JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu tahlil, filizlenen anjiyogenezi in vitro olarak kontrol eden biyolojik süreçleri analiz etmek için 3D-kollajen jel içinde kültürlenmiş embriyoid cisimlere farklılaştırılmış fare embriyonik kök hücrelerini kullanır. Bu teknik, ilaçları test etmek, hastalıkları modellemek ve embriyonik olarak ölümcül olan delesyonlar bağlamında spesifik genleri incelemek için uygulanabilir.

Özet

İndüklenmiş pluripotent kök hücreler (iPSC) ve gen düzenleme teknolojilerindeki son gelişmeler, fenotipik ilaç keşif (PDD) programları için yeni insan hücresi tabanlı hastalık modellerinin geliştirilmesine olanak sağlamaktadır. Her ne kadar bu yeni cihazlar insanlarda araştırma ilaçlarının güvenliğini ve etkinliğini daha doğru bir şekilde tahmin edebilse de, kliniğe gelişimleri hala memeli verilerine, özellikle de fare hastalığı modellerinin kullanımına dayanmaktadır. İnsan organoid veya çip üzerinde organ hastalığı modellerine paralel olarak, ilgili in vitro fare modellerinin geliştirilmesi, türler ile in vivo ve in vitro koşullar arasındaki doğrudan ilaç etkinliğini ve güvenlik karşılaştırmalarını değerlendirmek için karşılanmamış bir ihtiyaçtır. Burada, embriyoid cisimlere (EB'ler) farklılaşmış fare embriyonik kök hücrelerini kullanan bir vasküler filizlenme testi tanımlanmıştır. 3D-kollajen jel üzerine kültürlenen vaskülarize EB'ler, filizlenen anjiyogenez adı verilen bir süreç olan genişleyen yeni kan damarları geliştirir. Bu model, endotel ucu hücre seçimi, endotel hücre göçü ve proliferasyonu, hücre rehberliği, tüp oluşumu ve duvar hücresi alımı dahil olmak üzere önceden var olan bir vasküler ağdan kan damarlarının in vivo filizlenen anjiyogenez-oluşumunun temel özelliklerini özetlemektedir. Anjiyogenezi modüle eden ilaçların ve genlerin taranmasına uygundur ve insan iPSC teknolojilerine dayanan yakın zamanda tarif edilen üç boyutlu (3B) vasküler tahlillerle benzerlikler gösterir.

Giriş

Son otuz yılda, hedefe dayalı ilaç keşfi (TDD), ilaç endüstrisi tarafından ilaç keşfinde yaygın olarak kullanılmaktadır. TDD, bir hastalıkta önemli bir rol oynayan tanımlanmış bir moleküler hedef içerir ve nispeten basit hücre kültürü sistemlerinin geliştirilmesine ve ilaç taraması için okumalara dayanır1. TDD programlarında kullanılan en tipik hastalık modelleri, kanser hücreleri veya yapay ortamlarda yetiştirilen ölümsüzleştirilmiş hücre hatları ve fizyolojik olmayan substratlar gibi geleneksel hücre kültürü yöntemlerini içerir. Bu modellerin birçoğu başarılı ilaç adaylarını tanımlamak için uygun araçlar sağlamış olsa da, bu tür sistemlerin kullanımı, zayıf hastalık alaka düzeyleri nedeniyle sorgulanabilirolabilir 2.

Çoğu hastalık için, altta yatan mekanizmalar gerçekten karmaşıktır ve çeşitli hücre tipleri, bağımsız sinyal yolları ve çoklu gen kümelerinin genellikle spesifik bir hastalık fenotipine katkıda bulunduğu bulunmuştur. Bu, birincil nedenin tek bir gendeki mutasyon olduğu kalıtsal hastalıklar için de geçerlidir. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojilerinin ve gen düzenleme araçlarının son zamanlarda ortaya çıkmasıyla, in vivo insan karmaşıklığını daha iyi özetleyebilecek 3D organoidler ve çip üzerinde organ hastalığı modelleri üretmek artık mümkündür 3,4. Bu tür teknolojilerin gelişimi, fenotipik ilaç keşif (PDD) programlarına olan ilginin yeniden canlanmasıyla ilişkilidir1. PDD, belirli bir ilaç hedefinin kimliği bilgisine veya hastalıktaki rolü hakkında bir hipoteze dayanmadıkları için ampirik tarama ile karşılaştırılabilir. PDD yaklaşımı, birinci sınıf ilaçların keşfine güçlü bir şekilde katkıda bulunmak için giderek daha fazla tanınmaktadır5. İnsan organoid ve çip üzerinde organ teknolojilerinin gelişimi henüz emekleme aşamasında olduğundan, iPSC modellerinin (yenilikçi görüntüleme ve makine öğrenme araçları6,7 ile tamamlanan) yakın gelecekte, TDD yaklaşımının zayıf üretkenliğinin üstesinden gelmek için ilaç taraması ve ilgili PDD programları için çoklu yeni karmaşık hücre tabanlı hastalık modelleri sağlaması beklenmektedir8, 9.

İnsan organoid ve çip üzerinde organ modelleri, hastalık karmaşıklığı ve yeni ilaçların tanımlanması konusunda önemli bilgiler sağlayabilirken, ilaçları yeni klinik uygulamaya getirmek, etkinliklerini ve güvenliklerini değerlendirmek için hayvan modellerinden elde edilen verilere de güçlü bir şekilde dayanmaktadır. Bunlar arasında genetiği değiştirilmiş fareler kesinlikle en çok tercih edilen memeli modelleridir. Memeliler için nispeten kısa bir üretim süresine sahip olduklarından, insan hastalıklarına benzer birçok fenotipe sahip olduklarından ve genetik olarak kolayca manipüle edilebildiklerinden birçok avantaja sahiptirler. Bu nedenle ilaç keşif programlarında yaygın olarak kullanılmaktadırlar10. Bununla birlikte, fareler ve insanlar arasındaki boşluğu kapatmak, önemli bir zorluk olmaya devam etmektedir11. İnsan organoid ve çip üzerinde organ modellerine eşdeğer in vitro fare modellerinin geliştirilmesi, in vivo fare ve in vitro insan verileri arasında doğrudan ilaç etkinliği ve güvenlik karşılaştırmalarına izin vereceği için bu boşluğu en azından kısmen doldurabilir .

Burada, fare embriyoid cisimlerinde (EB'ler) vasküler filizlenme testi tanımlanmıştır. Kan damarları endotel hücrelerinden (damar duvarlarının iç astarı), duvar hücrelerinden (vasküler düz kas hücreleri ve perisitler)12 oluşur. Bu protokol, fare embriyonik kök hücrelerinin (mESC'ler), de novo endotel hücresini ve duvar hücresi farklılaşmasını özetleyen asılı damlacıklar kullanılarak vaskülarize EB'lere farklılaşmasına dayanmaktadır13,14. Fare ESC'leri izole günden itibaren kültürde kolayca kurulabilir 3.5 Farklı genetik geçmişe sahip fare blastosistleri15. Ayrıca klonal analiz, soy izleme için olanaklar sağlar ve hastalık modelleri oluşturmak için genetik olarak kolayca manipüle edilebilir13,16.

Kan damarları tüm organları beslediğinden, hepsi olmasa da birçok hastalığın mikrovaskülatürdeki değişikliklerle ilişkili olması şaşırtıcı değildir. Patolojik durumlarda, endotel hücreleri aktif bir durumu benimseyebilir veya duvar hücresi ölümü veya kan damarlarından uzaklaşma ile sonuçlanan işlevsiz hale gelebilir. Bunlar aşırı anjiyogenez veya damar nadirliği ile sonuçlanabilir, anormal kan akışını ve immün hücre ekstravazasyonuna yol açan kusurlu kan damarı bariyerini ve inflamasyonu indükleyebilir12,17,18,19. Bu nedenle, kan damarlarını modüle eden ilaçların geliştirilmesine yönelik araştırmalar yüksektir ve terapötik hedefleme için çoklu moleküler oyuncular ve kavramlar zaten tanımlanmıştır. Bu bağlamda, açıklanan protokol, endotel ucu ve sap hücresi seçimi, endotel hücre göçü ve proliferasyonu, endotel hücre rehberliği, tüp oluşumu ve duvar hücresi alımı dahil olmak üzere in vivo filizlenen anjiyogenezin temel özelliklerini özetlediği için hastalık modelleri oluşturmak ve ilaç testi için özellikle uygundur. Ayrıca, insan iPSC teknolojilerine dayanan yakın zamanda tarif edilen 3D vasküler tahlillerle benzerlikler göstermektedir20.

Protokol

1. Medya hazırlığı ve mESC kültürü

  1. %10 (vol/vol) ısı ile aktive edilmiş Fetal Sığır Serumu (FBS), 0,05 mM β-merkaptoetanol, 1x esansiyel olmayan amino asitler (NEAA 1x), 2 mM L-glutamin ve 1 mM sodyum piruvat içeren 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) besiyeri kullanarak koşullandırılmış ortam +/- (CM+/-) hazırlayın.
  2. Lösemi İnhibitör Faktörü (LIF) (1.500 U / mL) ve 0.1 mM β-merkaptoetanol içeren CM + / - ortamını kullanarak şartlandırılmış ortam +/+ (CM + / +) hazırlayın.
  3. 1 μM PD0325901 ve 3 μM CHIR99021 ile ek CM+/+ ortamını kullanarak iki inhibitör (CM +/+ 2i) varlığında şartlandırılmış ortam +/+ hazırlayın.
  4. Kalsiyum ve magnezyum (DPBS) içermeyen 500 mL fosfat tamponlu salin içinde 25 mL önceden ısıtılmış% 2 jelatin çözeltisini karıştırarak% 0.1 jelatin çözeltisi hazırlayın.
  5. Tripsin (%2,5) ile TVP 1x (%9,5 10x DPBS, 1 mM EDTA, %0,01 tavuk serumu, %0,01 Tripsin (%2,5)H2O) (1:10 oranı, hacim/hacim) karıştırarak 10x Tripsin Versene Fosfat (TVP 10x) tamponu hazırlayın.
    NOT: Tüm çözeltileri 0,22 μm gözenekli bir filtreyle filtreleyin. Kültür ortamını uzun süre -20 ° C'de saklayın ve diğer reaktifleri 3 haftaya kadar 4 ° C'de tutun ( bkz.
  6. İki adet 12 delikli hücre kültürü plakasını% 0.1 jelatin çözeltisi (kuyucuk başına 500 μL) ile kaplayın ve bir CO 2 inkübatöründe (37 ° C,% 5 CO2, nemli atmosfer) 30 dakika boyunca inkübe edin.
  7. Jelatin kaplı plakaları PBS ile yıkayın ve 500 μL CM+/- ortam ekleyin.
  8. İki şişe 1 x 106 kriyokorunmuş ışınlanmış fare embriyonik fibroblastlarını (MEF'ler) 37 ° C'de çözün ve hücre süspansiyonunu 5 mL CM + / - ortam içeren konik bir tüpe aktarın.
  9. Hücreleri oda sıcaklığında (RT) 5 dakika boyunca 200 x g'de santrifüj edin. Ortamı aspire edin ve hücre peletini mL başına 1.67 x 105 hücre konsantrasyonunda 12 mL CM + / - ortamda yavaşça askıya alın.
  10. 500 μL MEF süspansiyonunu 12 delikli bir hücre kültürü plakasına (cm2 başına 2,4 x 105 hücre) tohumlayın ve plakayı bir CO2 inkübatöründe gece boyunca (o / n) inkübe edin.
  11. Bir şişe kriyokorunmuş mESC'yi (1 x 106) CM+/+ 2i ortamında çözün.
  12. mESC süspansiyonunu MEF'lerle önceden yıkanmış 12 kuyucuklu bir plakaya 1 mL CM+/+ 2i ortamında tohumlayın ve plakayı bir CO2 inkübatörüne aktarın. Ortamı günlük olarak yenileyin.
  13. % 70 akıcılıkta, mESC kolonilerini DPBS ile yıkayın. 150 μL sıcak 10x TVP tamponu ekleyin ve enzimatik ayrışmayı başlatmak için RT'de 30 saniye inkübe edin.
  14. TVP tamponunu dikkatlice çıkarın, hücreleri 1 mL CM+/+ 2i ortamında yeniden askıya alın ve kolonileri nazik pipetleme ile tek hücrelere ayırın.
  15. Hücreleri MEF'lerle yeni bir 12 delikli hücre kültürü plakasına aktararak geçirin (bölme oranı: 1: 3-1: 5). Hücreleri dağıtmak için yavaşça karıştırın ve bir CO2 inkübatöründe inkübe edin.
  16. Kültür ortamını (2-3 mL) yenileyin ve hücre büyümesini / morfolojisini günlük olarak gözlemleyin. Seri geçişi her 2 günde bir% 70 akıcılıkta tekrarlayın. Hücre farklılaşmasını başlatmadan önce iki pasaj için CM+/+ ortamına geçin.

2. Asılı damlada EB oluşumu

  1. CM+/- besiyerine bazik Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF) (50 ng·mL-1) ve Kemik Morfogenetik Protein 4 (BMP-4) (5 ng·mL-1) takviyesi yaparak taze mezoderm diferansiyasyon ortamı hazırlayın ve kullanıma kadar 4 °C'de tutun.
  2. 6 delikli hücre kültürü plakasının bir kuyusunu 500 μL% 0.1 jelatin çözeltisi ile kaplayın ve 30 dakika boyunca bir CO2 inkübatörüne yerleştirin.
  3. Jelatin kaplı plakaları PBS ile yıkayın ve 500 μL CM+/- ortam ekleyin.
  4. Saf bir mESC popülasyonu elde etmek için, hücre kültürü plakasını RT'de 30 s boyunca 10x TVP tamponu ile deneyin, hücreleri 1 mL mezoderm farklılaşma ortamında yeniden askıya alın ve daha sonra 30 dakika boyunca jelatin kaplı 6 delikli plakaya aktarın, böylece mESC'ler süspansiyonda kalırken MEF'lerin yapışmasına izin verin.
  5. Hücre süspansiyonunu 50 mL'lik bir konik tüpte toplayın ve canlı/ölü hücre dışlaması için Neubauer hemositometresi ve Trypan mavisi boya kullanarak hücreleri sayın.
  6. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini mezoderm farklılaşma ortamında mL başına 4.55 x 104 hücreye ulaşacak şekilde yeniden askıya alın.
  7. 94 mm düşük ataşmanlı polistiren tabakların tabanını 15 mL steril su ile doldurun.
    NOT: 3D filizlenen anjiyogenez testi kullanılarak belirli bir durumu test etmek için asılı damla içeren dört kap (3.52 mL ortamda 1.6 x 105 hücre) gerekecektir.
  8. Hücre süspansiyonunu steril bir plastik hazneye aktarın ve kanal başına 22 μL hücre süspansiyonu (22 μL damla başına 1 x 103 hücre) ile çok kanallı bir pipetin dört pozisyonunu yükleyin.
  9. 94 mm'lik çanağın kapağını kaldırıp ters çevirin ve iç tarafı yukarı bakacak şekilde akış kabininin temiz yüzeyine yerleştirin.
  10. Her kapağın iç yüzeyine 40 damla hücre süspansiyonu koyun. Kapağı rahatsız etmeden dikkatlice ters çevirin ve tekrar kabın üzerine yerleştirin, böylece damlalar suya bakacaktır.
  11. Bulaşıkları bir CO2 inkübatöründe inkübe edin. Bunu farklılaşma günü 0 olarak düşünün. EB'leri oluşturmak için plakaları 4 gün boyunca koruyun.

3. Uç hücre pozisyonu için rekabet testi

  1. Kültür daha önce tarif edildiği gibi bir floresan ve bir floresan olmayan mESC hattı13. Örnek olarak, sarı renkle etiketlenmiş 7ACS/EYFP mESC'ler ve R1 mESC'ler kullanılmıştır.
  2. İki mESC hattının eşit miktarlarını (1: 1 oranı) karıştırarak mozaik EB'ler hazırlayın ve 2. adımda açıklandığı gibi asılı damla bulaşıkları bir CO2 inkübatöründe inkübe edin.

4. Vasküler farklılaşma için yüzen EBs kültürü

  1. EB'leri asılı damlalardan toplamadan önce, aşağıdakileri hazırlayın.
    1. H2O'da %5 agarçözeltisi hazırlayın ve otoklavlama ile sterilize edin (120 °C'de 20 dakika).
    2. % 1 agar içeren G-MEM BHK-21 ortamını hazırlamak için ılık% 5 agar çözeltisini kullanın ve 60 mm polistiren tabaklardan birine hızlı bir şekilde 3 mL dökün. Agarın RT'de 1 saat katılaşmasına izin verin. bulaşıkları kullanılana kadar 4 ° C'de saklayın.
  2. CM+/- besiyerine bFGF (100 ng·mL-1) ve VEGF-A (50 ng·mL-1) ekleyerek taze 2x vasküler farklılaşma ortamı hazırlayın. Ortamı kullanıma kadar 4 °C'de saklayın.
  3. Asılı damlaları bir P1000 pipet kullanarak 15 mL'lik bir konik tüpte toplayın ve birkaç dakikalık EB çökelmesinden sonra süpernatantı çıkarın.
  4. EB'leri 3 mL'lik 2x vasküler farklılaşma ortamında yeniden askıya alın, EB süspansiyonunu agar kaplı bir kaba aktarın ve toplanmayı önlemek için EB'leri homojen olarak dağıtın.
  5. Bulaşıkları CO 2 inkübatöründe inkübe edin ve bFGF (50 ng · mL-1) ve VEGF-A (25 ng · mL-1) varlığında 1x vasküler farklılaşma ortamı kullanarak 9. güne kadar her2 günde bir ortamı yenileyin.
  6. Alternatif olarak, duvar hücresi farklılaşmasını teşvik etmek için vasküler farklılaşma ortamına Trombosit Türetilmiş Büyüme Faktörü-BB (PDGF-BB) (4. günde 10 ng · mL-1 ve 6. ve 8. günlerde 5 ng · mL-1) ekleyin.

5. Akış sitometri analizi

  1. 9 günlük EB'leri P1000 pipet kullanarak 15 mL'lik konik bir tüpte toplayın ve bir kez ılık PBS ile yıkayın.
  2. 0.2 mg · mL-1 kollajenaz A içeren 1 mL G-MEM BHK-21 ortamı ekleyin ve hücreleri bir CO2 inkübatöründe 5 dakika boyunca inkübe edin.
  3. Bir P1000 pipet ile yavaşça yukarı ve aşağı pipetleme yaparak EB'lerin ayrışmasını sağlayın.
  4. % 10 FBS ile 1 mL soğuk G-MEM BHK-21 ortamı ekleyerek kollajenaz aktivitesini durdurun.
  5. RT'de 5 dakika boyunca hücreleri 200 x g'de santrifüj edin.
  6. 500 μL PBS'deki hücreleri% 2 FBS ile yeniden askıya alın.
  7. Neubauer hemositometresi kullanarak hücreleri sayın.
  8. Boyama koşulu başına %2 FBS ile 100 μL PBS'de 400.000 hücreyi yeniden askıya alın.
  9. Hücreleri 4 ° C'de 45 dakika boyunca aşağıdaki antikorlarla inkübe edin: APC konjuge sıçan anti-fare PECAM-1 antikoru (klon MEC13.3) ve FITC konjuge sıçan anti-fare CD45 (klon 30-F11) veya izotip kontrol antikorları.
  10. Hücreleri% 2 FBS içeren 1 mL PBS ile iki kez yıkayın.
  11. mL başına 5 x 106 hücrelik nihai konsantrasyona ulaşmak için hücreleri yeniden askıya alın.
  12. Hücreleri, hücre süzgeci çıtçıtlı kapağı olan yuvarlak tabanlı bir polistiren test tüpü kullanarak filtreleyin.
  13. Akış sitometrisi ile 20.000 PECAM-1 (+) olayını analiz edin.

6.3D filizlenen anjiyogenez testi ve immünofloresan boyama

  1. 9. günde,% 10 FBS (hacim / hacim), bFGF (50 ng · mL-1), VEGF-A (25 ng · mL-1), insan rekombinant Eritropoietin (hEPO) (20 ng · mL-1), insan interlökin-6 (IL-6) (10 ng · mL-1), 0.05 mM β-merkaptoetanol, NEAA (1x), L-glutamin (1x), sodyum piruvat (1x), tip I sıçan kuyruğu kollajeni (1.25 mg · mL-1), ekleyerek filizlenen bir ortam hazırlayın, ve NaOH (3.1 mM) GMEM BHK-1 ortamına.
  2. Kollajen jelleşmesini önlemek için, filizlenen ortamı kullanıma kadar buz üzerinde tutun.
  3. Pro/anti-anjiyojenik moleküllerin etkisini değerlendirmek için, seçilen ilacı veya aracı seçilen konsantrasyonda filizlenen ortama ekleyin.
  4. 15 mL'lik bir konik tüpte (bir koşula eşdeğer) 60 mm'lik bir agar kabından 9 günlük EB'leri toplayın ve birkaç dakikalık çökeltmeden sonra süpernatantı çıkarın.
  5. 35 mm'lik bir kültür kabının tabanını 1 mL filizlenme ortamı ile örtün ve jelleşmeyi indüklemek için 5 dakika boyunca 37 ° C'de inkübe edin.
  6. EB'leri 2 mL soğuk filizlenme ortamında yeniden askıya alın.
  7. Süspansiyonu, ilk filizlenme ortamı katmanı ile kaplanmış 35 mm'lik kültür kabına aktarın.
  8. EB'leri plakanın her yerine dağıtın ve birbirlerinden eşit mesafede olduklarından emin olun. Çanağı bir CO2 inkübatöründe inkübe edin. İlk filiz oluşumu 24-48 saat içinde gerçekleşir.
  9. 12. günde, EB'leri içeren kollajen jeli, bir spatula kullanılarak dikkatlice bir cam slayta (75 x 26 mm) aktarılır.
  10. Fazla sıvıyı bir pipet (P1000) kullanarak çıkarın ve jelin üzerine bir gazlı bez tabakası naylon keten ve emici filtre kartları (jel lekeleme kağıdı) yerleştirerek jeli kurutun. 2 dakika boyunca bir ağırlık (250 g) koyarak basınç uygulayın. Naylon / filtre kağıtlarını dikkatlice çıkarın ve slaytların RT'de 30 dakika boyunca kurumasını bekleyin.
  11. Slaytları RT'de 5 dakika boyunca PBS ile üç kez yıkayın.
  12. EB'leri çinko çözeltisi kullanarak sabitleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) o / n 4 ° C'de. Alternatif olarak, mozaik floresan EB'leri karanlıkta 4 ° C'de Paraformaldehit (PFA) (% 4) o / n ile sabitleyin.
  13. Fiksatifi çıkarın. Slaytları RT'de 5 dakika boyunca PBS ile beş kez yıkayın.
  14. PBS'deki EB'leri RT'de 15 dakika boyunca %0.1 Triton-X100 içerecek şekilde geçirgenleştirin.
  15. Geçirgenleştirme çözeltisini çıkarın. Slaytları PBS ile beş kez 5 dakika boyunca yıkayın.
  16. EB'leri RT'de 1 saat boyunca bloke edici tamponda (% 2 Sığır Serum Albümini ile PBS, BSA) inkübe edin.
  17. Endotel filizlerini boyamak için, 4 °C'de tampon o / n'yi bloke etmek için bir sıçan anti-fare anti-PECAM-1 primer antikoru (1:100 seyreltme) kullanın.
  18. Slaytları PBS ile beş kez 5 dakika boyunca yıkayın.
  19. Slaytları, bloke edici tamponda keçi anti-sıçan Alexa 555 sekonder antikoru ile inkübe edin (1:250 seyreltme) ve gerektiğinde karanlıkta RT'de 2 saat boyunca duvar hücrelerini boyamak için bloke tamponda FITC-konjuge anti-α-SMA antikoru (1:250 seyreltme) ile.
  20. Slaytları monte etmeden önce PBS ile üç kez 5 dakika ve bir kez H20 ile yıkayın.

7. EB endotel filizlerinin konfokal görüntüleme, morfometrik ve kantitatif analizi

  1. Konfokal mikroskop kullanarak odak düzlemi birleştirme (z-istifleme) ile immün boyalı EB'lerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde edin. EB'lerin tamamını görüntülemek için 10x büyütme hedefini kullanın.
  2. Morfolojiyi değerlendirmek ve PECAM-1 pozitif endotel filizlerinin özelliklerini belirlenmiş niceleme yöntemlerine göre ölçmek için ImageJ kullanılarak elde edilen görüntüleri analiz edin13,14,21.
    1. EB'ler başına ortalama endotel filizi sayısını, EB'ler başına toplam filiz sayısını manuel olarak sayarak hesaplayın.
    2. ImageJ çizim aracını kullanarak tek tek filiz uzunluklarını ölçün. EB çekirdek alanından başlayarak endotel filizinin tabanını tanımlayın ve filiz ucu bitene kadar manuel olarak bir çizgi çizin.
    3. Tek tek filiz başına uç hücresi sayısını manuel olarak sayarak filiz başına ortalama uç hücresi sayısını hesaplayın ve ardından EB başına ortalamayı hesaplayın.
    4. Ana filizin eksenini manuel olarak belirleyerek filopodia yönünü hesaplayın ve ImageJ yazılım açısı aracını kullanarak aralarındaki keskin açıyı ölçün. Filizlerin sayısını >50 ° 'lik bir yönelimle hesaplayın ve ilgilenilen EB'nin toplam filiz sayısına bölün.
      NOT: Açılar her zaman 0° ile 90° arasında değişmiştir.
  3. Konfokal mikroskop kullanarak immün boyalı EB'lerin yüksek çözünürlüklü görüntülerini elde edin. Tek endotel filizlerinin yüksek çözünürlüklü görüntülerini gerçekleştirmek için 40x büyütme hedefini kullanın.
  4. ImageJ yazılımını kullanarak α-SMA pozitif MC'lerle çevrili PECAM-1 pozitif EC filizlerinin kap kapsamını ölçün.
    1. Birleştirilen görüntüleri ayrı kırmızı ve yeşil kanallara bölün.
    2. Görüntüleri ikili biçimine dönüştürün.
    3. PECAM-1 (kırmızı ile etiketlenmiş endotel hücreleri) ve α-SMA (yeşil ile etiketlenmiş duvar hücreleri) pozitif hücreler tarafından ayrı ayrı işgal edilen filizin toplam hücresel alanını ölçün.
    4. Görüntü hesaplayıcı işlevini ve AND işlecini kullanarak birleştirilmiş görüntüyü oluşturun. Görüntünün toplam hücresel alanını ölçün. Kapsama alanını hesaplamak için, birlikte yerelleştirilmiş görüntünün alanını PECAM-1 ikili görüntüsünün alanına bölün.
  5. Mozaik EB'ler tarafından geliştirilen filizlerin endotel ucu / sap hücresi pozisyonu için hücre rekabetini analiz etmek için, uç hücrelerinin sayısını manuel olarak puanlayın ve floresan sinyaline dayanarak genotipik kökenlerini işaretleyin. EB başına ortalama değerleri hesaplayın.

Sonuçlar

Filizlenme tahlilinin kan damarı testine genel bakışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Üç bağımsız 129 / Ola mESC hattından (Z / Red, R1 ve E14) türetilen dokuz günlük EB'ler, kollajenaz A kullanılarak enzimatik olarak tek hücrelere ayrıştırıldı. Tüm hücre hatları sağlam endotel farklılaşması sergiledi ve endotel hücrelerine farklılaşma yeteneklerinde hiçbir fark gözlenmedi. Tüm hücre hatları endotel hücrelerinin yaklaşık% 10.5 ±% 1.3'ünü üretti (

Tartışmalar

Bu protokol, anjiyogenezi modüle eden ilaçların ve genlerin taranmasına uygun, tarafsız, sağlam ve tekrarlanabilir bir 3D EB tabanlı vasküler filizlenme testini tanımlar. Bu yöntem, göçü izlemek için İnsan Göbek Damarı Endotel Hücreleri (HUVEC'ler) gibi endotel hücre kültürlerini kullanan yaygın olarak kullanılan birçok iki boyutlu (2D) tahlile göre avantajlar sunar (lateral çizik testi veya Boyden odası tahlili)22,23 veya proliferasyonu (hücre sayısını sayma, DNA sentezinin tespiti,

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.

Teşekkürler

Bu çalışma, Nederlandse organisatie voor gezondheidsonderzoek en zorginnovatie (ZonMW 446002501), Health Holland (LSHM19057-H040), Leading Fellows Programme Marie Skłodowska-Curie COFUND ve Association Maladie de Rendu-Osler (AMRO) tarafından desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolMilipore, Merck805740Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
Agar NobleDifco, BD Pharmigen214220
Alexa Fluo 555 goat anti rat IgGLife technologiesA21434
APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3)BD Biosciences551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone  R35-95)BD Biosciences553932
Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscopeZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)Peprotech450-33
Benchtop Centrifuge, Allegra X-15RBeckman Coulter392932
Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line)Telstar133H401001
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA9418
Cell counting chamber, Buerker, 0.100mmMarienfeld640211
Cell culture dishes 60 x 15mmCorning353802
Cell culture dishes, 35 x 10 mmCorning353801
Cell culture plates 12-wellCorning3512
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection SystemBiorad1855196
Chicken serumSigma-AldrichC5405
CHIR-99021 (CT99021) HClSelleckchemS2924
Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mgCorning354249
Collagenase ARoche10103586001
Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5Leica
Cover glasses, 24 × 50 mmVwr631-0146
DAPT γ?secretase inhibitorSigma AldrichD5942
DC101 anti mouse VEGFR-2 CloneBioXcellBP0060
DC101 isotype rat IgG1BioXcellBP0290
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD2438-5XBiohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
DPBS (10x), no calcium, no magnesiumGibco, Thermofisher scientific14200067
EDTA 40 mMGibco, Thermofisher scientific15575-038
Embryonic stem-cell Fetal Bovine SerumGibco, Thermofisher scientific16141-079Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year
Eppendorf Microcentrifuge 5415REppendorf AG Z605212
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL)Roche11120166001
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10? units  1 mL)Milipore, MerckESG1107
Falcon tubes 15 mLGreiner Bio-One188271
Falcon tubes 50 mLGreiner Bio-0ne227270
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200Greiner Bio-One739288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10Greiner Bio-One771288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000Greiner Bio-One740288
FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4)Sigma AldrichF3777
FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)Biolegend103107
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530)Biolegend400605
Fluorscent mounting mediaDAKOS3023
GascompressCutisoft45846
Gauze Cutisoft 10 x 10 cmBsn Medical45844_00
Gel blotting paper, Grade GB003WhatmanWHA10547922
Gelatin solution, type BSigma-AldrichG1393-100 ml
Glasgow's MEM (GMEM)Gibco, Thermofisher scientific21710082
IHC Zinc FixativeBD Pharmigen550523
IncuSafe CO2 IncubatorPHCBiMCO-170AICUV-PE
Interleukin-6, human (hIL-6)Roche11138600001
L-Glutamine 200 mMGibco, Thermofisher scientific25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)Gibco, Thermofisher scientific11140035
Microscope slide boxKartell Labware278
Microscope slide, StarfrostKnittel glassVS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00099064
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect PrimerQiagenQT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer AssayQiagenQT00114576
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts  (2 M)Gibco, Thermofisher scientificA24903Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely
Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)ATCCSCRC-1033Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)].
Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)].
Mouse embryonic stem cells line E14Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001).
Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011)ATCCSCRC-1011Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)].
Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola)Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)].
NanoDrop 1000 UV/VIS SpectrophotometerThermo Fischer ScientificND-1000
PD0325901SelleckchemS1036
PDGF-BB, Recombinant HumanPeprotech100-14B
Pecam-1 antibody, Rat Anti-MouseBD Biosciences550274
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)Gibco, Thermofisher scientific15140122
Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterileGreiner Bio-One633181
Pipetboy acu 2Integra-Biosciences155 019
Pipetman G Multichannel P8 x 200GGilsonF144072
Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000GGilsonF167360
Recombinant Human BMP-4 ProteinR&D Systems314-BP
RNeasy Plus mini KitQIAGEN74134
Serological pipettes, 10 mLGreiner Bio-One607 180
Serological pipettes, 25 mLGreiner Bio-One760 180
Serological pipettes, 5 mLGreiner Bio-One606 180
Sodium hydroxide (NaOH)Merck106498
Sodium pyruvate 100 mMGibco, Thermofisher scientific11360039
Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer capCorning352235
Thermal cycler, T100Biorad1861096
Triton X-100 (BioXtra)Sigma AldrichT9284
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco, Thermofisher scientific15250061
Trypsin (2.5%)Gibco, Thermofisher scientific15090046
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mLCorning430758
VEGFA165 , recombinant murinePeprotech450-32
Water, SterileFresenius-KabiB230531
Waterbath, Lab-Line DigitalThermo Fischer Scientific18052A

Referanslar

  1. Moffat, J. G., Vincent, F., Lee, J. A., Eder, J., Prunotto, M. Opportunities and challenges in phenotypic drug discovery: an industry perspective. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (8), 531-543 (2017).
  2. Horvath, P., et al. Screening out irrelevant cell-based models of disease. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (11), 751-769 (2016).
  3. Low, L. A., Mummery, C., Berridge, B. R., Austin, C. P., Tagle, D. A. Organs-on-chips: into the next decade. Nature Reviews. Drug Discovery. , (2020).
  4. Ma, C., Peng, Y., Li, H., Chen, W. Organ-on-a-Chip: A new paradigm for drug development. Trends in Pharmacological Sciences. 42 (2), 119-133 (2021).
  5. Swinney, D. C., Anthony, J. How were new medicines discovered. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (7), 507-519 (2011).
  6. Hussain, S., et al. High-content image generation for drug discovery using generative adversarial networks. Neural Networks: The Official Journal of the INternational Neural Network Society. 132, 353-363 (2020).
  7. Scheeder, C., Heigwer, F., Boutros, M. Machine learning and image-based profiling in drug discovery. Current Opinion in Systems Biology. 10, 43-52 (2018).
  8. Wagner, B. K., Schreiber, S. L. The power of sophisticated phenotypic screening and modern mechanism-of-action methods. Cell Chemical Biology. 23 (1), 3-9 (2016).
  9. Scannell, J. W., Bosley, J. When quality beats quantity: Decision theory, drug discovery, and the reproducibility crisis. PLoS One. 11 (2), 0147215 (2016).
  10. Webster, J. D., Santagostino, S. F., Foreman, O. Applications and considerations for the use of genetically engineered mouse models in drug development. Cell and Tissue Research. 380 (2), 325-340 (2020).
  11. Howland, D. S., Munoz-Sanjuan, I. Mind the gap: models in multiple species needed for therapeutic development in Huntington's disease. Movement Disorders: Official Journal of the Movement Disorder Scoiety. 29 (11), 1397-1403 (2014).
  12. Galaris, G., Thalgott, J. H., Lebrin, F. P. G. Pericytes in hereditary hemorrhagic telangiectasia. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1147, 215-246 (2019).
  13. Thalgott, J. H., et al. Decreased expression of vascular endothelial growth factor receptor 1 contributes to the pathogenesis of hereditary hemorrhagic telangiectasia type 2. Circulation. 138 (23), 2698-2712 (2018).
  14. Lebrin, F., et al. Thalidomide stimulates vessel maturation and reduces epistaxis in individuals with hereditary hemorrhagic telangiectasia. Nature Medicine. 16 (4), 420-428 (2010).
  15. Czechanski, A., et al. Derivation and characterization of mouse embryonic stem cells from permissive and nonpermissive strains. Nature Protocols. 9 (3), 559-574 (2014).
  16. Elling, U., et al. A reversible haploid mouse embryonic stem cell biobank resource for functional genomics. Nature. 550 (7674), 114-118 (2017).
  17. Cheng, J., et al. Targeting pericytes for therapeutic approaches to neurological disorders. Acta Neuropathologica. 136 (4), 507-523 (2018).
  18. Chade, A. R. Small vessels, big role: Renal microcirculation and progression of renal injury. Hypertension. 69 (4), 551-563 (2017).
  19. Jourde-Chiche, N., et al. Endothelium structure and function in kidney health and disease. Nature Reviews. Nephrology. 15 (2), 87-108 (2019).
  20. van Duinen, V., et al. Standardized and scalable assay to study perfused 3D angiogenic sprouting of iPSC-derived endothelial cells in vitro. Journal of Visualized Experiment: JoVE. (153), e59678 (2019).
  21. Chappell, J. C., Taylor, S. M., Ferrara, N., Bautch, V. L. Local guidance of emerging vessel sprouts requires soluble Flt-1. Developmental Cell. 17 (3), 377-386 (2009).
  22. Sato, Y., Rifkin, D. B. Inhibition of endothelial cell movement by pericytes and smooth muscle cells: activation of a latent transforming growth factor-beta 1-like molecule by plasmin during co-culture. Journal of Cell Biology. 109 (1), 309-315 (1989).
  23. Tchaikovski, V., Olieslagers, S., Bohmer, F. D., Waltenberger, J. Diabetes mellitus activates signal transduction pathways resulting in vascular endothelial growth factor resistance of human monocytes. Circulation. 120 (2), 150-159 (2009).
  24. Staton, C. A., Reed, M. W., Brown, N. J. A critical analysis of current in vitro and in vivo angiogenesis assays. International Journal of Experimental Pathology. 90 (3), 195-221 (2009).
  25. Herbert, S. P., Stainier, D. Y. Molecular control of endothelial cell behaviour during blood vessel morphogenesis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (9), 551-564 (2011).
  26. Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods in Enzymology. 443, 65-82 (2008).
  27. Nakatsu, M. N., Davis, J., Hughes, C. C. Optimized fibrin gel bead assay for the study of angiogenesis. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (186), (2007).
  28. Gau, D., et al. Pharmacological intervention of MKL/SRF signaling by CCG-1423 impedes endothelial cell migration and angiogenesis. Angiogenesis. 20 (4), 663-672 (2017).
  29. Torres-Estay, V., et al. Androgens modulate male-derived endothelial cell homeostasis using androgen receptor-dependent and receptor-independent mechanisms. Angiogenesis. 20 (1), 25-38 (2017).
  30. Merjaneh, M., et al. Pro-angiogenic capacities of microvesicles produced by skin wound myofibroblasts. Angiogenesis. 20 (3), 385-398 (2017).
  31. Rezzola, S., et al. In vitro and ex vivo retina angiogenesis assays. Angiogenesis. 17 (3), 429-442 (2014).
  32. Wang, X., Phan, D. T. T., George, S. C., Hughes, C. C. W., Lee, A. P. 3D Anastomosed microvascular network model with living capillary networks and endothelial cell-lined microfluidic channels. Methods in Molecular Biology. 1612, 325-344 (2017).
  33. Nicosia, R. F., Ottinetti, A. Growth of microvessels in serum-free matrix culture of rat aorta. A quantitative assay of angiogenesis in vitro. Laboratory Investigation; A Journal of Technical Methods and Pathology. 63 (1), 115-122 (1990).
  34. Nicosia, R. F. The aortic ring model of angiogenesis: a quarter century of search and discovery. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 13 (10), 4113-4136 (2009).
  35. Nowak-Sliwinska, P., et al. Consensus guidelines for the use and interpretation of angiogenesis assays. Angiogenesis. 21 (3), 425 (2018).
  36. Belair, D. G., Schwartz, M. P., Knudsen, T., Murphy, W. L. Human iPSC-derived endothelial cell sprouting assay in synthetic hydrogel arrays. Acta Biomaterialia. 39, 12-24 (2016).
  37. Bezenah, J. R., Kong, Y. P., Putnam, A. J. Evaluating the potential of endothelial cells derived from human induced pluripotent stem cells to form microvascular networks in 3D cultures. Scientific Reports. 8 (1), 2671 (2018).
  38. Henderson, A. R., Choi, H., Lee, E. Blood and lymphatic vasculatures on-chip platforms and their applications for organ-specific in vitro modeling. Micromachines (Basel). 11 (2), 147 (2020).
  39. Lin, D. S. Y., Guo, F., Zhang, B. Modeling organ-specific vasculature with organ-on-a-chip devices. Nanotechnology. 30 (2), 024002 (2019).
  40. Pollet, A., den Toonder, J. M. J. Recapitulating the vasculature using organ-on-chip technology. Bioengineering. 7 (1), 17 (2020).
  41. Cochrane, A., et al. Advanced in vitro models of vascular biology: Human induced pluripotent stem cells and organ-on-chip technology. Advanced Drug Delivery Reviews. 140, 68-77 (2019).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

JoVE de Bu AySay 171fare embriyonik k k h crelerifilizlenen anjiyogenezendotel h cre spesifikasyonudamar olgunla masila testihastal k modelleme

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır