In vitro Ensaio Tridimensional de Angiogênese Utilizando Células-Tronco Embrionárias de Camundongos para Modelagem de Doenças Vasculares e Testes de Fármacos

Resumo

Este ensaio utiliza células-tronco embrionárias de camundongos diferenciadas em corpos embrionários cultivadas em gel de colágeno 3D para analisar os processos biológicos que controlam a angiogênese brotada in vitro. A técnica pode ser aplicada para testar drogas, modelar doenças e estudar genes específicos no contexto de deleções embrionariamente letais.

Resumo

Avanços recentes em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) e tecnologias de edição de genes permitem o desenvolvimento de novos modelos de doenças baseadas em células humanas para programas de descoberta de drogas fenotípicas (PDD). Embora esses novos dispositivos pudessem prever a segurança e a eficácia de drogas experimentais em humanos com mais precisão, seu desenvolvimento para a clínica ainda depende fortemente de dados de mamíferos, notadamente o uso de modelos de doenças em camundongos. Em paralelo aos modelos de doenças organoides ou organ-on-chip humanas, o desenvolvimento de modelos relevantes em camundongos in vitro é, portanto, uma necessidade não atendida para avaliar comparações diretas de eficácia e segurança de medicamentos entre espécies e condições in vivo e in vitro. Neste artigo, descreve-se um ensaio de brotamento vascular que utiliza células-tronco embrionárias de camundongos diferenciadas em corpos embrionários (EBs). EBs vascularizadas cultivadas em gel de colágeno 3D desenvolvem novos vasos sanguíneos que se expandem, um processo chamado angiogênese brotamento. Esse modelo recapitula as principais características da angiogênese germinada in vivo-formação de vasos sanguíneos a partir de uma rede vascular pré-existente, incluindo seleção de células da ponta endotelial, migração e proliferação de células endoteliais, orientação celular, formação de tubos e recrutamento de células murais. É passível de triagem para drogas e genes moduladores da angiogênese e apresenta semelhanças com ensaios vasculares tridimensionais (3D) recentemente descritos baseados em tecnologias humanas de iPSC.

Introdução

Nas últimas três décadas, a descoberta de fármacos baseada em alvos (TDD) tem sido amplamente empregada na descoberta de fármacos pela indústria farmacêutica. A TDD incorpora um alvo molecular definido que desempenha um papel importante em uma doença e depende do desenvolvimento de sistemas de cultura celular relativamente simples e leituras para triagem de drogas¹. A maioria dos modelos típicos de doenças usados em programas de TDD incluem métodos tradicionais de cultura de células, como células cancerosas ou linhagens celulares imortalizadas cultivadas em ambientes artificiais e substratos não fisiológicos. Embora muitos desses modelos tenham fornecido ferramentas viáveis para identificar candidatos a fármacos bem-sucedidos, o uso de tais sistemas pode ser questionável devido à sua baixa relevância para a doença².

Para a maioria das doenças, os mecanismos subjacentes são realmente complexos e vários tipos celulares, vias de sinalização independentes e múltiplos conjuntos de genes são frequentemente encontrados para contribuir para um fenótipo específico da doença. Isso também é verdade para doenças hereditárias em que a causa primária é uma mutação em um único gene. Com o recente advento de tecnologias de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSC) e ferramentas de edição gênica, agora é possível gerar organoides 3D e modelos de doenças organ-on-chip que poderiam recapitular melhor a complexidade humana in vivo ^3,4. O desenvolvimento de tais tecnologias está associado ao ressurgimento do interesse em programas de descoberta de drogas fenotípicas (TID)¹. O TID pode ser comparado ao rastreamento empírico, pois não depende do conhecimento da identidade de um alvo específico da droga ou de uma hipótese sobre seu papel na doença. A abordagem TID é hoje cada vez mais reconhecida por contribuir fortemente para a descoberta de drogas de primeira classe⁵. Como o desenvolvimento de tecnologias de organoides humanos e organ-on-chip ainda está engatinhando, espera-se que os modelos iPSC (complementados com ferramentas inovadoras de imagem e aprendizado de máquina^6,7) forneçam, em um futuro próximo, vários novos modelos complexos de doenças baseadas em células para triagem de drogas e programas associados de TID para superar a baixa produtividade da abordagem TDD^{8, 9º}.

Embora os modelos organoides humanos e organ-on-chip possam fornecer informações importantes sobre a complexidade da doença e para a identificação de novos medicamentos, trazer medicamentos para a nova prática clínica também depende fortemente de dados de modelos animais para avaliar sua eficácia e segurança. Entre eles, camundongos geneticamente modificados são certamente os modelos de mamíferos preferidos. Eles têm muitas vantagens, pois têm um tempo de geração relativamente curto para os mamíferos, têm muitos fenótipos semelhantes às doenças humanas e podem ser facilmente manipulados geneticamente. São, portanto, extensivamente utilizados em programas de descoberta de fármacos¹⁰. No entanto, fazer a ponte entre camundongos e humanos continua sendo um desafio importante¹¹. O desenvolvimento de modelos in vitro de camundongos equivalentes a modelos organoides e organ-on-chip humanos poderia, pelo menos parcialmente, preencher essa lacuna, pois permitirá comparações diretas de eficácia e segurança de medicamentos entre dados in vivo de camundongos e in vitro em humanos.

Aqui, um ensaio de brotamento vascular em corpos embrionários (EBs) de camundongos é descrito. Os vasos sanguíneos são compostos por células endoteliais (revestimento interno das paredes dos vasos), células murais (células musculares lisas vasculares e pericitos)¹². Esse protocolo baseia-se na diferenciação de células-tronco embrionárias de camundongos (mESCs) em EBs vascularizadas utilizando gotículas pendentes que recapitulam a diferenciação de células endoteliais e murais de novo ^13,14. CTEs de camundongos podem ser facilmente estabelecidas em cultura a partir de blastocistos isolados do dia 3,5 de camundongos com diferentes origens genéticas¹⁵. Também oferecem possibilidades de análise clonal, rastreamento de linhagens e podem ser facilmente manipulados geneticamente para gerar modelos de doenças^13,16.

Como os vasos sanguíneos nutrem todos os órgãos, não é surpreendente que muitas doenças, se não todas, estejam associadas a alterações na microvasculatura. Em condições patológicas, as células endoteliais podem adotar um estado ativado ou podem se tornar disfuncionais, resultando em morte celular mural ou migração para longe dos vasos sanguíneos. Estes podem resultar em angiogênese excessiva ou em rarefação de vasos, podem induzir fluxo sanguíneo anormal e barreira vascular defeituosa levando ao extravasamento de células imunes e inflamação^12,17,18,19. A pesquisa para o desenvolvimento de fármacos moduladores dos vasos sanguíneos é, portanto, alta, e múltiplos atores e conceitos moleculares já foram identificados para o direcionamento terapêutico. Nesse contexto, o protocolo descrito é particularmente adequado para a construção de modelos de doenças e para testes de drogas, pois recapitula as principais características da angiogênese em brotamento in vivo, incluindo seleção de células da ponta e do pedúnculo endotelial, migração e proliferação de células endoteliais, orientação de células endoteliais, formação de tubos e recrutamento de células murais. Também apresenta semelhanças com ensaios vasculares 3D recentemente descritos, baseados em tecnologias humanas iPSC²⁰.

Protocolo

1. Preparação de mídia e cultura de mESC

1. Preparar meio condicionado +/- (CM+/-) usando o suplemento 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) com 10% (vol/vol) de Soro Fetal Bovino (FBS) inativado pelo calor, 0,05 mM β-mercaptoetanol, 1x aminoácidos não essenciais (NEAA 1x), 2 mM L-glutamina e 1 mM de piruvato de sódio.
2. Preparar meio condicionado +/+ (CM+/+) utilizando o suplemento meio CM+/- com Fator Inibidor de Leucemia (LIF) (1.500 U/mL) e β-mercaptoetanol 0,1 mM.
3. Preparar meio condicionado +/+ na presença de dois inibidores (CM+/+ 2i) utilizando o suplemento meio CM+/+ com 1 μM PD0325901 e 3 μM CHIR99021.
4. Preparar solução de gelatina a 0,1% misturando 25 mL de solução de gelatina a 2% pré-aquecida em 500 mL de solução salina tamponada com fosfato sem cálcio e magnésio (DPBS).
5. Preparar 10x tampão de fosfato de tripsina versene (TVP 10x) misturando tripsina (2,5%) com TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% soro de frango, 0,01% tripsina (2,5%) em H₂O) (proporção 1:10, vol/vol).
   NOTA: Filtrar todas as soluções através de um filtro de poros de 0,22 μm. Conservar o meio de cultura a -20 °C a longo prazo e manter outros reagentes a 4 °C até 3 semanas (ver Tabela de Materiais).
6. Revestir duas placas de cultura celular de 12 poços com solução de gelatina a 0,1% (500 μL por poço) e incubá-las por 30 min em estufa CO 2 (37 °C, 5% CO₂, atmosfera úmida).
7. Lave as placas revestidas com gelatina com PBS e adicione 500 μL de meio CM+/-.
8. Descongelar dois frascos para injetáveis de 1 x 10⁶ fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) irradiados criopreservados a 37 °C e transferir a suspensão celular para um tubo cônico com 5 mL de meio CM+/-.
9. Centrifugar as células a 200 x g durante 5 min à temperatura ambiente (TR). Aspirar o meio e ressuspender suavemente o pellet de células em 12 mL de meio CM+/- na concentração de 1,67 x 10,5 células por mL.
10. Semear 500 μL de MEF em uma placa de cultura celular de 12 poços (2,4 x 10⁵ células por cm 2) e incubar a placa durante a noite (o/n) em uma incubadora de CO².
11. Descongelar um frasco para injetáveis de mESCs criopreservados (1 x 10⁶) em meio CM+/+ 2i.
12. Semeando a suspensão de mESC em uma placa de 12 poços pré-lavada com MEFs em 1 mL de meio CM+/+ 2i e transferindo a placa para uma incubadora de CO₂ . Atualize o meio diariamente.
13. Com 70% de confluência, lavar as colônias mESC com DPBS. Adicionar 150 μL de tampão TVP 10x quente e incubar em RT por 30 s para iniciar a dissociação enzimática.
14. Remover cuidadosamente o tampão TVP, ressuspender as células em 1 mL de meio CM+/+ 2i e dissociar as colônias em células únicas por pipetagem suave.
15. Passar as células transferindo-as para uma nova placa de cultura celular de 12 poços com MEFs (proporção de divisão: 1:3-1:5). Misture suavemente para distribuir as células e incube em uma incubadora de CO₂ .
16. Atualizar o meio de cultura (2-3 mL) e observar diariamente o crescimento/morfologia celular. Repita a passagem em série com 70% de confluência a cada 2 dias. Mude para o meio CM+/+ por duas passagens antes de iniciar a diferenciação celular.

2. Formação de EB em gota suspensa

1. Preparar o meio de diferenciação do mesoderma fresco suplementando o meio CM+/- com Fator de Crescimento de Fibroblastos (bFGF) básico (50 ng·mL-1) e com Proteína Morfogenética Óssea 4 (BMP-4) (5 ng·^mL-1) e ^mantê-lo a 4 °C até o uso.
2. Cobrir um poço da placa de cultura celular de 6 poços com 500 μL de solução de gelatina a 0,1% e colocá-lo em uma incubadora de CO₂ por 30 min.
3. Lave as placas revestidas com gelatina com PBS e adicione 500 μL de meio CM+/-.
4. Para obter uma população pura de mESCs, tripsinize a placa de cultura celular com tampão TVP 10x por 30 s em RT, ressuspenda as células em meio de diferenciação de mesoderma de 1 mL e, em seguida, transfira-as para a placa de 6 poços revestida com gelatina por 30 min, permitindo que as MEFs se fixem enquanto as mESCs permanecem em suspensão.
5. Coletar a suspensão celular em um tubo cônico de 50 mL e contar as células usando um hemocitômetro de Neubauer e corante azul de Trypan para uma exclusão de células vivas/mortas.
6. Centrifugar as células a 200 x g por 5 min na RT. Retirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em meio de diferenciação mesodérmica para atingir 4,55 x 10⁴ células por mL.
7. Encha o fundo de placas de poliestireno de fixação baixa de 94 mm com 15 mL de água estéril.
   NOTA: Quatro pratos contendo gotas pendentes (1,6 x 10⁵ células em 3,52 mL de meio) serão necessários para testar uma condição específica usando o ensaio de angiogênese de brotação 3D.
8. Transfira a suspensão celular para um reservatório plástico estéril e carregue quatro posições de uma pipeta multicanal com 22 μL de suspensão celular por canal (1 x 10³ células por gota de 22 μL).
9. Levante e inverta a tampa da placa de 94 mm e coloque-a na superfície limpa do gabinete de fluxo com o lado interno voltado para cima.
10. Depositar 40 gotas da suspensão celular na superfície interna de cada tampa. Inverta cuidadosamente a tampa sem perturbação e coloque-a de volta no prato, de modo que as gotas fiquem viradas para a água.
11. Incube os pratos em uma incubadora de CO₂ . Considere isso como dia de diferenciação 0. Manter as placas por 4 dias para formar EBs.

3. Ensaio de competição para a posição da célula de ponta

1. Cultura: uma linhagem mESC fluorescente e outra não fluorescente, conforme descrito anteriormente¹³. Como exemplo, são usados mESCs 7ACS/EYFP rotulados em amarelo e mESCs R1.
2. Prepare EBs em mosaico misturando quantidades iguais das duas linhas mESC (proporção 1:1) e incube as placas suspensas em uma incubadora de CO 2, conforme descrito na etapa₂ .

4. Cultura de EBs flutuantes para diferenciação vascular

1. Antes de coletar EBs das gotas pendentes, prepare o seguinte.
   1. Preparar solução de ágar a 5% em H₂O e esterilizá-la em autoclave (20 min a 120 °C).
   2. Use a solução quente de ágar a 5% para preparar o meio G-MEM BHK-21 contendo ágar a 1% e despeje rapidamente 3 mL em uma das placas de poliestireno de 60 mm. Deixe o ágar solidificar por 1 h no RT. Guarde os pratos a 4 °C até usar.
2. Preparar meio de diferenciação vascular fresco 2x suplementando o meio CM+/- com bFGF (100 ng·mL-1) e VEGF-A (50 ng·^mL-1). Conservar o meio a 4 °C até à utilização.
3. Coletar as gotas pendentes em um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta P1000 e remover o sobrenadante após alguns minutos de sedimentação com EB.
4. Ressuspender as EBs em 3 mL de meio de diferenciação vascular 2x, transferir a suspensão da EB para uma mão revestida em ágar, distribuir as EBs homogeneamente para evitar agregação.
5. Incubar as placas em estufa CO 2 e refrescar o meio a cada₂ dias até o dia 9 usando 1x meio de diferenciação vascular na presença de bFGF (50 ng·mL-1) e VEGF-A (25 ng·^mL-1).
6. Alternativamente, adicione o Fator de Crescimento Derivado de Plaquetas-BB (PDGF-BB) (10 ng·mL-1 no dia 4 e 5 ng·^mL-1 no dia 6 e no dia 8) ao meio de diferenciação vascular para promover a diferenciação das células murais.

5. Análise por citometria de fluxo

1. Coletar os EBs de 9 dias em um tubo cônico de 15 mL usando uma pipeta P1000 e lavá-los uma vez com PBS quente.
2. Adicionar 1mL de meio G-MEM BHK-21 contendo 0,2 mg·^mL-1 de colagenase A e incubar as células em incubadora de CO₂ por 5 min.
3. Dissociar os EBs pipetando suavemente para cima e para baixo com uma pipeta P1000.
4. Interromper a atividade da colagenase adicionando 1 mL de meio G-MEM BHK-21 frio com 10% de FBS.
5. Centrifugar as células a 200 x g por 5 min no TR.
6. Ressuspender as células em 500 μL de PBS com SFB a 2%.
7. Conte as células usando um hemocitômetro de Neubauer.
8. Ressuspender 400.000 células em 100 μL de PBS com 2% de FBS por condição de coloração.
9. Incubar as células durante 45 minutos a 4 °C com os seguintes anticorpos: APC conjugado de rato anti-rato PECAM-1 (clone MEC13.3) e FITC conjugado de rato anti-rato CD45 (clone 30-F11) ou anticorpos de controlo isotípico.
10. Lavar as células duas vezes com 1 mL de PBS contendo FBS a 2%.
11. Ressuspender as células para atingir uma concentração final de 5 x 10⁶ células por mL.
12. Filtre as células usando um tubo de ensaio de poliestireno de fundo redondo, com uma tampa de encaixe do filtro de células.
13. Analisar 20.000 eventos PECAM-1 (+) por citometria de fluxo.

6.3D ensaio de angiogênese por brotamento e coloração por imunofluorescência

1. No dia 9, preparar um meio de brotação adicionando 10% FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·mL-1), VEGF-A (25 ng·mL-1), eritropoetina humana recombinante (hEPO) (20 ng·mL-1), interleucina-6 humana (IL-6) (10 ng·mL-1), β-mercaptoetanol 0,05 mM, NEAA (1x), L-glutamina (1x), piruvato de sódio (1x), colágeno de cauda de rato tipo I (1,25 mg·^mL-1), e NaOH (3,1 mM) para GMEM em meio BHK-1.
2. Para evitar a gelificação do colágeno, mantenha o meio de brotação no gelo até o uso.
3. Para avaliar o efeito de moléculas pró/antiangiogênicas, adicione o fármaco ou veículo selecionado ao meio de brotação na concentração selecionada.
4. Coletar EBs de 9 dias de uma placa de ágar de 60 mm em um tubo cônico de 15 mL (equivalente a uma condição) e remover o sobrenadante após alguns minutos de sedimentação.
5. Cobrir o fundo de uma placa de cultura de 35 mm com 1 mL do meio de brotação e incubar a 37 °C por 5 min para induzir a gelificação.
6. Ressuspender as EBs em 2 mL de meio de brotação a frio.
7. Transfira a suspensão para a placa de cultura de 35 mm revestida com a primeira camada de meio de brotação.
8. Distribua os EBs por toda a placa e certifique-se de que eles estejam a uma distância igual um do outro. Incubar o prato em uma incubadora de CO₂ . A primeira formação de brotos acontece dentro de 24-48 h.
9. No 12º dia, o gel de colágeno contendo EBs é cuidadosamente transferido para uma lâmina de vidro (75 x 26 mm) usando uma espátula.
10. Retire o excesso de líquido usando uma pipeta (P1000) e desidrate o gel colocando uma folha de gaze de linho de nylon e cartões de filtro absorvente (gel blotting paper) sobre o gel. Aplique pressão colocando um peso (250 g) por 2 min. Retire cuidadosamente os papéis de nylon/filtro e deixe as lâminas secarem ao ar por 30 min no RT.
11. Lave as lâminas três vezes com PBS por 5 min no RT.
12. Fixar os EB utilizando solução de zinco (ver Tabela de Materiais) o/n a 4 °C. Alternativamente, fixar os EBs fluorescentes em mosaico com Paraformaldeído (PFA) (4%) o/n a 4 °C no escuro.
13. Remova o fixador. Lave as lâminas cinco vezes com PBS por 5 min no RT.
14. Permeabilizar os EBs em PBS contendo Triton-X100 a 0,1% por 15 min no TR.
15. Remova a solução de permeabilização. Lave as lâminas cinco vezes com PBS por 5 min.
16. Incubar os EBs no tampão de bloqueio (PBS com 2% de Albumina de Soro Bovino, BSA) por 1 h no TR.
17. Para corar os brotos endoteliais, use um anticorpo primário anti-PECAM-1 de rato (diluição de 1:100) no tampão de bloqueio o/n a 4 °C.
18. Lave as lâminas cinco vezes com PBS por 5 min.
19. Incubar as lâminas com o anticorpo secundário Alexa 555 anti-rato de cabra em tampão de bloqueio (diluição de 1:250) e, quando necessário, com o anticorpo anti-α-SMA conjugado com FITC em tampão de bloqueio (diluição de 1:250) para corar as células murais por 2 h no RT no escuro.
20. Lave as lâminas três vezes com PBS por 5 min e uma vez com H₂0 antes de montá-las.

7. Imagem confocal, morfométrica e análise quantitativa de brotos endoteliais de EB

1. Adquirir imagens de alta resolução das EBs imunomarcadas por fusão no plano focal (z-stacking) usando um microscópio confocal. Use a objetiva de ampliação de 10x para criar imagens de EBs inteiras.
2. Analisar as imagens adquiridas no ImageJ para avaliar a morfologia e quantificar as características dos brotos endoteliais positivos para PECAM-1 de acordo com métodos de quantificação estabelecidos13,14,21.
   1. Calcular o número médio de brotos endoteliais por EBs contando manualmente o número total de brotos por EBs individuais.
   2. Meça os comprimentos individuais dos brotos usando a ferramenta de desenho ImageJ. Definir a base do broto endotelial a partir da área central da EB e traçar manualmente uma linha até o final da ponta do broto.
   3. Calcule o número médio de células da ponta por broto contando manualmente o número de células da ponta por broto individual e, em seguida, calcule a média por EB.
   4. Calcule a orientação dos filópodes determinando manualmente o eixo do broto pai e meça o ângulo agudo entre eles usando a ferramenta de ângulo do software ImageJ. Calcule o número de brotos com orientação >50° e divida pelo número total de brotos do EB de interesse.
      OBS: Os ângulos sempre variaram de 0° a 90°.
3. Adquirir imagens de alta resolução das EBs imunomarcadas usando um microscópio confocal. Use a objetiva de aumento de 40x para obter imagens de alta resolução de brotos endoteliais únicos.
4. Quantifique a cobertura vascular de brotos CE positivos para PECAM-1 circundados por MCs positivos para α-SMA usando o software ImageJ.
   1. Divida as imagens mescladas em canais vermelhos e verdes separados.
   2. Converta as imagens em sua forma binária.
   3. Medir a área celular total do broto ocupada separadamente por células positivas para PECAM-1 (células endoteliais marcadas em vermelho) e por células positivas para α-SMA (células murais marcadas em verde).
   4. Gere a imagem mesclada usando a função de calculadora de imagem e o operador AND. Meça a área celular total da imagem. Para calcular a cobertura, divida a área da imagem colocalizada pela área da imagem binária PECAM-1.
5. Para analisar a competição celular pela posição das células da ponta/pedúnculo endotelial de brotos desenvolvidos por EBs em mosaico, pontuar manualmente o número de células da ponta e marcar sua origem genotípica com base no sinal de fluorescência. Calcular os valores médios por EB.

Resultados

A visão geral do protocolo do ensaio de brotamento de vasos sanguíneos é mostrada na Figura 1. EBs de nove dias de idade derivadas de três linhagens independentes de 129/Ola mESC (Z/Red, R1 e E14) foram enzimaticamente dissociadas em células únicas usando colagenase A. As células foram coradas para PECAM-1 e analisadas por classificação celular ativada por fluorescência (FACS) conforme descrito. Todas as linhagens celulares exibiram diferenciação endotelial robusta, e não foram ...

Discussão

Este protocolo descreve um ensaio vascular de brotamento baseado em EB 3D imparcial, robusto e reprodutível, passível de triagem para drogas e genes moduladores da angiogênese. Este método oferece vantagens sobre muitos ensaios bidimensionais (2D) amplamente utilizados usando culturas de células endoteliais, como as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) para monitorar a migração (ensaio de scratch lateral ou o ensaio da câmara de Boyden)22,23 ou proliferação (contagem do número de células, de...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Milipore, Merck	805740	Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
Agar Noble	Difco, BD Pharmigen	214220
Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG	Life technologies	A21434
APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3)	BD Biosciences	551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone  R35-95)	BD Biosciences	553932
Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope	ZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)	Peprotech	450-33
Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R	Beckman Coulter	392932
Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line)	Telstar	133H401001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm	Marienfeld	640211
Cell culture dishes 60 x 15mm	Corning	353802
Cell culture dishes, 35 x 10 mm	Corning	353801
Cell culture plates 12-well	Corning	3512
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	1855196
Chicken serum	Sigma-Aldrich	C5405
CHIR-99021 (CT99021) HCl	Selleckchem	S2924
Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg	Corning	354249
Collagenase A	Roche	10103586001
Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5	Leica
Cover glasses, 24 × 50 mm	Vwr	631-0146
DAPT γ?secretase inhibitor	Sigma Aldrich	D5942
DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone	BioXcell	BP0060
DC101 isotype rat IgG1	BioXcell	BP0290
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2438-5X	Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
DPBS (10x), no calcium, no magnesium	Gibco, Thermofisher scientific	14200067
EDTA 40 mM	Gibco, Thermofisher scientific	15575-038
Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum	Gibco, Thermofisher scientific	16141-079	Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year
Eppendorf Microcentrifuge 5415R	Eppendorf AG	Z605212
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL)	Roche	11120166001
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10? units  1 mL)	Milipore, Merck	ESG1107
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-0ne	227270
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200	Greiner Bio-One	739288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10	Greiner Bio-One	771288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000	Greiner Bio-One	740288
FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4)	Sigma Aldrich	F3777
FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103107
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530)	Biolegend	400605
Fluorscent mounting media	DAKO	S3023
Gascompress	Cutisoft	45846
Gauze Cutisoft 10 x 10 cm	Bsn Medical	45844_00
Gel blotting paper, Grade GB003	Whatman	WHA10547922
Gelatin solution, type B	Sigma-Aldrich	G1393-100 ml
Glasgow's MEM (GMEM)	Gibco, Thermofisher scientific	21710082
IHC Zinc Fixative	BD Pharmigen	550523
IncuSafe CO2 Incubator	PHCBi	MCO-170AICUV-PE
Interleukin-6, human (hIL-6)	Roche	11138600001
L-Glutamine 200 mM	Gibco, Thermofisher scientific	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Gibco, Thermofisher scientific	11140035
Microscope slide box	Kartell Labware	278
Microscope slide, Starfrost	Knittel glass	VS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00099064
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer	Qiagen	QT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer	Qiagen	QT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00114576
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts  (2 M)	Gibco, Thermofisher scientific	A24903	Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely
Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)	ATCC	SCRC-1033	Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)].
Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+			Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)].
Mouse embryonic stem cells line E14			Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001).
Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011)	ATCC	SCRC-1011	Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)].
Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola)			Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)].
NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer	Thermo Fischer Scientific	ND-1000
PD0325901	Selleckchem	S1036
PDGF-BB, Recombinant Human	Peprotech	100-14B
Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse	BD Biosciences	550274
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco, Thermofisher scientific	15140122
Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile	Greiner Bio-One	633181
Pipetboy acu 2	Integra-Biosciences	155 019
Pipetman G Multichannel P8 x 200G	Gilson	F144072
Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G	Gilson	F167360
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D Systems	314-BP
RNeasy Plus mini Kit	QIAGEN	74134
Serological pipettes, 10 mL	Greiner Bio-One	607 180
Serological pipettes, 25 mL	Greiner Bio-One	760 180
Serological pipettes, 5 mL	Greiner Bio-One	606 180
Sodium hydroxide (NaOH)	Merck	106498
Sodium pyruvate 100 mM	Gibco, Thermofisher scientific	11360039
Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap	Corning	352235
Thermal cycler, T100	Biorad	1861096
Triton X-100 (BioXtra)	Sigma Aldrich	T9284
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco, Thermofisher scientific	15250061
Trypsin (2.5%)	Gibco, Thermofisher scientific	15090046
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL	Corning	430758
VEGFA165 , recombinant murine	Peprotech	450-32
Water, Sterile	Fresenius-Kabi	B230531
Waterbath, Lab-Line Digital	Thermo Fischer Scientific	18052A