Esame della rigenerazione muscolare nei modelli zebrafish di malattia muscolare

Riepilogo

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata dalle cellule staminali muscolari residenti nei tessuti, che sono compromesse in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, e questo si traduce nell'incapacità del muscolo di rigenerarsi. Qui, descriviamo un protocollo che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Abstract

Il muscolo scheletrico ha una notevole capacità di rigenerarsi dopo una lesione, che è guidata da cellule staminali muscolari residenti nel tessuto obbligato. A seguito di lesioni, la cellula staminale muscolare viene attivata e subisce la proliferazione cellulare per generare un pool di mioblasti, che successivamente si differenziano per formare nuove fibre muscolari. In molte condizioni di deperimento muscolare, tra cui la distrofia muscolare e l'invecchiamento, questo processo è compromesso con conseguente incapacità del muscolo di rigenerarsi. Il processo di rigenerazione muscolare nel pesce zebra è altamente conservato con sistemi di mammiferi che forniscono un eccellente sistema per studiare la funzione e la rigenerazione delle cellule staminali muscolari, in condizioni di deperimento muscolare come la distrofia muscolare. Qui, presentiamo un metodo per esaminare la rigenerazione muscolare nei modelli di zebrafish di malattia muscolare. Il primo passo prevede l'utilizzo di una piattaforma di genotipizzazione che permette la determinazione del genotipo delle larve prima di suscitare una lesione. Dopo aver determinato il genotipo, il muscolo viene ferito usando una pugnalata con ago, a seguito della quale viene utilizzata la microscopia a luce polarizzante per determinare l'entità della rigenerazione muscolare. Forniamo quindi una pipeline ad alta produttività che consente l'esame della rigenerazione muscolare in modelli zebrafish di malattia muscolare.

Introduzione

Il muscolo scheletrico rappresenta il 30-50% della massa corporea umana e non è solo indispensabile per la locomozione, ma funge anche da organo metabolico e di stoccaggio critico¹. Nonostante sia postmitotico, il muscolo scheletrico è altamente dinamico e mantiene un'enorme capacità rigenerativa dopo l'infortunio. Ciò è attribuito alla presenza di cellule staminali residenti nei tessuti (chiamate anche cellule satelliti), situate sotto la lamina basale delle miofibre e contrassegnate dai fattori di trascrizione accoppiati box protein 7 (pax7) e / o paired box protein 3 (pax3), tra gli altri^2,3. A seguito di lesioni, la cellula satellite viene attivata e subisce la proliferazione cellulare per generare un pool di mioblasti, che successivamente si differenziano per formare nuove fibre muscolari. La cascata altamente conservata di segnali pro-rigenerativi che regolano l'attivazione delle cellule satelliti e la robusta riparazione muscolare è influenzata in varie condizioni come le miopatie e l'invecchiamento omeostatico^4,5.

Uno di questi diversi gruppi di miopatie è la distrofia muscolare, caratterizzata da progressivo deperimento muscolare e degenerazione⁶. Queste malattie sono la conseguenza di mutazioni genetiche in proteine chiave, tra cui distrofina e laminina-α2 (LAMA2), responsabili dell'attaccamento delle fibre muscolari alla matrice extracellulare^7,8. Dato che le proteine implicate nella distrofia muscolare svolgono un ruolo così centrale nel mantenimento della struttura muscolare, per molti anni si è creduto che un fallimento in questo processo fosse il meccanismo responsabile della patogenesi della malattia⁹. Tuttavia, studi recenti hanno identificato difetti nella regolazione delle cellule staminali muscolari e conseguente compromissione nella rigenerazione muscolare come seconda possibile base per la patologia muscolare osservata nella distrofia muscolare^10,11. Pertanto, sono necessari ulteriori studi per indagare su come una compromissione della funzione delle cellule staminali muscolari e degli elementi di nicchia associati contribuisca alla distrofia muscolare.

Negli ultimi dieci anni, il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un importante modello di vertebrati per la modellazione delle malattie¹². Ciò è attribuito al rapido sviluppo esterno dell'embrione di zebrafish, insieme alla sua chiarezza ottica, che consente la visualizzazione diretta della formazione, della crescita e della funzione muscolare. Inoltre, non solo lo sviluppo e la struttura del muscolo sono altamente conservati nel pesce zebra, ma mostrano anche un processo altamente conservato di rigenerazione muscolare¹³. Di conseguenza, i pesci zebra rappresentano un ottimo sistema per studiare la patobiologia delle malattie muscolari ed esplorare come la rigenerazione muscolare è influenzata in essa. A tal fine, abbiamo sviluppato un metodo che consente lo studio tempestivo della rigenerazione del muscolo scheletrico in modelli di zebrafish di malattia muscolare. Questa pipeline ad alto rendimento comporta un metodo per genotipizzare gli embrioni vivi¹⁴, a seguito del quale viene eseguita una lesione da pugnalata con ago e l'entità della rigenerazione muscolare viene cioè utilizzando la microscopia a luce polarizzante. L'utilizzo di questa tecnica rivelerà quindi la capacità rigenerativa del muscolo nei modelli di zebrafish di malattia muscolare.

Protocollo

La manutenzione del pesce zebra è stata effettuata secondo le procedure operative standard approvate dal Comitato etico degli animali dell'Università di Monash con licenza di colonia riproduttiva ERM14481.

1. Determinazione del genotipo degli embrioni vivi utilizzando una piattaforma di genotipizzazione degli embrioni.

1. Anestetizzare 3 giorni dopo la fecondazione (dpf) embrioni di zebrafish aggiungendo tricaina metanosolfonato ad una concentrazione finale dello 0,016% (v/v) in terreno embrionale (5 mM NaCl, 0,17mM KCl, 0,33 mM CaCl_2,0,33 mM MgSO₄ in acqua). Attendere 10 minuti per assicurarsi che i pesci siano completamente anestetizzati, evidente quando il pesce smette di nuotare.
2. Preparare il chip di estrazione del DNA a 24 camere staccando il film protettivo trasparente dalla superficie superiore del chip (Figura 1A).
3. Tagliare la punta di una punta filtrante da 20 μL per allargare l'apertura. Usando questo, scegli un singolo embrione in un volume di 13 μL di terreno embrionale e caricalo nella prima camera del chip. Ripeti questo processo fino a quando gli embrioni sono stati dispensati in ogni camera.
   NOTA: Questa fase deve essere eseguita in un'area con correnti d'aria minime, poiché un elevato flusso d'aria può causare un'eccessiva evaporazione del fluido con conseguente riduzione della sensibilità alla genotipizzazione e della sopravvivenza degli embrioni.
4. Una volta che il numero desiderato di embrioni è stato caricato sul chip di estrazione del DNA, caricalo sulla piattaforma di genotipizzazione degli embrioni di zebrafish. Questo si ottiene meglio posizionandosi prima in un lato, seguito dal resto.
   NOTA: evitare di aggiungere troppa pressione sulla piattaforma in quanto ciò potrebbe sovraccaricare e danneggiare le molle sottostanti.
5. Apporre il coperchio della piattaforma magnetica sul chip, che impedirà l'evaporazione dei mezzi embrionali durante il protocollo di estrazione del DNA, e chiudere il coperchio della piattaforma.
6. Impostare l'unità base a 2,4 volt, 0,051 A e 0,12 W e avviare il protocollo di estrazione del DNA premendo il pulsante "ON/OFF". La piattaforma dovrebbe iniziare a vibrare, che può essere valutata toccando delicatamente il coperchio. Il protocollo deve essere eseguito per 8 minuti.
   NOTA: La vibrazione vigorosa provoca lo spargimento di cellule epidermiche, da cui viene estratto il DNA genomico.
7. Mentre il programma è in esecuzione, preparare una piastra da 24 pozzetti aggiungendo 1 mL di terreno embrionale a ciascun pozzetti, che è necessario per separare i singoli embrioni mentre vengono eseguiti i test di genotipizzazione a valle.
8. Inoltre, etichettare in modo appropriato 8 tubi a strisce di pozzo, che verranno utilizzati per la raccolta di materiale di DNA da ciascun embrione.
9. Al completamento del protocollo di 8 minuti, premere il pulsante ON / OFF per interrompere la vibrazione della piattaforma.
10. Aprire il coperchio della piattaforma e rimuovere delicatamente il coperchio magnetico assicurando che venga applicata una pressione minima alla piattaforma.
11. Rimuovere con cura il chip di estrazione del DNA dalla piattaforma e posizionarlo su una superficie piana.
12. Dalla prima camera, rimuovere 10 μL di terreno embrionale che circonda l'embrione e posizionarlo nel pozzo appropriato del tubo a striscia a 8 pozzi. Il supporto contiene il materiale genetico di quell'embrione, che sarà utilizzato per i test a valle.
    NOTA: Evitare di toccare l'embrione con la punta della pipetta durante la raccolta dei media, in quanto ciò potrebbe danneggiare l'embrione.
13. Usando una pipetta di plastica, aggiungere immediatamente due gocce di terreno embrionale fresco nella stessa camera. Raccogli l'embrione e spostalo nel primo pozzo di una piastra di 24 pozzetti.
14. Ripetere i passaggi 1.12 e 1.13 per tutte le camere rimanenti. Al completamento di questo, la piastra a 24 pozzetti contenente embrioni vivi può essere spostata in un'incubatrice a 28 °C.
15. Eseguire appropriati test di genotipizzazione a valle per determinare il genotipo degli embrioni.
    NOTA: Il DNA ottenuto dalla piattaforma di genotipizzazione dell'embrione può essere amplificato con successo mediante PCR e può essere utilizzato per analisi successive tra cui sequenziamento, elettroforesi su gel o analisi di fusione ad alta risoluzione¹⁴. Per genotipizzare il ceppo lama2 descritto nei risultati rappresentativi, sono stati utilizzati PCR, digestione di restrizione ed elettroforesi su gel. Dato che la concentrazione di DNA ottenuto da ciascun embrione è bassa, si suggerisce di utilizzare la maggior parte, se non tutto, del materiale genetico ottenuto per il test a valle.
16. Una volta identificato il genotipo di ciascuna larva, trasferirle in piastre di Petri da 90 mm, collocando ogni genotipo in un piatto diverso. Riempire il piatto con 25 ml di terreno embrionale e conservarli nell'incubatrice a 28 °C.

2. Esecuzione di lesioni muscolari utilizzando una pugnalata con ago

1. Una volta che le larve sono 4 dpf, anestetizzarle aggiungendo tricaina metanosolfonato ad una concentrazione finale dello 0,016% (v/v) nel mezzo embrionale. Attendere 10 minuti per assicurarsi che i pesci siano completamente anestetizzati, evidente quando il pesce smette di nuotare.
   NOTA: Per evitare pregiudizi, l'identità del genotipo deve essere accecata allo sperimentatore che esegue le pugnalate e le analisi a valle.
2. Durante questo periodo, preparare 24 piastre di pozzetti riempiendo ogni pozzetti con 1 mL di mezzo embrionale fresco e impostare lo stereomicroscopio con uno sfondo nero e una luce ad alta potenza, per facilitare la visualizzazione dei bordi somiti.
3. Usando una pipetta di plastica, trasferire una larva anestetizzata in una nuova capsula di Petri.
4. Rimuovere con cura il mezzo embrionale in eccesso con una pipetta e, al microscopio di dissezione, orientare il pesce in modo tale che la testa sia a sinistra, la coda a destra, la regione dorsale verso l'alto e la regione ventrale verso il basso (Figura 1B).
5. Lavorando sotto un microscopio di dissezione, utilizzare un ago calibro 30 per eseguire una pugnalata rapida ma precisa nel muscolo epaxiale situato sopra il miosetto orizzontale. Per garantire la coerenza in posizione anteriore-posteriore, mirare a 1-2 somiti situati sopra il poro anale (Figura 1B).
   NOTA: Evitare di pugnalare il tubo neurale e notochord e lavorare rapidamente per evitare l'essiccazione del pesce durante il processo.
6. Usando una pipetta di plastica, versare una goccia di mezzo embrionale sul pesce zebra pugnalato e trasferirlo con cura in un pozzettino della piastra a 24 pozzetti.
7. Ripetere i passaggi da 2.3 a 2.6. fino a quando tutti i pesci sono stati pugnalati.
   NOTA: Diverse larve possono essere pugnalate insieme a seconda della velocità di lavorazione e della competenza dello sperimentatore, purché il pesce non si asciughi durante il processo.
8. Una volta che tutte le larve sono state pugnalate, posizionare la piastra a 24 pozzetti nell'incubatrice a 28 °C fino a quando non viene eseguita l'imaging successivo.

3. Imaging della lesione muscolare e recupero

1. A 1 giorno dopo l'infortunio (1 dpi), anestetizzare le larve pugnalate aggiungendo tricaina metanosolfonato ad una concentrazione finale dello 0,016% (v/v) nel mezzo embrionale. Attendere 10 minuti per assicurarsi che i pesci siano completamente anestetizzati, evidente quando il pesce smette di nuotare.
   NOTA: a 0 dpi, il sito della ferita contiene una grande quantità di detriti cellulari, il che rende difficile quantificare l'entità della lesione muscolare (Figura supplementare 1A-B). Ci vogliono circa 18-20 ore perché questi detriti vengano eliminati dal sito della ferita, e come tale è più affidabile immaginare le larve a 1 dpi, piuttosto che a 0 dpi, per determinare l'entità della lesione provocata.
2. Posizionare un piatto a base di fondo di vetro pulito e vuoto sul palco del microscopio polarizzatore e impostare lo sfondo utilizzando il software integrato.
   NOTA: non utilizzare piastre di Petri di plastica per l'immagine della birifrangenza, in quanto non trasmettono in modo appropriato la luce rifratta. A seconda del microscopio polarizzato utilizzato, potrebbero essere necessarie impostazioni aggiuntive secondo le linee guida del produttore.
3. Dopo aver impostato lo sfondo, rimuovere il piatto a base di fondo di vetro dallo stadio del microscopio e utilizzando una pipetta di vetro, trasferire il pesce anestetizzato e pugnalato sul piatto a base di fondo di vetro.
4. Rimuovere con attenzione l'eccesso di terreno embrionale usando una pipetta e orientare il pesce come da 2,5 - la testa è a sinistra, la coda a destra, la regione dorsale verso l'alto e la regione ventrale verso il basso.
   NOTA: Assicurarsi che le larve siano montate nel modo più piatto possibile, poiché il montaggio irregolare si traduce in diverse intensità di birifrangenza tra diversi somiti.
5. Posizionare il piatto a base di fondo di vetro con le larve anestetizzate sullo stadio del microscopio e immaginare il muscolo usando la luce polarizzata (Figure 1C e 1D).
   NOTA: A seconda del tipo di microscopio/lente polarizzata utilizzata, l'orientamento del pesce sul suo asse anteriore-posteriore può influenzare la birifrangenza complessiva¹⁵. Assicurarsi di includere almeno 5 somiti su entrambi i lati del sito della lesione durante l'imaging.
6. Usando una pipetta di plastica, versare una goccia di mezzo embrionale per reidratare il pesce e posizionare il pesce in un pozzo di un piatto di 24 pozzetti riempito con mezzo embrionale.
   NOTA: è importante eseguire l'imaging il più rapidamente possibile per evitare che il pesce si secchi.
7. Ripetere i passaggi 3.3. al 3.6. fino a quando tutti i pesci non sono stati ripresi.
8. Quando tutte le immagini sono state acquisite, salvarle in formato .tiff per le analisi successive.
9. Rimettere il pesce nell'incubatrice a 28 °C fino a eseguire l'imaging successivo a 3 dpi (7 dpf).
10. Quando i pesci sono 3 dpi, immagina il pesce come da 3,3 a 3,8.
11. Una volta che tutti i pesci sono stati ripresi, eutanasalizzarli aggiungendo tricaina metanosolfonato a una concentrazione finale dello 0,2% (v / v) nel mezzo embrionale. Attendere almeno 10 minuti per assicurarsi che i pesci siano sottoposti a eutanasia, evidente dalla perdita della capacità di nuoto, dal pompaggio delle coperture branchiali e dalla mancanza di una risposta di volo dopo il tocco.

4. Quantificazione della rigenerazione muscolare

1. Aprire un'immagine da 1 dpi su un software di analisi di imaging come il software Image J disponibile gratuitamente.
2. Utilizzando lo strumento poligono, disegnare attorno al sito della ferita e misurare l'area e l'intensità media di birifrangenza di questa regione (Figure 1C e 1D). Copiare questi valori nelle celle D3 ed E3 nel modello fornito (Tabella supplementare 1).
3. Disegna due regioni aggiuntive, ciascuna delle quali copre 1-2 somiti illesi, e misura l'area e le intensità medie di birifrangenza di ciascuna di queste regioni (Figure 1C e 1D). Copiare questi valori nelle celle D4-D5 ed E4-E5 nel modello fornito (Tabella supplementare 1).
   NOTA: Mentre è preferibile selezionare gli stessi somiti illesi nelle immagini da 1 dpi e 3 dpi, il distacco sporadico delle fibre muscolari e la successiva riduzione della birifrangenza nei mutanti possono renderlo impossibile. Pertanto, nel caso in cui gli stessi somiti non possano essere selezionati a 1 dpi e 3 dpi a causa della riduzione dell'integrità muscolare nei mutanti, selezionare due aree diverse ma non interessate in ciascuno dei timepoint.
4. Calcolare la birifrangenza normalizzata per ciascuna regione dividendo l'intensità media di birifrangenza di quella regione per l'area - visualizzata nella colonna F del modello fornito (Tabella supplementare 1).
5. Ripetere i passaggi da 4.1 a 4.4 per tutte le immagini da 1 dpi e 3 dpi.
   NOTA: quando si utilizza il modello fornito (Tabella supplementare 1), i valori di area di 1 dpi e di intensità di birifrangenza media devono essere inseriti rispettivamente nelle colonne D ed E e i valori di area di 3 dpi e di intensità media di birifrangenza devono essere inseriti rispettivamente nelle colonne J e K.
6. Per ogni punto temporale, calcolare la birifrangenza media normalizzata delle due regioni illese. Questo valore fornisce un punto di riferimento del muscolo non leso.
   NOTA: nel modello fornito (Tabella supplementare 1), questo valore viene calcolato nelle colonne G e M, rispettivamente per le immagini da 1 dpi e 3 dpi.
7. Successivamente, determinare l'entità della lesione muscolare a 1 dpi, dividendo la birifrangenza normalizzata della regione della lesione per la birifrangenza media normalizzata delle regioni non lesionate (calcolata in 4.6).
   NOTA: utilizzando la procedura di pugnalata dell'ago sopra dettagliata, le larve wildtype mostrano in genere una birifrangenza normalizzata del 48,5 ± del 14,3% nel sito della ferita a 1 dpi, indicando che la birifrangenza si è ridotta di circa il 50% rispetto ai somiti non lesi. Quando si utilizza il modello (Tabella supplementare 1), questo valore viene calcolato in percentuale nella colonna H.
8. Per determinare l'estensione della rigenerazione muscolare, dividere la birifrangenza normalizzata della regione della lesione nell'immagine a 3 dpi, per l'intensità media normalizzata delle regioni non ferite in questa fase.
   NOTA: a 3 dpi, le larve wildtype mostrano tipicamente una birifrangenza normalizzata di 60 ± 15,3% nel sito della ferita. Dato che la birifrangenza normalizzata all'interno del sito della ferita a 1 dpi è stata del 48,5± 14,3% (fase 4,7), l'aumento della birifrangenza a 3 dpi a 60 ± il 15,3% indica un recupero di circa l'11,5%. Quando si utilizza il modello (Tabella supplementare 1), questo valore viene calcolato in percentuale nella colonna N.
9. Mantenendo separati i pesci all'interno di ciascun genotipo, eseguire un t-test accoppiato confrontando la birifrangenza normalizzata del sito della ferita a 3 dpi (passo 4.8) con quella di 1 dpi (passo 4.7). Ciò rivelerà la traiettoria di rigenerazione muscolare mostrata da ciascun pesce in ciascun genotipo ed evidenzierà se l'estensione della rigenerazione muscolare mostrata da ciascun genotipo è significativamente cambiata.
10. Infine, calcola l'indice rigenerativo dividendo il valore ottenuto nel passaggio 4.8, che è l'estensione della rigenerazione muscolare a 3 dpi, per il valore ottenuto nel passaggio 4.7, che è l'entità della lesione muscolare a 1 dpi. Un indice rigenerativo di 1 indica che la lesione a 1 dpi è paragonabile a 3 dpi e che la rigenerazione muscolare non si è verificata; un valore superiore a 1 indica che a 3 dpi si è formato un nuovo muscolo nel sito della ferita evidenziando che il muscolo si è rigenerato; e un indice rigenerativo inferiore a 1 evidenzia che la ferita a 3 dpi è peggiore di 1 dpi e che la rigenerazione muscolare è compromessa. Un t-test o un ANOVA uninozionale può essere eseguito per confrontare statisticamente l'entità della rigenerazione muscolare tra i diversi genotipi. Quando si utilizza il modello fornito (Tabella supplementare 1), questo valore viene calcolato nella colonna O.
    NOTA: Si raccomanda di eseguire l'intero esperimento in triplice copia, con pesci di ogni esperimento ottenuti da diversi genitori biologici e ogni esperimento eseguito in giorni diversi, per evitare qualsiasi pregiudizio.

Risultati

La capacità di quantificare la birifrangenza del muscolo scheletrico fornisce un metodo non invasivo ma altamente riproducibile per esaminare e confrontare i livelli di danno muscolare ed esaminare la rigenerazione muscolare in vivo. La birifrangenza deriva dalla diffrazione della luce polarizzata attraverso l'array pseudo-cristallino dei sarcomeri muscolari¹⁵e, a seguito di lesioni o danni al muscolo, è evidente una riduzione della birifrangenza. Allo s...

Discussione

La rigenerazione del muscolo scheletrico è guidata da cellule staminali muscolari residenti nel tessuto obbligato, la cui funzione è alterata in molte malattie muscolari come la distrofia muscolare, ostacolando successivamente il processo di rigenerazione muscolare. Qui, descriviamo un protocollo ad alto rendimento per esaminare la rigenerazione muscolare in modelli di zebrafish vivi di malattia muscolare. Il primo passo della pipeline utilizza una piattaforma di genotipizzazione degli embrioni¹⁴

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Thermo Fischer	142475
30 gauge needles	Terumo	NN-3013R
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products PT	S9014S20
DNA extraction chips	wFluidx	ZEG chips
Embryo genotyping platform	wFluidx	ZEG base unit	Zebrafish Embryo Genotyper
Glass pipette	Hirschmann	9260101
Glass plate dish	WPI	FD35-100	Commonly referred to as FluoroDish
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
Plastic pipette	Livingstone	PTP03-01
Polarizing microscope	Abrio	N/A