In vitro Saggio tridimensionale di germinazione dell'angiogenesi utilizzando cellule staminali embrionali di topo per la modellazione di malattie vascolari e test farmacologici

Riepilogo

Questo test utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi coltivati in gel di collagene 3D per analizzare i processi biologici che controllano l'angiogenesi germinativa in vitro. La tecnica può essere applicata per testare farmaci, modellare malattie e per studiare geni specifici nel contesto di delezioni embrionalmente letali.

Abstract

I recenti progressi nelle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) e nelle tecnologie di modifica genetica consentono lo sviluppo di nuovi modelli di malattia basati su cellule umane per programmi di scoperta di farmaci fenotipici (PDD). Sebbene questi nuovi dispositivi possano prevedere la sicurezza e l'efficacia dei farmaci sperimentali negli esseri umani in modo più accurato, il loro sviluppo in clinica dipende ancora fortemente dai dati dei mammiferi, in particolare l'uso di modelli di malattia murina. Parallelamente ai modelli di malattia organoide umana o organo-on-chip, lo sviluppo di pertinenti modelli murini in vitro è quindi un'esigenza insoddisfatta per valutare l'efficacia diretta dei farmaci e i confronti di sicurezza tra specie e condizioni in vivo e in vitro . Qui viene descritto un saggio di germinazione vascolare che utilizza cellule staminali embrionali di topo differenziate in corpi embrioidi (EB). Gli EB vascolarizzati coltivati su gel di collagene 3D sviluppano nuovi vasi sanguigni che si espandono, un processo chiamato angiogenesi che germoglia. Questo modello riassume le caratteristiche chiave dell'angiogenesi in vivo che germoglia la formazione dei vasi sanguigni da una rete vascolare preesistente, compresa la selezione delle cellule della punta endoteliale, la migrazione e la proliferazione delle cellule endoteliali, la guida cellulare, la formazione del tubo e il reclutamento delle cellule murali. È suscettibile di screening per farmaci e geni che modulano l'angiogenesi e mostra somiglianze con saggi vascolari tridimensionali (3D) recentemente descritti basati su tecnologie iPSC umane.

Introduzione

Negli ultimi tre decenni, la scoperta di farmaci basata sul bersaglio (TDD) è stata ampiamente utilizzata nella scoperta di farmaci dall'industria farmaceutica. TDD incorpora un bersaglio molecolare definito che svolge un ruolo importante in una malattia e si basa sullo sviluppo di sistemi di coltura cellulare relativamente semplici e letture per lo screening dei farmaci¹. La maggior parte dei modelli di malattia tipici utilizzati nei programmi TDD includono metodi tradizionali di coltura cellulare come cellule tumorali o linee cellulari immortalizzate coltivate all'interno di ambienti artificiali e substrati non fisiologici. Sebbene molti di questi modelli abbiano fornito strumenti validi per identificare farmaci candidati di successo, l'uso di tali sistemi può essere discutibile a causa della loro scarsa rilevanza per la malattia².

Per la maggior parte delle malattie, i meccanismi sottostanti sono infatti complessi e vari tipi di cellule, vie di segnalazione indipendenti e più set di geni sono spesso trovati per contribuire a uno specifico fenotipo di malattia. Questo vale anche per le malattie ereditarie in cui la causa primaria è una mutazione in un singolo gene. Con il recente avvento delle tecnologie delle cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC) e degli strumenti di modifica genetica, è ora possibile generare organoidi 3D e modelli di malattia organ-on-chip che potrebbero ricapitolare meglio la complessità umana in vivo ^3,4. Lo sviluppo di tali tecnologie è associato a una rinascita dell'interesse per i programmi di scoperta di farmaci fenotipici (PDD)¹. La PDD può essere paragonata allo screening empirico, in quanto non si basano sulla conoscenza dell'identità di uno specifico bersaglio farmacologico o su un'ipotesi sul suo ruolo nella malattia. L'approccio PDD è ora sempre più riconosciuto per contribuire fortemente alla scoperta di farmaci di prima classe⁵. Poiché lo sviluppo delle tecnologie organoidi umane e organ-on-chip è ancora agli inizi, si prevede che i modelli iPSC (integrati con strumenti innovativi di imaging e apprendimento automatico^6,7) forniranno, nel prossimo futuro, molteplici nuovi modelli di malattia basati su cellule complesse per lo screening dei farmaci e i programmi PDD associati per superare la scarsa produttività dell'approccio TDD^{8, 9}.

Mentre i modelli organoidi umani e organ-on-chip possono fornire importanti informazioni sulla complessità della malattia e sull'identificazione di nuovi farmaci, portare i farmaci nella nuova pratica clinica si basa fortemente anche sui dati provenienti da modelli animali per valutarne l'efficacia e la sicurezza. Tra questi, i topi geneticamente modificati sono sicuramente i modelli di mammiferi più preferiti. Hanno molti vantaggi in quanto hanno un tempo di generazione relativamente breve per i mammiferi, hanno molti fenotipi simili alle malattie umane e possono essere facilmente manipolati geneticamente. Sono quindi ampiamente utilizzati nei programmi di scoperta di farmaci¹⁰. Tuttavia, colmare il divario tra topi e umani rimane una sfida importante¹¹. Lo sviluppo di modelli murini in vitro equivalenti agli organoidi umani e ai modelli organo-on-chip potrebbe colmare almeno parzialmente questa lacuna, in quanto consentirà confronti diretti dell'efficacia e della sicurezza dei farmaci tra i dati in vivo sul topo e quelli umani in vitro .

Qui viene descritto un test di germinazione vascolare nei corpi embrioidi di topo (EB). I vasi sanguigni sono composti da cellule endoteliali (rivestimento interno delle pareti dei vasi), cellule murali (cellule muscolari lisce vascolari e periciti)¹². Questo protocollo si basa sulla differenziazione di cellule staminali embrionali di topo (mESC) in EB vascolarizzati utilizzando goccioline sospese che ricapitolano de novo la cellula endoteliale e la differenziazione delle cellule murali^13,14. Le ESC di topo possono essere facilmente stabilite in coltura da blastocisti isolate di topo al giorno 3.5 con background genetico diverso¹⁵. Forniscono anche possibilità per l'analisi clonale, il tracciamento del lignaggio e possono essere facilmente manipolati geneticamente per generare modelli di malattia^13,16.

Poiché i vasi sanguigni nutrono tutti gli organi, non sorprende che molte malattie, se non tutte, siano associate a cambiamenti nella microvascolarizzazione. In condizioni patologiche, le cellule endoteliali possono adottare uno stato attivato o possono diventare disfunzionali con conseguente morte delle cellule murali o migrazione lontano dai vasi sanguigni. Questi possono provocare un'eccessiva angiogenesi o rarefazione dei vasi, possono indurre un flusso sanguigno anormale e una barriera dei vasi sanguigni difettosa che porta a stravaso delle cellule immunitarie e infiammazione^12,17,18,19. La ricerca per lo sviluppo di farmaci che modulano i vasi sanguigni è, quindi, elevata, e sono già stati identificati molteplici attori e concetti molecolari per il targeting terapeutico. In questo contesto, il protocollo descritto è particolarmente adatto per la costruzione di modelli di malattia e per test farmacologici in quanto riassume le caratteristiche chiave dell'angiogenesi in vivo che germoglia, tra cui la selezione delle cellule endoteliali della punta e del peduncolo, la migrazione e la proliferazione delle cellule endoteliali, la guida delle cellule endoteliali, la formazione del tubo e il reclutamento delle cellule murali. Mostra anche somiglianze con saggi vascolari 3D recentemente descritti basati su tecnologie iPSC umane²⁰.

Protocollo

1. Preparazione dei media e cultura del mESC

1. Preparare il terreno condizionato +/- (CM+/-) utilizzando il supplemento 1x Glasgow MEM (G-MEM BHK-21) terreno con il 10% (vol/vol) di siero fetale bovino (FBS) inattivato dal calore, 0,05 mM β-mercaptoetanolo, 1x aminoacidi non essenziali (NEAA 1x), 2 mM L-glutammina e 1 mM di piruvato di sodio.
2. Preparare il mezzo condizionato +/+ (CM+/+) utilizzando il mezzo CM+/- con fattore inibitorio della leucemia (LIF) (1.500 U/mL) e 0,1 mM β-mercaptoetanolo.
3. Preparare il terreno condizionato +/+ in presenza di due inibitori (CM+/+ 2i) utilizzando il mezzo CM+/+ con 1 μM PD0325901 e 3 μM CHIR99021.
4. Preparare una soluzione di gelatina allo 0,1% mescolando 25 ml di soluzione di gelatina al 2% preriscaldata in 500 ml di soluzione salina tamponata con fosfato senza calcio e magnesio (DPBS).
5. Preparare 10x tampone Trypsin Versene Phosphate (TVP 10x) mescolando Tripsina (2,5%) con TVP 1x (9,5% 10x DPBS, 1 mM EDTA, 0,01% siero di pollo, 0,01% Tripsina (2,5%) in H₂O) (rapporto 1:10, vol/vol).
   NOTA: filtrare tutte le soluzioni attraverso un filtro per pori da 0,22 μm. Conservare il terreno di coltura a -20 °C per lungo tempo e conservare gli altri reagenti a 4 °C per un massimo di 3 settimane (vedere Tabella dei materiali).
6. Rivestire due piastre di coltura cellulare a 12 pozzetti con soluzione di gelatina allo 0,1% (500 μL per pozzetto) e incubarle per 30 minuti in un incubatore di CO 2 (37 °C, 5% CO₂, atmosfera umida).
7. Lavare le piastre ricoperte di gelatina con PBS e aggiungere 500 μL di mezzo CM+/-.
8. Scongelare due flaconcini di 1 x 10⁶ fibroblasti embrionali di topo (MEF) irradiati crioconservati a 37 °C e trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico con 5 mL di mezzo CM+/-.
9. Centrifugare le celle a 200 x g per 5 minuti a temperatura ambiente (RT). Aspirare il terreno e risospendere delicatamente il pellet cellulare in 12 ml di CM+/- terreno ad una concentrazione di 1,67 x 10⁵ cellule per ml.
10. Seminare 500 μL di sospensione di MEF in una piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti (2,4 x 10⁵ cellule per cm 2) e incubare la piastra per una notte (o/n) in un incubatore di CO₂.
11. Scongelare un flaconcino di mESC crioconservate (1 x 10⁶) in mezzo CM+/+ 2i.
12. Seminare la sospensione di mESC su una piastra prelavata a 12 pozzetti con MEF in 1 mL di mezzo CM+/+ 2i e trasferire la piastra in un incubatore di CO₂ . Aggiorna il mezzo ogni giorno.
13. Al 70% di confluenza, lavare le colonie di mESC con DPBS. Aggiungere 150 μL di tampone TVP caldo 10x e incubare a RT per 30 s per avviare la dissociazione enzimatica.
14. Rimuovere con cautela il tampone TVP, risospendere le cellule in 1 mL di mezzo CM+/+ 2i e dissociare le colonie in singole cellule mediante pipettaggio delicato.
15. Far passare le cellule trasferendole in una nuova piastra di coltura cellulare a 12 pozzetti con MEF (rapporto di scissione: 1:3-1:5). Mescolare delicatamente per distribuire le cellule e incubare in un incubatore di CO₂ .
16. Rinfrescare il terreno di coltura (2-3 ml) e osservare quotidianamente la crescita/morfologia cellulare. Ripetere il passaggio seriale al 70% di confluenza ogni 2 giorni. Passare al mezzo CM+/+ per due passaggi prima di iniziare la differenziazione cellulare.

2. Formazione di EB in goccia sospesa

1. Preparare un nuovo mezzo di differenziazione del mesoderma integrando il terreno CM+/- con il fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF) (50 ng·mL-1) e con la proteina morfogenetica ossea 4 (BMP-4) (5 ng·^mL-1) e mantenerlo a 4 °C fino all'uso.
2. Rivestire un pozzetto della piastra di coltura cellulare a 6 pozzetti con 500 μL di soluzione di gelatina allo 0,1% e metterlo in un incubatore di CO₂ per 30 minuti.
3. Lavare le piastre ricoperte di gelatina con PBS e aggiungere 500 μL di mezzo CM+/-.
4. Per ottenere una popolazione pura di mESC, tripsinizzare la piastra di coltura cellulare con tampone TVP 10x per 30 s a RT, risospendere le cellule in 1 mL di mezzo di differenziazione del mesoderma e quindi trasferirle sulla piastra a 6 pozzetti rivestita di gelatina per 30 minuti consentendo ai MEF di attaccarsi mentre i mESC rimangono in sospensione.
5. Raccogliere la sospensione cellulare in un tubo conico da 50 ml e contare le cellule utilizzando un emocitometro Neubauer e un colorante blu Trypan per un'esclusione di cellule vive / morte.
6. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti a RT. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare nel mezzo di differenziazione del mesoderma per raggiungere 4,55 x 10⁴ cellule per ml.
7. Riempire il fondo di piatti di polistirene a basso attacco da 94 mm con 15 ml di acqua sterile.
   NOTA: Quattro piatti contenenti gocce appese (1,6 x 10⁵ cellule in 3,52 ml di terreno) saranno necessari per testare una particolare condizione utilizzando il saggio di angiogenesi 3D sprouting.
8. Trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio di plastica sterile e caricare quattro posizioni di una pipetta multicanale con 22 μL di sospensione cellulare per canale (1 x 10³ celle per 22 μL di goccia).
9. Sollevare e capovolgere il coperchio del piatto da 94 mm e posizionarlo sulla superficie pulita dell'armadio di flusso con il lato interno rivolto verso l'alto.
10. Depositare 40 gocce della sospensione cellulare sulla superficie interna di ciascun coperchio. Capovolgere con attenzione il coperchio senza disturbi e riposizionarlo sul piatto, in modo che le gocce siano rivolte verso l'acqua.
11. Incubare i piatti in un incubatore di CO₂ . Considera questo come differenziazione giorno 0. Mantenere le piastre per 4 giorni per formare EB.

3. Saggio di competizione per la posizione della cellula della punta

1. Coltura una linea mESC fluorescente e una non fluorescente come descritto in precedenza¹³. Ad esempio, vengono utilizzati mESC 7ACS/EYFP etichettati in giallo e mESC R1.
2. Preparare gli EB a mosaico mescolando quantità uguali delle due linee mESC (rapporto 1:1) e incubare i piatti a goccia sospesi in un incubatore di CO 2 come descritto nella fase₂ .

4. Coltura galleggiante di EBs per il differenziamento vascolare

1. Prima di raccogliere gli EB dalle gocce sospese, preparare quanto segue.
   1. Preparare la soluzione di agar al 5% in H₂O e sterilizzarla mediante autoclave (20 min a 120 °C).
   2. Utilizzare la soluzione calda di agar al 5% per preparare G-MEM BHK-21 terreno contenente l'1% di agar e versare rapidamente 3 ml in uno dei piatti di polistirene da 60 mm. Lasciare solidificare l'agar per 1 ora a RT. Conservare le stoviglie a 4 °C fino all'uso.
2. Preparare un mezzo di differenziazione vascolare fresco 2x completando il mezzo CM+/- con bFGF (100 ng·mL-1) e VEGF-A (50 ng·^mL-1). Conservare il fluido a 4 °C fino all'uso.
3. Raccogliere le gocce sospese in un tubo conico da 15 mL utilizzando una pipetta P1000 e rimuovere il surnatante dopo alcuni minuti di sedimentazione EB.
4. Risospendere gli EB in 3 mL di mezzo di differenziazione vascolare 2x, trasferire la sospensione EB in un piatto rivestito di agar e distribuire gli EB in modo omogeneo per evitare l'aggregazione.
5. Incubare i piatti nell'incubatore CO 2 e rinfrescare il terreno ogni₂ giorni fino al giorno 9 utilizzando 1x mezzo di differenziazione vascolare in presenza di bFGF (50 ng·mL-1) e VEGF-A (25 ng·^mL-1).
6. In alternativa, aggiungere il fattore di crescita derivato dalle piastrine-BB (PDGF-BB) (10 ng·mL-1 il giorno 4 e 5 ng·^mL-1 il giorno 6 e il giorno 8) al mezzo di differenziazione vascolare per promuovere la differenziazione delle cellule murali.

5. Analisi della citometria a flusso

1. Raccogliere gli EB di 9 giorni in un tubo conico da 15 mL utilizzando una pipetta P1000 e lavarli una volta con PBS caldo.
2. Aggiungere 1 ml di terreno G-MEM BHK-21 contenente 0,2 mg·^mL-1 di collagenasi A e incubare le cellule in un incubatore di CO₂ per 5 minuti.
3. Dissociare gli EB mediante pipettaggio delicato su e giù con una pipetta P1000.
4. Interrompere l'attività della collagenasi aggiungendo 1 mL di terreno freddo G-MEM BHK-21 con FBS al 10%.
5. Centrifugare le cellule a 200 x g per 5 minuti a RT.
6. Risospendere le cellule in 500 μL di PBS con FBS al 2%.
7. Contare le cellule utilizzando un emocitometro Neubauer.
8. Risospendere 400.000 cellule in 100 μL di PBS con FBS al 2% per condizione di colorazione.
9. Incubare le cellule per 45 minuti a 4 °C con i seguenti anticorpi: APC coniugato ratto anti-topo PECAM-1 anticorpo (clone MEC13.3) e FITC coniugato ratto anti-topo CD45 (clone 30-F11) o anticorpi isotype control.
10. Lavare le cellule due volte con 1 mL di PBS contenente il 2% di FBS.
11. Risospendere le cellule per raggiungere una concentrazione finale di 5 x 10⁶ cellule per ml.
12. Filtrare le celle utilizzando una provetta in polistirene a fondo rotondo, con un tappo a scatto per filtri cellulare.
13. Analizzare 20.000 eventi PECAM-1 (+) mediante citometria a flusso.

6.3D Saggio di angiogenesi germinativa e colorazione con immunofluorescenza

1. Al giorno 9, preparare un terreno di germinazione aggiungendo il 10% di FBS (vol/vol), bFGF (50 ng·mL-1), VEGF-A (25 ng·mL-1), eritropoietina ricombinante umana (hEPO) (20 ng·mL-1), interleuchina-6 umana (IL-6) (10 ng·mL-1), 0,05 mM β-mercaptoetanolo, NEAA (1x), L-glutammina (1x), piruvato di sodio (1x), collagene della coda di ratto di tipo I (1,25 mg·^mL-1), e NaOH (3,1 mM) al mezzo GMEM BHK-1.
2. Per evitare la gelificazione del collagene, mantenere il mezzo di germinazione sul ghiaccio fino all'uso.
3. Per valutare l'effetto delle molecole pro/anti-angiogeniche, aggiungere il farmaco o il veicolo selezionato al mezzo di germinazione alla concentrazione selezionata.
4. Raccogliere EB di 9 giorni da una capsula di agar da 60 mm in un tubo conico da 15 ml (equivalente a una condizione) e rimuovere il surnatante dopo alcuni minuti di sedimentazione.
5. Coprire il fondo di una capsula di coltura da 35 mm con 1 mL del terreno di germinazione e incubare a 37 °C per 5 minuti per indurre la gelificazione.
6. Risospendere gli EB in 2 ml di terreno di germinazione a freddo.
7. Trasferire la sospensione sul piatto di coltura da 35 mm rivestito con il primo strato di terreno di germinazione.
8. Distribuire gli EB su tutta la piastra e assicurarsi che siano a una distanza uguale l'uno dall'altro. Incubare il piatto in un incubatore di CO₂ . La prima formazione di germogli avviene entro 24-48 h.
9. Al giorno 12, il gel di collagene contenente EB viene accuratamente trasferito su un vetrino (75 x 26 mm) utilizzando una spatola.
10. Rimuovere il liquido in eccesso con una pipetta (P1000) e disidratare il gel posizionando un foglio di garza di lino di nylon e schede filtranti assorbenti (carta assorbente) sopra il gel. Applicare pressione posizionando un peso (250 g) per 2 min. Rimuovere con attenzione la carta da filtro in nylon e lasciare asciugare i vetrini all'aria per 30 minuti a RT.
11. Lavare i vetrini tre volte con PBS per 5 minuti su RT.
12. Fissare gli EB utilizzando una soluzione di zinco (vedi tabella dei materiali) o/n a 4 °C. In alternativa, fissare gli EB fluorescenti a mosaico con Paraformaldeide (PFA) (4%) o/n a 4 °C al buio.
13. Rimuovere il fissativo. Lavare i vetrini cinque volte con PBS per 5 minuti su RT.
14. Permeabilizzare gli EB in PBS contenenti lo 0,1% di Triton-X100 per 15 minuti a RT.
15. Rimuovere la soluzione di permeabilizzazione. Lavare i vetrini cinque volte con PBS per 5 minuti.
16. Incubare gli EB nel tampone bloccante (PBS con 2% di albumina sierica bovina, BSA) per 1 ora a RT.
17. Per colorare i germogli endoteliali, utilizzare un anticorpo primario anti-topo anti-PECAM-1 (diluizione 1:100) nel tampone o/n bloccante a 4 °C.
18. Lavare i vetrini cinque volte con PBS per 5 minuti.
19. Incubare i vetrini con l'anticorpo secondario Alexa 555 anti-ratto di capra nel tampone bloccante (diluizione 1:250) e, quando necessario, con l'anticorpo anti-α-SMA coniugato con FITC nel tampone bloccante (diluizione 1:250) per colorare le cellule murali per 2 ore a RT al buio.
20. Lavare le guide tre volte con PBS per 5 minuti e una volta con H₂0 prima di montarle.

7. Imaging confocale, analisi morfometrica e quantitativa di germogli endoteliali EB

1. Acquisire immagini ad alta risoluzione degli EB immunocolorati mediante fusione del piano focale (z-stacking) utilizzando un microscopio confocale. Usa l'obiettivo di ingrandimento 10x per visualizzare interi EB.
2. Analizzare le immagini acquisite utilizzando ImageJ per valutare la morfologia e quantificare le caratteristiche dei germogli endoteliali PECAM-1 positivi secondo i metodi di quantificazione stabiliti^13,14,21.
   1. Calcola il numero medio di germogli endoteliali per EB contando manualmente il numero totale di germogli per singoli EB.
   2. Misurare le singole lunghezze dei germogli utilizzando lo strumento di disegno ImageJ. Definire la base del germoglio endoteliale a partire dall'area centrale EB e tracciare manualmente una linea fino all'estremità della punta del germoglio.
   3. Calcolare il numero medio di cellule di punta per germoglio contando manualmente il numero di celle di punta per singolo germoglio e quindi calcolare la media per EB.
   4. Calcolare l'orientamento della filopodia determinando manualmente l'asse del germoglio genitore e misurare l'angolo acuto tra di essi utilizzando lo strumento angolare del software ImageJ. Calcola il numero di germogli con un orientamento >50° e dividilo per il numero totale di germogli dell'EB di interesse.
      NOTA: Gli angoli variavano sempre da 0° a 90°.
3. Acquisire immagini ad alta risoluzione degli EB immunocolorati utilizzando un microscopio confocale. Utilizza l'obiettivo di ingrandimento 40x per realizzare immagini ad alta risoluzione di singoli germogli endoteliali.
4. Quantificare la copertura dei vasi dei germogli EC positivi a PECAM-1 circondati da MC positivi α-SMA utilizzando il software ImageJ.
   1. Dividi le immagini unite in canali rossi e verdi separati.
   2. Converti le immagini nella sua forma binaria.
   3. Misurare l'area cellulare totale del germoglio occupata separatamente da PECAM-1 (cellule endoteliali marcate in rosso) e da cellule positive α-SMA (cellule murali etichettate in verde).
   4. Generare l'immagine unita utilizzando la funzione calcolatrice di immagini e l'operatore AND. Misurare l'area cellulare totale dell'immagine. Per calcolare la copertura, dividere l'area dell'immagine colocalizzata per l'area dell'immagine binaria PECAM-1.
5. Per analizzare la competizione cellulare per la posizione delle cellule endoteliali di punta / stelo dei germogli sviluppati dagli EB a mosaico, valutare manualmente il numero di cellule di punta e contrassegnare la loro origine genotipica in base al segnale di fluorescenza. Calcola i valori medi per EB.

Risultati

La panoramica del protocollo del test di germinazione dei vasi sanguigni è mostrata nella Figura 1. Gli EB di nove giorni derivati da tre linee mESC indipendenti 129/Ola (Z/Red, R1 ed E14) sono stati dissociati enzimaticamente in singole cellule usando la collagenasi A. Le cellule sono state colorate per PECAM-1 e analizzate mediante Fluorescence-activated cell sorting (FACS) come descritto. Tutte le linee cellulari hanno mostrato una robusta differenziazione endoteliale e non sono state os...

Discussione

Questo protocollo descrive un test imparziale, robusto e riproducibile basato sulla germinazione vascolare 3D basato su EB che è suscettibile di screening per farmaci e geni che modulano l'angiogenesi. Questo metodo offre vantaggi rispetto a molti saggi bidimensionali (2D) ampiamente utilizzati che utilizzano colture di cellule endoteliali come le cellule endoteliali della vena ombelicale umana (HUVEC) per monitorare la migrazione (test di graffio laterale o il saggio della camera di Boyden)22,23 o proliferazione (conte...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Milipore, Merck	805740	Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
Agar Noble	Difco, BD Pharmigen	214220
Alexa Fluo 555 goat anti rat IgG	Life technologies	A21434
APC conjugated rat anti-mouse PECAM-1 antibody (clone MEC13.3)	BD Biosciences	551262
APC Rat IgG2a κ Isotype Control (Clone  R35-95)	BD Biosciences	553932
Axiovert 25 inverted phase contrast tissue culture microscope	ZEISS
Basic Fibroblast Growth Factor-2 (bFGF)	Peprotech	450-33
Benchtop Centrifuge, Allegra X-15R	Beckman Coulter	392932
Biosafety cabinet BioVanguard (Green Line)	Telstar	133H401001
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A9418
Cell counting chamber, Buerker, 0.100mm	Marienfeld	640211
Cell culture dishes 60 x 15mm	Corning	353802
Cell culture dishes, 35 x 10 mm	Corning	353801
Cell culture plates 12-well	Corning	3512
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Biorad	1855196
Chicken serum	Sigma-Aldrich	C5405
CHIR-99021 (CT99021) HCl	Selleckchem	S2924
Collagen I, High Concentration, Rat Tail, 100mg	Corning	354249
Collagenase A	Roche	10103586001
Confocal Laser Scanning Microscope, TCS SP5	Leica
Cover glasses, 24 × 50 mm	Vwr	631-0146
DAPT γ?secretase inhibitor	Sigma Aldrich	D5942
DC101 anti mouse VEGFR-2 Clone	BioXcell	BP0060
DC101 isotype rat IgG1	BioXcell	BP0290
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2438-5X	Biohazard: adequate safety instructions should be taken when handling
DPBS (10x), no calcium, no magnesium	Gibco, Thermofisher scientific	14200067
EDTA 40 mM	Gibco, Thermofisher scientific	15575-038
Embryonic stem-cell Fetal Bovine Serum	Gibco, Thermofisher scientific	16141-079	Should be lot-tested for maximum ES cell viability and growth. Heat inactivate at 60°C and store at −20 °C for up to 1 year
Eppendorf Microcentrifuge 5415R	Eppendorf AG	Z605212
Erythropoietin, human (hEPO), 250 U (2.5 µg) (1 mL)	Roche	11120166001
ESGRO Recombinant Mouse LIF Protein (10? units  1 mL)	Milipore, Merck	ESG1107
Falcon tubes 15 mL	Greiner Bio-One	188271
Falcon tubes 50 mL	Greiner Bio-0ne	227270
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P-200	Greiner Bio-One	739288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P10	Greiner Bio-One	771288
Filter tip ,clear ,sterile F.Gilson, P1000	Greiner Bio-One	740288
FITC conjugated anti-α Smooth Muscle Actin (SMA) (clone 1A4)	Sigma Aldrich	F3777
FITC conjugated rat anti-mouse CD45 (clone 30-F11)	Biolegend	103107
FITC Rat IgG2b, κ Isotype Ctrl Antibody (clone RTK4530)	Biolegend	400605
Fluorscent mounting media	DAKO	S3023
Gascompress	Cutisoft	45846
Gauze Cutisoft 10 x 10 cm	Bsn Medical	45844_00
Gel blotting paper, Grade GB003	Whatman	WHA10547922
Gelatin solution, type B	Sigma-Aldrich	G1393-100 ml
Glasgow's MEM (GMEM)	Gibco, Thermofisher scientific	21710082
IHC Zinc Fixative	BD Pharmigen	550523
IncuSafe CO2 Incubator	PHCBi	MCO-170AICUV-PE
Interleukin-6, human (hIL-6)	Roche	11138600001
L-Glutamine 200 mM	Gibco, Thermofisher scientific	25030-024
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x)	Gibco, Thermofisher scientific	11140035
Microscope slide box	Kartell Labware	278
Microscope slide, Starfrost	Knittel glass	VS113711FKB.0
Mm_Cdh5_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00110467
Mm_Eng_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00148981
Mm_Epha4_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00093576
Mm_Ephb2_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00154014
Mm_Flt1_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00096292
Mm_Flt4_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00099064
Mm_Gapdh_3_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT01658692
Mm_Kdr_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00097020
Mm_Notch1_1_SG QuantiTect Primer	Qiagen	QT00156982
Mm_Nr2f2_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00153104
Mm_Pecam1_1_SG QuantiTect Primer	Qiagen	QT01052044
Mm_Tek_1_SG QuantiTect Primer Assay	Qiagen	QT00114576
Mouse (ICR) Inactivated Embryonic Fibroblasts  (2 M)	Gibco, Thermofisher scientific	A24903	Store vials in liquid nitrogen (195.79 °C) indefinitely
Mouse embryonic stem cell line 7AC5/EYFP (ATCC SCRC-1033)	ATCC	SCRC-1033	Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Hadjantonakis, A. K., et al. Mechanisms of Development. 76 (1–2), 79–90 (1998)].
Mouse embryonic stem cell lines Acvrl1 +/- and Acvrl1 +/+			Generated at Leiden University Medical Centre [Thalgott, J.H. et al. Circulation. 138 (23), 2698–2712 (2018)].
Mouse embryonic stem cells line E14			Provided by M Letarte laboratory and generated according to Cho, S. K., et al. Blood. 98 (13), 3635–3642 (2001).
Mouse embryonic stem cells line R1 (ATCC SCRC-1011)	ATCC	SCRC-1011	Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada. [Nagy, A., et al. Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90 (18), 8424–8428 (1993)].
Mouse embryonic stem cells line Z/Red (strain 129/Ola)			Generated by Dr A Nagy, Samuel Lunenfeld Research Institute, Mount Sinai Hospital, 600 University Ave, Toronto, Ontario, M5G 1X5, Canada [Vintersten, K., et al. Genesis. 40 (4), 241–246 (2004)].
NanoDrop 1000 UV/VIS Spectrophotometer	Thermo Fischer Scientific	ND-1000
PD0325901	Selleckchem	S1036
PDGF-BB, Recombinant Human	Peprotech	100-14B
Pecam-1 antibody, Rat Anti-Mouse	BD Biosciences	550274
Penicillin-streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco, Thermofisher scientific	15140122
Petri dish, PS, 94/16 mm, standard ,with vents, sterile	Greiner Bio-One	633181
Pipetboy acu 2	Integra-Biosciences	155 019
Pipetman G Multichannel P8 x 200G	Gilson	F144072
Pipetman G Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2G, P20G, P200G, P1000G	Gilson	F167360
Recombinant Human BMP-4 Protein	R&D Systems	314-BP
RNeasy Plus mini Kit	QIAGEN	74134
Serological pipettes, 10 mL	Greiner Bio-One	607 180
Serological pipettes, 25 mL	Greiner Bio-One	760 180
Serological pipettes, 5 mL	Greiner Bio-One	606 180
Sodium hydroxide (NaOH)	Merck	106498
Sodium pyruvate 100 mM	Gibco, Thermofisher scientific	11360039
Test tubes 5ml round-bottom with cell-strainer cap	Corning	352235
Thermal cycler, T100	Biorad	1861096
Triton X-100 (BioXtra)	Sigma Aldrich	T9284
Trypan Blue Solution, 0.4%	Gibco, Thermofisher scientific	15250061
Trypsin (2.5%)	Gibco, Thermofisher scientific	15090046
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 500 mL	Corning	430758
VEGFA165 , recombinant murine	Peprotech	450-32
Water, Sterile	Fresenius-Kabi	B230531
Waterbath, Lab-Line Digital	Thermo Fischer Scientific	18052A