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この記事について

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要約

このアッセイは、3Dコラーゲンゲルで培養した胚様体に分化したマウス胚性幹細胞を利用して、 in vitroで発芽血管新生を制御する生物学的プロセスを解析します。この技術は、薬物の検査、疾患のモデリング、および胚的に致命的な欠失の文脈での特定の遺伝子の研究に適用できます。

要約

人工多能性幹細胞(iPSC)および遺伝子編集技術の最近の進歩により、表現型創薬(PDD)プログラムのための新しいヒト細胞ベースの疾患モデルの開発が可能になりました。これらの新しいデバイスは、ヒトにおける治験薬の安全性と有効性をより正確に予測することができますが、臨床への開発は依然として哺乳類のデータ、特にマウス疾患モデルの使用に強く依存しています。したがって、ヒトオルガノイドまたは臓器オンチップ疾患モデルと並行して、関連するin vitroマウスモデルの開発は、種間およびin vivoおよびin vitro条件との間の直接的な薬効および安全性比較を評価するための満たされていないニーズです。 ここでは、胚様体(EB)に分化させたマウス胚性幹細胞を利用する血管発芽アッセイについて説明する。3Dコラーゲンゲル上で培養された血管新生EBは、発芽血管新生と呼ばれるプロセスである拡張する新しい血管を発達させます。このモデルは、内皮先端細胞の選択、内皮細胞の移動と増殖、細胞誘導、管形成、壁細胞動員など、既存の血管網からの血管の形成であるin vivo発芽血管新生の重要な特徴を要約しています。血管新生を調節する薬物や遺伝子のスクリーニングに適しており、最近記載されたヒトiPS細胞技術に基づく3次元(3D)血管アッセイとの類似性を示しています。

概要

過去30年間、ターゲットベースの創薬(TDD)は、製薬業界による創薬に広く採用されてきました。TDDは、疾患において重要な役割を果たす定義された分子標的を組み込んでおり、比較的単純な細胞培養システムの開発と薬物スクリーニングのための読み出しに依存しています1。TDDプログラムで使用される最も典型的な疾患モデルには、人工環境および非生理学的基質内で増殖した癌細胞または不死化細胞株などの従来の細胞培養方法が含まれる。これらのモデルの多くは、成功した薬剤候補を特定するための実行可能なツールを提供していますが、そのようなシステムの使用は、疾患との関連性が低いため、疑わしい場合があります2。

ほとんどの疾患では、根底にあるメカニズムは確かに複雑であり、さまざまな細胞型、独立したシグナル伝達経路、および複数の遺伝子セットが特定の疾患表現型に寄与することがしばしば見られます。これは、主な原因が1つの遺伝子の突然変異である遺伝性疾患にも当てはまります。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)技術と遺伝子編集ツールの最近の登場により、in vivoのヒトの複雑さをよりよく再現できる3Dオルガノイドと臓器チップ疾患モデルを生成できるようになりました3,4。このような技術の開発....

プロトコル

1. mESCの培地調製と培養

  1. サプリメント1xグラスゴーMEM(G-MEM BHK-21)培地を使用して、10%(vol/vol)熱不活化ウシ胎児血清(FBS)、0.05 mM β-メルカプトエタノール、1x非必須アミノ酸(NEAA 1x)、2 mM L-グルタミン、および1 mMピルビン酸ナトリウムを含むサプリメント1xグラスゴーMEM(G-MEM BHK-21)培地を使用して、コンディショニング培地+/-(CM+/-)を準備します。
  2. 白血病抑制因子(LIF)(1,500 U/mL)および0.1 mM β-メルカプトエタノールを含むサプリメントCM+/-培地を使用して、コンディショニング培地+/+(CM+/+)を調製します。
  3. 1 μM PD0325901および3 μM CHIR99021を含むサプリメントCM+/+培地を使用して、2つの阻害剤(CM+/+ 2i)の存在下でコンディショニング培地+/+を調製します。
  4. カルシウムとマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)500 mLに25 mLの予熱した2%ゼラチン溶液を混合することにより、0.1%ゼラチン溶液を調製します。
  5. トリプシン(2.5%)とTVP 1x(9.5% 10x DPBS、1 mM EDTA、0.01%ニワトリ血清、0.01% トリプシン(2.5%)をH2O溶液中で混合することにより、10xリン酸トリプシンバーセン(TVP 10x....

結果

血管発芽アッセイのプロトコル概要を図1に示す。3つの独立した129/Ola mESC株(Z/Red、R1、およびE14)に由来する9日齢のEBを、コラゲナーゼAを用いて酵素的に単一細胞に解離させた。すべての細胞株が強固な内皮分化を示し、内皮細胞への分化能に差は認められなかった。全ての細胞株は、内皮細胞の約10.5%±1.3%を産生した(図2A)。PECAM-1(+)細胞集団におけ.......

ディスカッション

このプロトコルは、血管新生を調節する薬物および遺伝子のスクリーニングに適した、偏りのない、堅牢で再現性のある3D EBベースの血管発芽アッセイについて説明しています。この方法は、ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)などの内皮細胞培養を使用して、遊走(ラテラルスクラッチアッセイまたはボイデンチャンバーアッセイ)22,23または増殖(細胞数のカウント、DNA合成の検出、増殖マー.......

開示事項

著者は開示するものは何もありません。

謝辞

この研究は、オランダの組織団体(ZonMW 446002501)、Health Holland(LSHM19057-H040)、Leading Fellows Program Marie Skłodowska-Curie COFUND、およびMaladie de Rendu-Osler協会(AMRO)からの助成金によって支援されました。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolMilipore, Merck805740Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
Agar NobleDifco, BD Pharmigen214220
Alexa Fluo 555 goat anti rat IgGLife technologiesA21434
APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3)BD Biosciences551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone  R35-95)BD Biosciences553932
Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscopeZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)Peprotech450-33
Benchtop Centrifuge, Allegra X-15RBeckman Coulter392932
Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line)Telstar133H401001
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA9418
Cell counting chamber, Buerker, 0.100mmMarienfeld640211
Cell culture dishes 60 x 15mmCorning353802
Cell culture dishes, 35 x 10 mmCorning353801
Cell culture plates 12-wellCorning3512
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBiorad1855196
Chicken serumSigma-AldrichC5405
CHIR-99021 (CT99021) HClSelleckchemS2924
Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mgCorning354249
Collagenase ARoche10103586001
Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5Leica
Cover glasses, 24 × 50 mmVwr631-0146
DAPT γ‑secretase inhibitorSigma AldrichD5942
DC101 anti mouse VEGFR-2 CloneBioXcellBP0060
DC101 isotype rat IgG1BioXcellBP0290
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438-5XBiohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
DPBS (10x), no calcium, no magnesiumGibco, Thermofisher scientific14200067
EDTA 40 mMGibco, Thermofisher scientific15575-038
Embryonic stem-cell Fetal Bovine SerumGibco, Thermofisher scientific16141-079Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year
Eppendorf Microcentrifuge 5415REppendorf AG Z605212
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL)Roche11120166001
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10⁷ units  1 mL)Milipore, MerckESG1107
Falcon tubes 15 mLGreiner Bio-One188271
Falcon tubes 50 mLGreiner Bio-0ne227270
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200Greiner Bio-One739288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10Greiner Bio-One771288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000Greiner Bio-One740288
FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4)Sigma AldrichF3777
FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)Biolegend103107
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530)Biolegend400605
Fluorscent mounting mediaDAKOS3023
GascompressCutisoft45846
Gauze Cutisoft 10 x 10 cmBsn Medical45844_00
Gel blotting paper, Grade GB003WhatmanWHA10547922
Gelatin solution, type BSigma-AldrichG1393-100 ml
Glasgow's MEM (GMEM)Gibco, Thermofisher scientific21710082
IHC Zinc FixativeBD Pharmigen550523
IncuSafe CO2 IncubatorPHCBiMCO-170AICUV-PE
Interleukin-6, human (hIL-6)Roche11138600001
L-Glutamine 200 mMGibco, Thermofisher scientific25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Gibco, Thermofisher scientific11140035
Microscope slide boxKartell Labware278
Microscope slide, StarfrostKnittel glassVS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00099064
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00114576
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts  (2 M)Gibco, Thermofisher scientificA24903Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely
Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)ATCCSCRC-1033Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)].
Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)].
Mouse embryonic stem cells line E14Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001).
Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011)ATCCSCRC-1011Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)].
Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola)Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)].
NanoDrop 1000 UV/VIS SpectrophotometerThermo Fischer ScientificND-1000
PD0325901SelleckchemS1036
PDGF-BB, Recombinant HumanPeprotech100-14B
Pecam-1 antibody, Rat Anti-MouseBD Biosciences550274
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)Gibco, Thermofisher scientific15140122
Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterileGreiner Bio-One633181
Pipetboy acu 2Integra-Biosciences155 019
Pipetman G Multichannel P8 x 200GGilsonF144072
Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000GGilsonF167360
Recombinant Human BMP-4 ProteinR&D Systems314-BP
RNeasy Plus mini KitQIAGEN74134
Serological pipettes, 10 mLGreiner Bio-One607 180
Serological pipettes, 25 mLGreiner Bio-One760 180
Serological pipettes, 5 mLGreiner Bio-One606 180
Sodium hydroxide (NaOH)Merck106498
Sodium pyruvate 100 mMGibco, Thermofisher scientific11360039
Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer capCorning352235
Thermal cycler, T100Biorad1861096
Triton X-100 (BioXtra)Sigma AldrichT9284
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco, Thermofisher scientific15250061
Trypsin (2.5%)Gibco, Thermofisher scientific15090046
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mLCorning430758
VEGFA165 , recombinant murinePeprotech450-32
Water, SterileFresenius-KabiB230531
Waterbath, Lab-Line DigitalThermo Fischer Scientific18052A

参考文献

  1. Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
  2. Horvath, P., et al.

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