 경우, 1dpi 영역 및 평균 배금 강도 값을 각각 열 D 및 E에 삽입해야 하며, 3dpi 영역 및 평균 배금 강도 값을 각각 열 J및 K에 삽입해야 합니다.
6. 각 시간 지점에 대해, 부상되지 않은 두 지역의 평균 정규화 된 자경단을 계산합니다. 이 값은 부상되지 않은 근육의 기준점을 제공합니다.
   참고: 제공된템플릿(보충 표 1)에서이 값은 각각 1dpi 및 3 dpi 이미지에 대해 열 G 및 M로 계산됩니다.
7. 다음으로, 부상 부위의 정규화된 배금류를 부상 부위의 평균 정상화된 비리로 나누어 1dpi에서 근육 부상의 정도를 결정한다(4.6에서 계산).
   참고: 상기 상세한 바늘 찌르기 절차를 사용하여, 야생형 애벌레는 전형적으로 1dpi에서 상처 부위에 48.5 ± 14.3%의 정규화된 배금류를 나타내며, 이는 부상되지 않은 솜릿에 비해 약 50% 감소했음을 나타냅니다. 템플릿(보충 표 1)을사용하는 경우 이 값은 열 H의 백분율로 계산됩니다.
8. 근육 재생의 정도를 결정하기 위해, 3 dpi 이미지에서 부상 부위의 정규화된 배금전을 이 단계에서 부상 부위의 평균 정규화 강도로 나눈다.
   참고: 3 dpi에서 야생형 애벌레는 일반적으로 상처 부위에서 60 ± 15.3%의 정규화된 배금류를 보여줍니다. 1dpi에서 상처 부위 내의 정규화된 비리금은 48.5± 14.3%(단계 4.7)로, 3dpi에서 60± 15.3%로 증가한 것을 감안할 때 약 11.5%의 회복률을 나타낸다. 템플릿(보충 표 1)을사용하는 경우 이 값은 열 N에서 백분율로 계산됩니다.
9. 각 유전자형 내에 물고기를 분리하고, 상처 부위의 정규화된 배금(4.8단계)과 1dpi(단계 4.7)를 비교하는 쌍형 t-test를 수행한다. 이것은 각 유전자형에 있는 각 물고기에 의해 표시된 근육 재생의 궤적을 드러내고, 각 유전자형에 의해 표시되는 근육 재생의 범위가 현저하게 변경된 경우에 강조합니다.
10. 마지막으로, 4.8단계에서 얻은 값을 3dpi에서 근육 재생의 정도인 값을 4.7단계에서 얻은 값으로 나누어 재생 지수를 계산하여, 이는 1 dpi에서 근육 손상의 정도입니다. 재생 지수 1은 1 dpi의 부상이 3 dpi에 필적하고 근육 재생이 발생하지 않았다는 것을 나타냅니다. 값이 1 위의 값은 3 dpi새로운 근육이 상처 부위에 형성되어 근육이 재생되었음을 강조한다는 것을 나타냅니다. 그리고 1 미만의 재생 지수는 3 dpi의 상처가 1 dpi보다 더 나쁘고, 손상된 근육 재생이 있음을 강조합니다. T-테스트 또는 단방향 ANOVA는 다른 유전자형 간의 근육 재생 정도를 통계적으로 비교하기 위해 수행될 수 있다. 제공된 템플릿(보충표 1)을사용하는 경우 이 값은 열 O로 계산됩니다.
    참고: 각 실험의 물고기가 서로 다른 생물학적 부모로부터 얻은 물고기와 편견을 피하기 위해 각 실험이 다른 날에 수행되는 트리클리카테에서 전체 실험을 수행하는 것이 좋습니다.

결과

골격 근육의 비리프링을 정량화하는 능력은 비침습적이지만 매우 재현 가능한 방법을 제공하여 근육 손상 수준을 검사하고 비교하고 생체 내에서근육 재생을 검사합니다. 비리프링스는 근육^{사혜성(15)의}의사 결정 배열을 통해 편광된 빛의 회절로 인해 발생하며, 근육의 부상이나 손상에 따라, 배기율의 감소가 분명하다. 마찬가지로, 줄기 세포의 ...

토론

골격 근 재생 의무 조직 상주 근육 줄기 세포에 의해 구동, 그의 기능은 근육 이영양증 등 많은 근육 질환에서 변경, 이후 근육 재생의 과정을 방해. 여기에서, 우리는 근육 질병의 살아있는 제브라피시 모형에 있는 근육 재생을 검토하기 위하여 높은 처리량 프로토콜을 기술합니다. 파이프라인의 첫 번째 단계는 하류 재생 분석법을 수행하기 전에 살아있는 유충의 유전자형을 결정하는 사용자 친?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Thermo Fischer	142475
30 gauge needles	Terumo	NN-3013R
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products PT	S9014S20
DNA extraction chips	wFluidx	ZEG chips
Embryo genotyping platform	wFluidx	ZEG base unit	Zebrafish Embryo Genotyper
Glass pipette	Hirschmann	9260101
Glass plate dish	WPI	FD35-100	Commonly referred to as FluoroDish
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
Plastic pipette	Livingstone	PTP03-01
Polarizing microscope	Abrio	N/A