In vitro Essai tridimensionnel de germination de l’angiogenèse à l’aide de cellules souches embryonnaires de souris pour la modélisation de maladies vasculaires et l’analyse de médicaments

Résumé

Ce test utilise des cellules souches embryonnaires de souris différenciées en corps embryoïdes cultivés dans un gel de collagène 3D pour analyser les processus biologiques qui contrôlent la germination de l’angiogenèse in vitro. La technique peut être appliquée pour tester des médicaments, modéliser des maladies et étudier des gènes spécifiques dans le contexte de délétions mortelles pour les embryons.

Résumé

Les progrès récents dans les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) et les technologies d’édition de gènes permettent le développement de nouveaux modèles de maladies à base de cellules humaines pour les programmes de découverte phénotypique de médicaments (TED). Bien que ces nouveaux dispositifs puissent prédire plus précisément l’innocuité et l’efficacité des médicaments expérimentaux chez l’homme, leur développement en clinique repose encore fortement sur des données sur les mammifères, notamment l’utilisation de modèles de maladies chez la souris. Parallèlement aux modèles de maladies organoïdes ou d’organes sur puce humains, le développement de modèles murins in vitro pertinents est donc un besoin non satisfait pour évaluer les comparaisons directes de l’efficacité et de l’innocuité des médicaments entre les espèces et les conditions in vivo et in vitro . Ici, un test de germination vasculaire qui utilise des cellules souches embryonnaires de souris différenciées en corps embryoïdes (EB) est décrit. Les EB vascularisés cultivés sur du gel de collagène 3D développent de nouveaux vaisseaux sanguins qui se dilatent, un processus appelé angiogenèse germée. Ce modèle récapitule les principales caractéristiques de la formation in vivo de l’angiogenèse des vaisseaux sanguins à partir d’un réseau vasculaire préexistant, y compris la sélection des cellules de l’extrémité endothéliale, la migration et la prolifération des cellules endothéliales, le guidage cellulaire, la formation de tubes et le recrutement de cellules murales. Il se prête au criblage de médicaments et de gènes modulant l’angiogenèse et présente des similitudes avec des tests vasculaires tridimensionnels (3D) récemment décrits basés sur des technologies iPSC humaines.

Introduction

Au cours des trois dernières décennies, la découverte de médicaments basée sur la cible (TDD) a été largement utilisée dans la découverte de médicaments par l’industrie pharmaceutique. La DJT incorpore une cible moléculaire définie jouant un rôle important dans une maladie et repose sur le développement de systèmes de culture cellulaire relativement simples et de lectures pour le dépistage de médicaments¹. La plupart des modèles de maladies typiques utilisés dans les programmes de TDD comprennent des méthodes traditionnelles de culture cellulaire telles que les cellules cancéreuses ou les lignées cellulaires immortalisées cultivées dans des environnements artificiels et des substrats non physiologiques. Bien que bon nombre de ces modèles aient fourni des outils viables pour identifier les médicaments candidats efficaces, l’utilisation de tels systèmes peut être discutable en raison de leur faible pertinence pour la maladie².

Pour la plupart des maladies, les mécanismes sous-jacents sont en effet complexes et divers types de cellules, des voies de signalisation indépendantes et de multiples ensembles de gènes contribuent souvent à un phénotype de maladie spécifique. Cela est également vrai pour les maladies héréditaires dont la cause principale est une mutation dans un seul gène. Avec l’avènement récent des technologies de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) et des outils d’édition de gènes, il est maintenant possible de générer des organoïdes 3D et des modèles de maladies d’organes sur puce qui pourraient mieux récapituler la complexité humaine in vivo ^3,4. Le développement de telles technologies est associé à un regain d’intérêt pour les programmes de découverte de médicaments phénotypiques (TED)¹. Les TED peuvent être comparés au dépistage empirique, car ils ne reposent pas sur la connaissance de l’identité d’une cible médicamenteuse spécifique ou sur une hypothèse sur son rôle dans la maladie. L’approche PDD est maintenant de plus en plus reconnue comme contribuant fortement à la découverte de médicaments first-in-class⁵. Étant donné que le développement des technologies organoïdes et d’organes sur puce humains en est encore à ses balbutiements, on s’attend à ce que les modèles iPSC (complétés par des outils novateurs d’imagerie et d’apprentissage automatique^6,7) fournissent, dans un proche avenir, de multiples nouveaux modèles de maladies complexes à base de cellules pour le dépistage de médicaments et les programmes de TED associés afin de surmonter la faible productivité de l’approche TDD^{8, 9}.

Bien que les modèles organoïdes humains et d’organes sur puce puissent fournir des informations importantes sur la complexité de la maladie et l’identification de nouveaux médicaments, l’introduction de médicaments dans de nouvelles pratiques cliniques repose également fortement sur les données de modèles animaux pour évaluer leur efficacité et leur innocuité. Parmi eux, les souris génétiquement modifiées sont certainement les modèles de mammifères les plus préférés. Ils présentent de nombreux avantages car ils ont un temps de génération relativement court pour les mammifères, ont de nombreux phénotypes similaires aux maladies humaines et peuvent être facilement manipulés génétiquement. Ils sont donc largement utilisés dans les programmes de découverte de médicaments¹⁰. Cependant, combler le fossé entre les souris et les humains reste un défi important¹¹. Le développement de modèles murins in vitro équivalents aux modèles organoïdes humains et aux modèles d’organes sur puce pourrait au moins partiellement combler cette lacune, car il permettra des comparaisons directes de l’efficacité et de l’innocuité des médicaments entre les données in vivo de souris et les données humaines in vitro.

Ici, un test de germination vasculaire dans les corps embryoïdes de souris (EB) est décrit. Les vaisseaux sanguins sont composés de cellules endothéliales (paroi interne des parois des vaisseaux), de cellules murales (cellules musculaires lisses vasculaires et péricytes)¹². Ce protocole est basé sur la différenciation des cellules souches embryonnaires de souris (CSEm) en EB vascularisés à l’aide de gouttelettes suspendues qui récapitulent la différenciation de novo des cellules endothéliales et des cellules murales^13,14. Les CSE de souris peuvent être facilement établies en culture à partir de blastocystes de souris isolés du jour 3.5 ayant des antécédents génétiques différents¹⁵. Ils offrent également des possibilités d’analyse clonale, de traçage de lignée et peuvent être facilement manipulés génétiquement pour générer des modèles de maladie^13,16.

Comme les vaisseaux sanguins nourrissent tous les organes, il n’est pas surprenant que de nombreuses maladies, sinon toutes, soient associées à des changements dans la microvascularisation. Dans des conditions pathologiques, les cellules endothéliales peuvent adopter un état activé ou devenir dysfonctionnelles, entraînant la mort des cellules murales ou la migration loin des vaisseaux sanguins. Ceux-ci peuvent entraîner une angiogenèse excessive ou une raréfaction des vaisseaux, peuvent induire un flux sanguin anormal et une barrière vasculaire défectueuse conduisant à une extravasation des cellules immunitaires et à une inflammation^12,17,18,19. La recherche pour le développement de médicaments modulant les vaisseaux sanguins est donc élevée, et de multiples acteurs moléculaires et concepts ont déjà été identifiés pour le ciblage thérapeutique. Dans ce contexte, le protocole décrit est particulièrement adapté à la construction de modèles de maladies et aux tests de médicaments, car il récapitule les principales caractéristiques de l’angiogenèse in vivo, notamment la sélection des cellules de l’extrémité endothéliale et de la tige, la migration et la prolifération des cellules endothéliales, le guidage des cellules endothéliales, la formation de tubes et le recrutement de cellules murales. Il présente également des similitudes avec les tests vasculaires 3D récemment décrits basés sur les technologies iPSC humaines²⁰.

Protocole

1. Préparation des milieux et culture des CSEm

1. Préparer le milieu conditionné +/- (CM+/-) en utilisant le supplément 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) milieu avec 10% (vol/vol) de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur (FBS), 0,05 mM de β-mercaptoéthanol, 1x acides aminés non essentiels (NEAA 1x), 2 mM de L-glutamine et 1 mM de pyruvate de sodium.
2. Préparer le milieu conditionné +/+ (CM+/+) en utilisant le supplément CM+/- milieu avec facteur inhibiteur de la leucémie (LIF) (1 500 U/mL) et 0,1 mM β-mercaptoéthanol.
3. Préparer le milieu conditionné +/+ en présence de deux inhibiteurs (CM+/+2i) en utilisant le complément CM+/+ milieu avec 1 μM PD0325901 et 3 μM CHIR99021.
4. Préparer une solution de gélatine à 0,1 % en mélangeant 25 mL de solution de gélatine à 2 % préchauffée dans 500 mL de solution saline tamponnée au phosphate sans calcium ni magnésium (DPBS).
5. Préparer 10x tampon Trypsin Versene Phosphate (TVP 10x) en mélangeant Trypsine (2,5%) avec TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% sérum de poulet, 0,01% Trypsine (2,5%) dans H₂O) (rapport 1:10, vol/vol).
   REMARQUE: Filtrer toutes les solutions à travers un filtre à pores de 0,22 μm. Conserver le milieu de culture à -20 °C pendant une longue période et conserver les autres réactifs à 4 °C jusqu’à 3 semaines (voir le tableau des matières).
6. Enduisez deux plaques de culture cellulaire de 12 puits avec une solution de gélatine à 0,1 % (500 μL par puits) et incuber pendant 30 min dans un incubateur de CO 2 (37 °C, 5 % de CO₂, atmosphère humide).
7. Laver les plaques enrobées de gélatine avec du PBS et ajouter 500 μL de milieu CM+/-.
8. Décongeler deux flacons de 1 x 10⁶ fibroblastes embryonnaires de souris irradiés cryoconservés à 37 °C et transférer la suspension cellulaire dans un tube conique contenant 5 mL de milieu CM+/-.
9. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à température ambiante (RT). Aspirer le milieu et remettre doucement en suspension la pastille cellulaire dans 12 mL de milieu CM+/- à une concentration de 1,67 x 10⁵ cellules par mL.
10. Ensemencer 500 μL de suspension MEF dans une plaque de culture cellulaire de 12 puits (2,4 x 10⁵ cellules par cm 2) et incuber la plaque pendant une nuit (h/n) dans un incubateur de CO².
11. Décongeler un flacon de CSEm cryoconservés (1 x 10⁶) dans un milieu CM+/+ 2i.
12. Ensemencer la suspension de CSEm sur une plaque prélavée de 12 puits avec des MEF dans 1 mL de milieu CM+/+ 2i et transférer la plaque dans un incubateur à CO₂ . Rafraîchir le milieu tous les jours.
13. À 70% de confluence, laver les colonies de CSEm avec DPBS. Ajouter 150 μL de tampon TVP chaud 10x et incuber à TA pendant 30 s pour initier la dissociation enzymatique.
14. Retirer délicatement le tampon TVP, remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu CM+/+ 2i et dissocier les colonies en cellules simples par pipetage doux.
15. Passage des cellules en les transférant dans une nouvelle plaque de culture cellulaire à 12 puits avec MEF (rapport de fractionnement: 1: 3-1: 5). Mélanger délicatement pour répartir les cellules et incuber dans un incubateur de CO₂ .
16. Rafraîchir le milieu de culture (2-3 mL) et observer quotidiennement la croissance et la morphologie cellulaires. Répétez la transmission en série à 70 % de confluence tous les 2 jours. Passez au milieu CM+/+ pendant deux passages avant d’initier la différenciation cellulaire.

2. Formation d’EB dans la goutte suspendue

1. Préparer le milieu de différenciation du mésoderme frais en complétant le milieu CM+/- avec le facteur de croissance basique des fibroblastes (FGFb) (50 ng · mL-1) et avec la protéine morphogénétique osseuse 4 (BMP-4) (5 ng · ^mL-1) et le maintenir à 4 °C jusqu’à utilisation.
2. Enduisez un puits de la plaque de culture cellulaire à 6 puits avec 500 μL de solution de gélatine à 0,1% et placez-le dans un incubateur de CO₂ pendant 30 min.
3. Laver les plaques enrobées de gélatine avec du PBS et ajouter 500 μL de milieu CM+/-.
4. Pour obtenir une population pure de CSEm, trypsiniser la plaque de culture cellulaire avec un tampon TVP 10x pendant 30 s à TA, remettre les cellules en suspension dans un milieu de différenciation mésodermique de 1 mL, puis les transférer dans la plaque à 6 puits recouverte de gélatine pendant 30 minutes permettant aux MEF de se fixer pendant que les CSEm restent en suspension.
5. Recueillir la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 ml et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer et d’un colorant bleu de trypan pour une exclusion des cellules vivantes / mortes.
6. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à TA. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans le milieu de différenciation du mésoderme pour atteindre 4,55 x 10⁴ cellules par mL.
7. Remplissez le fond des boîtes en polystyrène à faible fixation de 94 mm avec 15 ml d’eau stérile.
   REMARQUE : Quatre boîtes contenant des gouttes suspendues (1,6 x 10⁵ cellules dans 3,52 mL de milieu) seront nécessaires pour tester une condition particulière à l’aide du test d’angiogenèse germinative 3D.
8. Transférer la suspension cellulaire dans un réservoir en plastique stérile et charger quatre positions d’une pipette multicanal avec 22 μL de suspension cellulaire par canal (1 x 10³ cellules par goutte de 22 μL).
9. Soulevez et inversez le couvercle de l’antenne de 94 mm et placez-le sur la surface propre de l’armoire d’écoulement avec le côté intérieur tourné vers le haut.
10. Déposez 40 gouttes de la suspension cellulaire sur la surface interne de chaque couvercle. Retournez soigneusement le couvercle sans déranger et replacez-le sur le plat, de sorte que les gouttes fassent face à l’eau.
11. Incuber les plats dans un incubateur de CO₂ . Considérez cela comme le jour 0 de différenciation. Maintenir les plaques pendant 4 jours pour former des EB.

3. Essai de compétition pour la position de la cellule de pointe

1. Culture d’une lignée de CSEm fluorescente et d’une ligne de CSm non fluorescente comme décrit précédemment¹³. À titre d’exemple, les CSm 7ACS/EYFP étiquetés en jaune et les CSm R1 sont utilisés.
2. Préparez les EB en mosaïque en mélangeant des quantités égales des deux lignes de CSEm (rapport 1:1) et incuber les boîtes suspendues dans un incubateur de CO 2 comme décrit à l’étape₂ .

4. Culture d’EB flottants pour la différenciation vasculaire

1. Avant de collecter les EB des gouttes suspendues, préparez ce qui suit.
   1. Préparer la solution de gélose à 5 % dans_H2Oet la stériliser à l’autoclavage (20 min à 120 °C).
   2. Utilisez la solution chaude de gélose à 5 % pour préparer le milieu G-MEM BHK-21 contenant 1 % de gélose et versez rapidement 3 mL dans l’une des boîtes en polystyrène de 60 mm. Laisser la gélose se solidifier pendant 1 h à TA. Conserver la vaisselle à 4 °C jusqu’à utilisation.
2. Préparer le milieu de différenciation vasculaire 2x frais en complétant le milieu CM+/- avec du FGFb (100 ng·mL-1) et du VEGF-A (50 ng·^mL-1). Conserver le milieu à 4 °C jusqu’à utilisation.
3. Recueillir les gouttes suspendues dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette P1000 et retirer le surnageant après quelques minutes de sédimentation EB.
4. Resuspendre les EB dans 3 mL de milieu de différenciation vasculaire 2x, transférer la suspension EB dans une suspension enrobée d’agar distribuer les EB de manière homogène pour éviter l’agrégation.
5. Incuber les plats dans l’incubateur de CO 2 et rafraîchir le milieu tous les₂ jours jusqu’au jour 9 en utilisant 1x milieu de différenciation vasculaire en présence de FGFb (50 ng·mL-1) et de VEGF-A (25 ng·^mL-1).
6. Vous pouvez également ajouter le facteur de croissance dérivé des plaquettes-BB (PDGF-BB) (10 ng·mL-1 le jour 4 et 5 ng·^mL-1 le jour 6 et le jour 8) au milieu de différenciation vasculaire pour favoriser la différenciation des cellules murales.

5. Analyse de cytométrie en flux

1. Recueillir les EB âgés de 9 jours dans un tube conique de 15 ml à l’aide d’une pipette P1000 et les laver une fois avec du PBS chaud.
2. Ajouter 1 mL de milieu G-MEM BHK-21 contenant 0,2 mg·^mL-1 de collagénase A et incuber les cellules dans un incubateur de CO₂ pendant 5 min.
3. Dissocier les EB en pipetant doucement de haut en bas avec une pipette P1000.
4. Arrêter l’activité de la collagénase en ajoutant 1 mL de milieu froid G-MEM BHK-21 avec 10% FBS.
5. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à TA.
6. Remettez les cellules en suspension dans 500 μL de PBS avec 2% de FBS.
7. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre Neubauer.
8. Resuspendre 400 000 cellules dans 100 μL de PBS avec 2% FBS par condition de coloration.
9. Incuber les cellules pendant 45 min à 4 °C avec les anticorps suivants : anticorps anti-souris PECAM-1 conjugué contre rat APC (clone MEC13.3) et anticorps anti-souris CD45 (clone 30-F11) ou anticorps témoins d’isotype conjugués FITC.
10. Lavez les cellules deux fois avec 1 mL de PBS contenant 2% de FBS.
11. Remettez les cellules en suspension pour atteindre une concentration finale de 5 x 10⁶ cellules par mL.
12. Filtrer les cellules à l’aide d’un tube à essai en polystyrène à fond rond, muni d’un capuchon à pression de crépine cellulaire.
13. Analyser 20 000 événements PECAM-1 (+) par cytométrie en flux.

6.3D Essai d’angiogenèse germée et coloration par immunofluorescence

1. Au jour 9, préparer un milieu germinatif en ajoutant 10% FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·mL-1), VEGF-A (25 ng·mL-1), érythropoïétine humaine recombinante (hEPO) (20 ng·mL-1), interleukine-6 humaine (IL-6) (10 ng·mL-1), 0,05 mM β-mercaptoéthanol, NEAA (1x), L-glutamine (1x), pyruvate de sodium (1x), collagène de queue de rat de type I (1,25 mg·^mL-1), et NaOH (3,1 mM) à GMEM BHK-1 milieu.
2. Pour éviter la gélification du collagène, maintenez le milieu de germination sur la glace jusqu’à utilisation.
3. Pour évaluer l’effet des molécules pro/anti-angiogéniques, ajouter le médicament ou le véhicule sélectionné au milieu de germination à la concentration sélectionnée.
4. Prélever les EB de 9 jours d’une boîte de gélose de 60 mm dans un tube conique de 15 ml (équivalent à une condition) et retirer le surnageant après quelques minutes de sédimentation.
5. Couvrir le fond d’une capsule de culture de 35 mm avec 1 mL du milieu de germination et incuber à 37 °C pendant 5 min pour induire la gélification.
6. Remettez les EB en suspension dans 2 mL de milieu de germination à froid.
7. Transférer la suspension dans la capsule de culture de 35 mm recouverte de la première couche de milieu de germination.
8. Répartissez les EB sur toute la plaque et assurez-vous qu’ils sont à égale distance les uns des autres. Incuber le plat dans un incubateur de CO₂ . La première formation de germes se produit dans les 24-48 heures.
9. Au jour 12, le gel de collagène contenant des EB est soigneusement transféré sur une lame de verre (75 x 26 mm) à l’aide d’une spatule.
10. Retirez l’excès de liquide à l’aide d’une pipette (P1000) et déshydratez le gel en plaçant une feuille de gaze de linge en nylon et des cartes filtrantes absorbantes (papier buvard gel) sur le gel. Appliquer une pression en plaçant un poids (250 g) pendant 2 min. Retirez délicatement les papiers nylon/filtres et laissez les lames sécher à l’air libre pendant 30 min à TA.
11. Lavez les lames trois fois avec PBS pendant 5 min à TA.
12. Fixer les EB à l’aide d’une solution de zinc (voir tableau des matières) à 4 °C. Vous pouvez également fixer les EB fluorescents en mosaïque avec du paraformaldéhyde (PFA) (4%) o/n à 4 °C dans l’obscurité.
13. Retirez le fixateur. Lavez les lames cinq fois avec PBS pendant 5 min à RT.
14. Perméabiliser les EB dans du PBS contenant 0,1% de Triton-X100 pendant 15 min à TA.
15. Retirer la solution de perméabilisation. Lavez les lames cinq fois avec PBS pendant 5 min.
16. Incuber les EB dans le tampon bloquant (PBS avec 2% d’albumine sérique bovine, BSA) pendant 1 h à TA.
17. Pour colorer les germes endothéliaux, utiliser un anticorps primaire anti-souris anti-PECAM-1 chez le rat (dilution de 1:100) dans le tampon de blocage o/n à 4 °C.
18. Lavez les lames cinq fois avec PBS pendant 5 min.
19. Incuber les lames avec l’anticorps secondaire anti-rat de chèvre Alexa 555 dans un tampon de blocage (dilution de 1:250) et, si nécessaire, avec un anticorps anti-α-SMA conjugué FITC dans un tampon de blocage (dilution de 1:250) pour colorer les cellules murales pendant 2 h à TA dans l’obscurité.
20. Lavez les lames trois fois avec PBS pendant 5 min et une fois avec H₂0 avant de les monter.

7. Imagerie confocale, analyse morphométrique et quantitative des germes endothéliaux EB

1. Acquérir des images haute résolution des EB immunocolorés par fusion du plan focal (empilement z) à l’aide d’un microscope confocale. Utilisez un objectif d’agrandissement 10x pour imager des EB entiers.
2. Analyser les images acquises à l’aide d’ImageJ pour évaluer la morphologie et quantifier les caractéristiques des germes endothéliaux positifs PECAM-1 selon les méthodes de quantification établies^13,14,21.
   1. Calculer le nombre moyen de germes endothéliaux par EB en comptant manuellement le nombre total de germes par EB individuel.
   2. Mesurez les longueurs de germination individuelles à l’aide de l’outil de dessin ImageJ. Définissez la base de la pousse endothéliale en commençant par la zone centrale EB et tracez manuellement une ligne jusqu’à l’extrémité de la pousse.
   3. Calculez le nombre moyen de cellules d’extrémité par germination en comptant manuellement le nombre de cellules d’extrémité par germe individuel, puis calculez la moyenne par EB.
   4. Calculez l’orientation des filopodia en déterminant manuellement l’axe de la pousse parente et mesurez l’angle aigu entre elles à l’aide de l’outil d’angle du logiciel ImageJ. Calculer le nombre de germes avec une orientation >50° et le diviser par le nombre total de germes de l’EB d’intérêt.
      REMARQUE: Les angles allaient toujours de 0° à 90°.
3. Acquérir des images haute résolution des EB immunocolorés à l’aide d’un microscope confocal. Utilisez un objectif de grossissement 40x pour réaliser des images haute résolution de pousses endothéliales uniques.
4. Quantifier la couverture vasculaire des pousses EC positives PECAM-1 entourées de MC positifs α-SMA à l’aide du logiciel ImageJ.
   1. Divisez les images fusionnées en canaux rouges et verts distincts.
   2. Convertissez les images dans sa forme binaire.
   3. Mesurer la surface cellulaire totale de la pousse occupée séparément par PECAM-1 (cellules endothéliales marquées en rouge) et par α-SMA (cellules murales marquées en vert) positives.
   4. Générez l’image fusionnée à l’aide de la fonction calculatrice d’images et de l’opérateur ET. Mesurez la surface cellulaire totale de l’image. Pour calculer la couverture, divisez la surface de l’image colocalisée par la surface de l’image binaire PECAM-1.
5. Pour analyser la compétition cellulaire pour la position des cellules endothéliales de pointe / tige des germes développés par les EB mosaïques, notez manuellement le nombre de cellules de pointe et marquez leur origine génotypique en fonction du signal de fluorescence. Calculer les valeurs moyennes par EB.

Résultats

L’aperçu du protocole du test de germination des vaisseaux sanguins est présenté à la figure 1. Des EB âgés de neuf jours dérivés de trois lignées indépendantes de CSEm 129 / Ola (Z/Red, R1 et E14) ont été dissociés enzymatiquement en cellules individuelles à l’aide de collagénase A. Les cellules ont été colorées pour PECAM-1 et analysées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) comme décrit. Toutes les lignées cellulaires présentaient une différenciation...

Discussion

Ce protocole décrit un test de germination vasculaire 3D basé sur EB en 3D impartial, robuste et reproductible, qui se prête au criblage de médicaments et de gènes modulant l’angiogenèse. Cette méthode offre des avantages par rapport à de nombreux tests bidimensionnels (2D) largement utilisés utilisant des cultures de cellules endothéliales telles que les cellules endothéliales veineuses ombilicales humaines (HUVEC) pour surveiller la migration (test de rayures latérales ou le test de chambre de Boyden)22,2...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Milipore, Merck	805740	Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
Agar Noble	Difco, BD Pharmigen	214220
Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG	Life technologies	A21434
APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3)	BD Biosciences	551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone  R35-95)	BD Biosciences	553932
Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope	ZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)	Peprotech	450-33
Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R	Beckman Coulter	392932
Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line)	Telstar	133H401001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm	Marienfeld	640211
Cell culture dishes 60 x 15mm	Corning	353802
Cell culture dishes, 35 x 10 mm	Corning	353801
Cell culture plates 12-well	Corning	3512
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	1855196
Chicken serum	Sigma-Aldrich	C5405
CHIR-99021 (CT99021) HCl	Selleckchem	S2924
Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg	Corning	354249
Collagenase A	Roche	10103586001
Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5	Leica
Cover glasses, 24 × 50 mm	Vwr	631-0146
DAPT γ?secretase inhibitor	Sigma Aldrich	D5942
DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone	BioXcell	BP0060
DC101 isotype rat IgG1	BioXcell	BP0290
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2438-5X	Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
DPBS (10x), no calcium, no magnesium	Gibco, Thermofisher scientific	14200067
EDTA 40 mM	Gibco, Thermofisher scientific	15575-038
Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum	Gibco, Thermofisher scientific	16141-079	Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year
Eppendorf Microcentrifuge 5415R	Eppendorf AG	Z605212
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL)	Roche	11120166001
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10? units  1 mL)	Milipore, Merck	ESG1107
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-0ne	227270
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200	Greiner Bio-One	739288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10	Greiner Bio-One	771288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000	Greiner Bio-One	740288
FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4)	Sigma Aldrich	F3777
FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103107
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530)	Biolegend	400605
Fluorscent mounting media	DAKO	S3023
Gascompress	Cutisoft	45846
Gauze Cutisoft 10 x 10 cm	Bsn Medical	45844_00
Gel blotting paper, Grade GB003	Whatman	WHA10547922
Gelatin solution, type B	Sigma-Aldrich	G1393-100 ml
Glasgow's MEM (GMEM)	Gibco, Thermofisher scientific	21710082
IHC Zinc Fixative	BD Pharmigen	550523
IncuSafe CO2 Incubator	PHCBi	MCO-170AICUV-PE
Interleukin-6, human (hIL-6)	Roche	11138600001
L-Glutamine 200 mM	Gibco, Thermofisher scientific	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Gibco, Thermofisher scientific	11140035
Microscope slide box	Kartell Labware	278
Microscope slide, Starfrost	Knittel glass	VS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00099064
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer	Qiagen	QT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer	Qiagen	QT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00114576
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts  (2 M)	Gibco, Thermofisher scientific	A24903	Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely
Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)	ATCC	SCRC-1033	Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)].
Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+			Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)].
Mouse embryonic stem cells line E14			Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001).
Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011)	ATCC	SCRC-1011	Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)].
Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola)			Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)].
NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer	Thermo Fischer Scientific	ND-1000
PD0325901	Selleckchem	S1036
PDGF-BB, Recombinant Human	Peprotech	100-14B
Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse	BD Biosciences	550274
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco, Thermofisher scientific	15140122
Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile	Greiner Bio-One	633181
Pipetboy acu 2	Integra-Biosciences	155 019
Pipetman G Multichannel P8 x 200G	Gilson	F144072
Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G	Gilson	F167360
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D Systems	314-BP
RNeasy Plus mini Kit	QIAGEN	74134
Serological pipettes, 10 mL	Greiner Bio-One	607 180
Serological pipettes, 25 mL	Greiner Bio-One	760 180
Serological pipettes, 5 mL	Greiner Bio-One	606 180
Sodium hydroxide (NaOH)	Merck	106498
Sodium pyruvate 100 mM	Gibco, Thermofisher scientific	11360039
Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap	Corning	352235
Thermal cycler, T100	Biorad	1861096
Triton X-100 (BioXtra)	Sigma Aldrich	T9284
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco, Thermofisher scientific	15250061
Trypsin (2.5%)	Gibco, Thermofisher scientific	15090046
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL	Corning	430758
VEGFA165 , recombinant murine	Peprotech	450-32
Water, Sterile	Fresenius-Kabi	B230531
Waterbath, Lab-Line Digital	Thermo Fischer Scientific	18052A