Examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson-zèbre de maladie musculaire

Résumé

La régénération des muscles squelettiques est entraînée par les cellules souches musculaires résidentes des tissus, qui sont altérées dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Ici, nous décrivons un protocole qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire.

Résumé

Le muscle squelettique a une capacité remarquable à se régénérer après une blessure, qui est entraînée par des cellules souches musculaires résidentes dans les tissus obligatoires. Après une blessure, la cellule souche musculaire est activée et subit une prolifération cellulaire pour générer un pool de myoblastes, qui se différencient ensuite pour former de nouvelles fibres musculaires. Dans de nombreuses conditions d’atrophie musculaire, y compris la dystrophie musculaire et le vieillissement, ce processus est altéré, ce qui entraîne l’incapacité du muscle à se régénérer. Le processus de régénération musculaire chez le poisson-zèbre est hautement conservé avec des systèmes mammifères fournissant un excellent système pour étudier la fonction et la régénération des cellules souches musculaires, dans des conditions d’atrophie musculaire telles que la dystrophie musculaire. Ici, nous présentons une méthode pour examiner la régénération musculaire dans les modèles de poisson zèbre de la maladie musculaire. La première étape consiste à utiliser une plateforme de génotypage qui permet de déterminer le génotype des larves avant de provoquer une blessure. Après avoir déterminé le génotype, le muscle est blessé à l’aide d’un coup de couteau à aiguille, après quoi la microscopie à lumière polarisante est utilisée pour déterminer l’étendue de la régénération musculaire. Nous fournissons donc un pipeline à haut débit qui permet l’examen de la régénération musculaire dans les modèles de maladie musculaire du poisson-zèbre.

Introduction

Le muscle squelettique représente 30 à 50% de la masse corporelle humaine et est non seulement indispensable à la locomotion, mais il sert également d’organe métabolique et de stockage critique¹. Bien qu’il soit postmitotique, le muscle squelettique est très dynamique et conserve une énorme capacité de régénération après une blessure. Ceci est attribué à la présence de cellules souches résidentes tissulaires (également appelées cellules satellites), situées sous la lame basale des myofibres et marquées par les facteurs de transcription appariés boîte protéine 7 (pax7) et / ou protéine boîte appariée 3 (pax3), entre autres^2,3. Après une blessure, la cellule satellite est activée et subit une prolifération cellulaire pour générer un pool de myoblastes, qui se différencient ensuite pour former de nouvelles fibres musculaires. La cascade hautement conservée de signaux pro-régénératifs régulant l’activation des cellules satellites et la réparation musculaire robuste est affectée dans diverses conditions telles que les myopathies et le vieillissement homéostatique^4,5.

L’un de ces groupes diversifiés de myopathies est la dystrophie musculaire, caractérisée par une atrophie musculaire progressive et une dégénérescence⁶. Ces maladies sont la conséquence de mutations génétiques dans des protéines clés, dont la dystrophine et la laminine-α2 (LAMA2), responsables de la fixation des fibres musculaires à la matrice extracellulaire^7,8. Étant donné que les protéines impliquées dans la dystrophie musculaire jouent un rôle central dans le maintien de la structure musculaire, on a cru pendant de nombreuses années qu’un échec de ce processus était le mécanisme responsable de la pathogenèse de la maladie⁹. Cependant, des études récentes ont identifié des défauts dans la régulation des cellules souches musculaires et une altération ultérieure de la régénération musculaire comme deuxième base possible pour la pathologie musculaire observée dans la dystrophie musculaire^10,11. En tant que tel, d’autres études sont nécessaires pour étudier comment une altération de la fonction des cellules souches musculaires et des éléments de niche associés contribue à la dystrophie musculaire.

Au cours de la dernière décennie, le poisson-zèbre(Danio rerio)est devenu un modèle important de vertébrés pour la modélisation des maladies^12. Ceci est attribué au développement externe rapide de l’embryon de poisson zèbre, associé à sa clarté optique, qui permet la visualisation directe de la formation, de la croissance et de la fonction musculaires. De plus, non seulement le développement et la structure des muscles sont hautement conservés chez le poisson-zèbre, mais ils présentent également un processus de régénération musculaire hautement conservé¹³. Par conséquent, le poisson-zèbre représente un excellent système pour étudier la pathobiologie des maladies musculaires et explorer comment la régénération musculaire y est affectée. À cette fin, nous avons développé une méthode qui permet l’étude opportune de la régénération musculaire squelettique dans les modèles de maladie musculaire du poisson-zèbre. Ce pipeline à haut débit implique une méthode de génotype d’embryons vivants¹⁴, à la suite de laquelle une blessure à l’aiguille est effectuée et l’étendue de la régénération musculaire est imagée à l’aide de la microscopie à lumière polarisante. L’utilisation de cette technique révélera donc la capacité de régénération du muscle dans les modèles de maladie musculaire du poisson-zèbre.

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Protocole

L’entretien du poisson-zèbre a été effectué conformément aux procédures d’exploitation normalisées approuvées par le Comité d’éthique animale de l’Université Monash en vertu de la licence de colonie de reproduction ERM14481.

1. Détermination du génotype d’embryons vivants à l’aide d’une plateforme de génotypage d’embryons.

1. Anesthésier 3 jours après la fécondation (dpf) des embryons de poisson zèbre en ajoutant du méthanesulfonate de tricaïne à une concentration finale de 0,016 % (v/v) dans un milieu embryonnaire (5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl_2,0,33 mM MgSO₄ dans l’eau). Attendez 10 minutes pour vous assurer que les poissons sont complètement anesthésésés, ce qui est évident lorsque les poissons cessent de nager.
2. Préparez la puce d’extraction d’ADN à 24 chambres en pelant le film protecteur transparent de la surface supérieure de la puce (Figure 1A).
3. Coupez l’extrémité d’une pointe de filtre de 20 μL pour élargir l’ouverture. En utilisant cela, choisissez un seul embryon dans un volume de 13 μL de milieu embryonnaire et chargez-le dans la première chambre de la puce. Répétez ce processus jusqu’à ce que les embryons aient été distribués dans chaque chambre.
   REMARQUE: Cette étape doit être effectuée dans une zone avec des courants d’air minimaux, car un débit d’air élevé peut provoquer une évaporation excessive du fluide entraînant par la suite une réduction de la sensibilité au génotypage et de la survie des embryons.
4. Une fois que le nombre souhaité d’embryons a été chargé sur la puce d’extraction d’ADN, chargez-la sur la plate-forme de génotypage d’embryons de poisson zèbre. Ceci est mieux réalisé en plaçant d’abord d’un côté, suivi du reste.
   REMARQUE: Évitez d’ajouter trop de pression sur la plate-forme, car cela pourrait troptrer et endommager les ressorts sous-jacents.
5. Apposez le couvercle de la plate-forme magnétique sur la puce, ce qui empêchera l’évaporation des milieux embryonnaires pendant le protocole d’extraction de l’ADN, et fermez le couvercle de la plate-forme.
6. Réglez l’unité de base sur 2,4 volts, 0,051 A et 0,12 W et démarrez le protocole d’extraction d’ADN en appuyant sur le bouton « ON / OFF ». La plate-forme doit commencer à vibrer, ce qui peut être évalué en touchant doucement le couvercle. Le protocole doit être exécuté pendant 8 minutes.
   REMARQUE: La vibration vigoureuse entraîne l’excrétion des cellules épidermiques, à partir desquelles l’ADN génomique est extrait.
7. Pendant que le programme est en cours, préparez une plaque de 24 puits en ajoutant 1 mL de milieu embryonnaire à chaque puits, ce qui est nécessaire pour séparer les embryons individuels pendant que des tests de génotypage en aval sont effectués.
8. De plus, étiquetez de manière appropriée 8 tubes à bande de puits, qui seront utilisés pour la collecte de matériel ADN de chaque embryon.
9. À la fin du protocole de 8 minutes, appuyez sur le bouton ON/OFF pour arrêter les vibrations de la plate-forme.
10. Ouvrez le couvercle de la plate-forme et retirez doucement le couvercle magnétique en veillant à ce qu’une pression minimale soit appliquée à la plate-forme.
11. Retirez soigneusement la puce d’extraction d’ADN de la plate-forme et placez-la sur une surface plane.
12. De la première chambre, retirez 10 μL de milieux embryonnaires entourant l’embryon et placez-le dans le puits approprié du tube à bande de 8 puits. Le milieu contient le matériel génétique de cet embryon, qui sera utilisé pour les essais en aval.
    REMARQUE: Évitez de toucher l’embryon avec la pointe de la pipette pendant la collecte du média, car cela pourrait endommager l’embryon.
13. À l’aide d’une pipette en plastique, ajoutez immédiatement deux gouttes de milieu embryonnaire frais dans la même chambre. Recueillez l’embryon et déplacez-le vers le premier puits d’une plaque de 24 puits.
14. Répétez les étapes 1.12 et 1.13 pour toutes les chambres restantes. À la fin de cette opération, la plaque de 24 puits contenant des embryons vivants peut être déplacée vers un incubateur à 28 °C.
15. Effectuer des tests de génotypage en aval appropriés pour déterminer le génotype des embryons.
    REMARQUE: L’ADN obtenu à partir de la plate-forme de génotypage embryonnaire peut être amplifié avec succès par PCR et peut être utilisé pour une analyse ultérieure, y compris le séquençage, l’électrophorèse sur gel ou l’analyse de fusion à haute résolution¹⁴. Pour génotyper la souche lama2 décrite dans les résultats représentatifs, la PCR, la digestion de restriction et l’électrophorèse sur gel ont été utilisées. Étant donné que la concentration d’ADN obtenue à partir de chaque embryon est faible, il est suggéré d’utiliser la plupart, sinon la totalité, du matériel génétique obtenu pour le test en aval.
16. Une fois que le génotype de chaque larve a été identifié, transférez-les dans des boîtes de Petri de 90 mm, en plaçant chaque génotype dans un plat différent. Remplissez le plat avec 25 mL de milieu embryonnaire et conservez-le dans l’incubateur à 28 °C.

2. Effectuer une blessure musculaire à l’aide d’un coup de couteau à l’aiguille

1. Une fois que les larves ont 4 dpf, anesthésiez-les en ajoutant du méthanesulfonate de tricaïne à une concentration finale de 0,016% (v / v) dans le milieu embryonnaire. Attendez 10 minutes pour vous assurer que les poissons sont complètement anesthésésés, ce qui est évident lorsque les poissons cessent de nager.
   REMARQUE: Pour éviter tout biais, l’identité du génotype doit être aveuglée par l’investigateur effectuant les coups de couteau et les analyses en aval.
2. Pendant ce temps, préparez 24 plaques de puits en remplissant chaque puits avec 1 mL de milieu embryonnaire frais et installez le stéréomicroscope avec un fond noir et une lumière de haute puissance, pour faciliter la visualisation des bordures de somite.
3. À l’aide d’une pipette en plastique, transférez une larve anesthésiée dans une nouvelle boîte de Pétri.
4. Retirez soigneusement l’excès de milieu embryonnaire à l’avec une pipette et, sous un microscope à dissection, orientez le poisson de manière à ce que la tête soit à gauche, la queue à droite, la région dorsale vers le haut et la région ventrale vers le bas(Figure 1B).
5. En travaillant sous un microscope à dissection, utilisez une aiguille de calibre 30 pour effectuer un coup de couteau rapide mais précis dans le muscle époxyde situé au-dessus du myoseptum horizontal. Pour assurer la cohérence en position antérieure-postérieure, visez 1-2 somites situés au-dessus du pore anal (Figure 1B).
   REMARQUE: Évitez de poignarder le tube neural et la notochorde, et travaillez rapidement pour éviter le séchage du poisson pendant le processus.
6. À l’aide d’une pipette en plastique, versez une goutte de milieu embryonnaire sur le poisson-zèbre poignardé et transférez-la soigneusement dans un puits de la plaque de 24 puits.
7. Répétez les étapes 2.3 à 2.6. jusqu’à ce que tous les poissons aient été poignardés.
   REMARQUE: Plusieurs larves peuvent être poignardées ensemble en fonction de la vitesse de traitement et des compétences de l’enquêteur, tant que les poissons ne sèchent pas pendant le processus.
8. Une fois que toutes les larves ont été poignardées, placez la plaque de 24 puits dans l’incubateur à 28 °C jusqu’à ce que l’imagerie ultérieure soit effectuée.

3. Imagerie de la blessure musculaire et récupération

1. 1 jour après la blessure (1 dpi), anesthésier les larves poignardées en ajoutant du méthanesulfonate de tricaïne à une concentration finale de 0,016 % (v/v) dans le milieu embryonnaire. Attendez 10 minutes pour vous assurer que les poissons sont complètement anesthésésés, ce qui est évident lorsque les poissons cessent de nager.
   REMARQUE: À 0 dpi, le site de la plaie contient une grande quantité de débris cellulaires, ce qui rend difficile la quantification de l’étendue de la lésion musculaire (Figure supplémentaire 1A-B). Il faut environ 18 à 20 heures pour que ces débris soient éliminés du site de la plaie et, en tant que tels, il est plus fiable d’imager les larves à 1 dpi, plutôt qu’à 0 dpi, pour déterminer l’étendue des blessures provoquées.
2. Placez un fond en verre propre et vide sur la scène du microscope polarisant et réglez l’arrière-plan à l’aide du logiciel intégré.
   REMARQUE: N’utilisez pas de boîtes de Petri en plastique pour imager la biréfringence, car elles ne transmettent pas correctement la lumière réfractée. Selon le microscope polarisé utilisé, des réglages supplémentaires peuvent être nécessaires conformément aux directives du fabricant.
3. Après avoir réglé l’arrière-plan, retirez le plat à base de fond de verre de l’étage du microscope et, à l’aide d’une pipette en verre, transférez le poisson anesthésié et poignardé sur le plat à fond en verre.
4. Retirez soigneusement l’excès de milieu embryonnaire à l’aide d’une pipette et orientez le poisson selon 2,5 - la tête est à gauche, la queue à droite, la région dorsale vers le haut et la région ventrale vers le bas.
   REMARQUE: Assurez-vous que les larves sont montées aussi plates que possible, car un montage inégal entraîne différentes intensités de biréfringence entre différentes somites.
5. Placez le plat à fond de verre avec les larves anesthésiées sur la scène du microscope et imagez le muscle à l’aide d’une lumière polarisée(figures 1C et 1D).
   REMARQUE: Selon le type de microscope / lentille polarisée utilisé, l’orientation du poisson sur son axe antérieur-postérieur peut affecter la biréfringence globale¹⁵. Assurez-vous d’inclure au moins 5 somites de chaque côté du site de la blessure lors de l’imagerie.
6. À l’aide d’une pipette en plastique, versez une goutte de milieu embryonnaire pour réhydrater le poisson et placez le poisson dans un puits d’une plaque de 24 puits remplie de milieu embryonnaire.
   REMARQUE: Il est important d’effectuer l’imagerie le plus rapidement possible pour empêcher le poisson de sécher.
7. Répétez les étapes 3.3. à 3.6. jusqu’à ce que tous les poissons aient été imagés.
8. Lorsque toutes les images ont été acquises, enregistrez-les dans .tiff format pour des analyses ultérieures.
9. Remettre le poisson dans l’incubateur à 28 °C jusqu’à ce qu’il effectue une imagerie ultérieure à 3 dpi (7 dpf).
10. Lorsque les poissons ont 3 dpi, imaginez le poisson selon 3,3 à 3,8.
11. Une fois que tous les poissons ont été imagés, euthanasiez-les en ajoutant du méthanesulfonate de tricaïne à une concentration finale de 0,2 % (v/v) dans le milieu embryonnaire. Attendez au moins 10 minutes pour vous assurer que les poissons sont euthanasiés, comme en témoignent la perte de capacité de nage, le pompage des couvertures branchiales et l’absence de réponse de vol après le toucher.

4. Quantification de la régénération musculaire

1. Ouvrez une image de 1 dpi sur un logiciel d’analyse d’imagerie tel que le logiciel Image J disponible gratuitement.
2. À l’aide de l’outil polygone, dessinez autour du site de la plaie et mesurez l’aire et l’intensité moyenne de biréfringence de cette région(figures 1C et 1D). Copiez ces valeurs dans les cellules D3 et E3 du modèle fourni (Tableau supplémentaire 1).
3. Dessinez deux régions supplémentaires, chacune couvrant 1 à 2 somites non blessées, et mesurez la superficie et les intensités moyennes de biréfringence de chacune de ces régions (Figures 1C & 1D). Copiez ces valeurs dans les cellules D4-D5 et E4-E5 du modèle fourni (Tableau supplémentaire 1).
   REMARQUE: Bien qu’il soit préférable de sélectionner les mêmes somites non blessées dans les images de 1 dpi et 3 dpi, le détachement sporadique des fibres musculaires et la réduction subséquente de la biréfringence chez les mutants peuvent rendre cela impossible. Par conséquent, dans le cas où les mêmes somites ne peuvent pas être sélectionnées à 1 dpi et 3 dpi en raison de la réduction de l’intégrité musculaire chez les mutants, sélectionnez deux zones différentes mais non affectées à chacun des points temporels.
4. Calculer la biréfringence normalisée pour chaque région en divisant l’intensité moyenne de biréfringence de cette région par la zone - affichée dans la colonne F du modèle fourni (Tableau supplémentaire 1).
5. Répétez les étapes 4.1 à 4.4 pour toutes les images 1 dpi et 3 dpi.
   REMARQUE: Lors de l’utilisation du modèle fourni (Tableau supplémentaire 1), les valeurs d’intensité de biréfringence moyenne et de surface de biréfringence moyenne de 1 dpi doivent être insérées dans les colonnes D et E respectivement, et les valeurs d’intensité de biréfringence moyenne de 3 dpi et d’intensité de biréfringence moyenne doivent être insérées dans les colonnes J et K respectivement.
6. Pour chaque point temporel, calculez la biréfringence normalisée moyenne des deux régions non blessées. Cette valeur fournit un point de référence pour un muscle non blessé.
   REMARQUE: Dans le modèle fourni (Tableau supplémentaire 1), cette valeur est calculée dans les colonnes G et M, pour les images 1 dpi et 3 dpi respectivement.
7. Ensuite, déterminez l’étendue de la lésion musculaire à 1 dpi, en divisant la biréfringence normalisée de la région de la blessure par la biréfringence normalisée moyenne des régions non blessées (calculée en 4,6).
   REMARQUE: En utilisant la procédure détaillée de poignard à l’aiguille ci-dessus, les larves de type sauvage présentent généralement une biréfringence normalisée de 48,5 ± 14,3% au site de la plaie à 1 dpi, ce qui indique que la biréfringence a diminué d’environ 50% par rapport aux somites non blessées. Lors de l’utilisation du modèle (Tableau supplémentaire 1), cette valeur est calculée en pourcentage dans la colonne H.
8. Pour déterminer l’étendue de la régénération musculaire, divisez la biréfringence normalisée de la région de la blessure dans l’image de 3 dpi, par l’intensité normalisée moyenne des régions non blessées à ce stade.
   REMARQUE: À 3 dpi, les larves de type sauvage présentent généralement une biréfringence normalisée de 60 ± 15,3% au site de la plaie. Étant donné que la biréfringence normalisée à l’intérieur du site de la plaie à 1 dpi était de 48,5 ± 14,3 % (étape 4,7), l’augmentation de la biréfringence à 3 dpi à 60 ± 15,3 % indique une récupération d’environ 11,5 %. Lors de l’utilisation du modèle (Tableau supplémentaire 1), cette valeur est calculée en pourcentage dans la colonne N.
9. En gardant les poissons dans chaque génotype séparés, effectuez un test t apparié comparant la biréfringence normalisée du site de la plaie à 3 dpi (étape 4.8) avec celle de 1 dpi (étape 4.7). Cela révélera la trajectoire de régénération musculaire affichée par chaque poisson dans chaque génotype, et mettra en évidence si l’étendue de la régénération musculaire affichée par chaque génotype a considérablement changé.
10. Enfin, calculez l’indice de régénération en divisant la valeur obtenue à l’étape 4.8, qui est l’étendue de la régénération musculaire à 3 dpi, par la valeur obtenue à l’étape 4.7, qui est l’étendue de la lésion musculaire à 1 dpi. Un indice de régénération de 1 indique que la blessure à 1 dpi est comparable à 3 dpi et que la régénération musculaire ne s’est pas produite; une valeur supérieure à 1 indique qu’à 3 dpi, un nouveau muscle s’est formé dans le site de la plaie, ce qui souligne que le muscle s’est régénéré; et un indice de régénération inférieur à 1 met en évidence que la plaie à 3 dpi est pire que 1 dpi, et que la régénération musculaire est altérée. Un test t ou une ANOVA unidirectionnelle peut être effectué pour comparer statistiquement l’étendue de la régénération musculaire entre les différents génotypes. Lorsque vous utilisez le modèle fourni (Tableau supplémentaire 1), cette valeur est calculée dans la colonne O.
    REMARQUE: Il est recommandé d’effectuer toute l’expérience en trois exemplaires, avec des poissons de chaque expérience obtenus de parents biologiques différents, et chaque expérience réalisée à des jours différents, pour éviter tout biais.

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Résultats

La capacité de quantifier la biréfringence du muscle squelettique fournit une méthode non invasive mais hautement reproductible pour examiner et comparer les niveaux de lésions musculaires, et examiner la régénération musculaire in vivo. La biréfringence résulte de la diffraction de la lumière polarisée à travers le réseau pseudo-cristallin des sarcomères musculaires¹⁵, et suite à une blessure ou à une lésion du muscle, une réduction de l...

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Discussion

La régénération des muscles squelettiques est entraînée par des cellules souches musculaires résidentes des tissus obligatoires, dont la fonction est altérée dans de nombreuses maladies musculaires telles que la dystrophie musculaire, entravant par la suite le processus de régénération musculaire. Ici, nous décrivons un protocole à haut débit pour examiner la régénération musculaire dans des modèles vivants de poisson zèbre de maladie musculaire. La première étape du pipeline utilise une plate-forme ...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 well plates	Thermo Fischer	142475
30 gauge needles	Terumo	NN-3013R
90 mm Petri Dishes	Pacific Laboratory Products PT	S9014S20
DNA extraction chips	wFluidx	ZEG chips
Embryo genotyping platform	wFluidx	ZEG base unit	Zebrafish Embryo Genotyper
Glass pipette	Hirschmann	9260101
Glass plate dish	WPI	FD35-100	Commonly referred to as FluoroDish
Incubator	Thermoline Scientific	TEI-43L
Plastic pipette	Livingstone	PTP03-01
Polarizing microscope	Abrio	N/A