無細胞システムによる遺伝子部分の迅速な特性評価

要約

新しい遺伝子回路の設計には、十分に特徴付けられた遺伝的部分が必要です。ここでは、遺伝子部分を迅速に特性評価するための費用対効果の高いハイスループットの方法について説明します。私たちの方法は、無細胞溶解物、クローニングを回避するための線状DNA、およびスループットを向上させ、反応量を減らすための音響液体処理を組み合わせることにより、コストと時間を削減します。

要約

遺伝子部分の特性評価とカタログ化は、有用な遺伝子回路の設計にとって重要です。十分に特徴付けられた部品を持つことは、それらの機能が予測可能な結果をもたらすように、遺伝子回路の微調整を可能にする。合成生物学の分野としての成長に伴い、センシング、代謝変化、セルラーコンピューティングに関連する機能を実行するために微生物に実装された遺伝子回路が爆発的に増加しています。ここでは、遺伝子部分を特徴付けるための迅速かつ費用対効果の高い方法を示します。私たちの方法は、レポータータンパク質の発現を介して部品を評価するための培地として社内で調製された無細胞ライセートを利用します。テンプレートDNAは、安価なプライマーを用いたPCR増幅によりレポーター遺伝子に変異部分を付加し、クローニングせずに直鎖状DNAとして反応に鋳型を付加します。このようにして添加することができる部分には、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合部位、絶縁体、およびターミネーターが含まれる。このアプローチは、音響液体ハンドラーと384ウェルプレートの組み込みと組み合わせることで、ユーザーは1日で遺伝子部分のハイスループット評価を実行できます。比較すると、細胞ベースのスクリーニングアプローチは、時間のかかるクローニングを必要とし、一晩の培養および培養密度の標準化ステップのためにテスト時間が長くなります。さらに、無細胞ライセートで作業することで、外因性成分とDNAを正確な濃度で添加することにより、発現条件を正確に厳密に制御できます。無細胞スクリーニングから得られた結果は、無細胞系のアプリケーションに直接使用したり、場合によっては細胞全体の機能を予測する方法として使用したりできます。

概要

合成生物学の中核となる取り組みは、微生物や無細胞溶解物に展開されたときに有用な機能を実行する遺伝子回路¹を構築するために使用できる、十分に特性化された部品を含む遺伝子ツールキットを開発することです。このような遺伝子回路が牽引力を獲得している分野は、センシング^2,3,4、人間のパフォーマンス^5,6、バイオ燃料^7,8、材料生産^9,10、およびセルラーコンピューティング¹¹です。標準化された遺伝子部分のレジストリが確立されました¹² 新規および既存の部分をプロモーター、オペレーター、コーディング配列、ターミネーターなどのカテゴリにカタログ化します。iGEM(国際遺伝子工学機械)コンペティション¹³などの取り組みは、これらの遺伝子部分の特性評価とカタログ化に役立っています。これらの部分を有用な遺伝子回路に迅速に組み立てることを容易にするために、多くの方法が開発されてきた^14,15。ソフトウェアは、十分に特性化された部品を所望の機能¹⁶を達成する回路に自動化することさえ開発されている。しかし、予測可能な機能を持つ有用な遺伝子回路の組み立ては、遺伝子ツールキットが十分に特徴付けられた遺伝子部分を含んでいるという仮定に基づいています。合成生物学の進歩に向けたこれらのツールキットの必要性のために、適切な特性評価データで回路および部品をよりよくカタログ化するための多くの努力が記載されている^17、18、19、^20、21。

遺伝的構成要素を特徴付けるための1つのアプローチは、転写およびex vivoなどの細胞機能を再構成する無細胞タンパク質合成(CFPS)システムを利用する²²。いくつかの研究は、無細胞系での直接適用であろうと、ライブラリー内の部分の相対的な活性など、細胞内の遺伝子構築物の機能を予測するためであろうと、遺伝子成分のプロトタイピングのためのCFPSの可能性を実証しています^{23,24,25,26,27,28,29,30,31,32}、代謝経路最適化²⁷、および細胞負荷³⁰。これらの研究で強調された細胞と比較してCFPSでのプロトタイピングの利点には、時間のかかるクローニングの回避、DNAやその他の反応成分の濃度の正確な制御、複数のDNA構築物を簡単に混合して一致させることができることが含まれます。クローニングを回避する利点は、線形DNAテンプレートを使用する場合に特に顕著であり、³³日目ではなく数時間かかるin vitro法で新しい構築物を組み立てることができます。ピペッティングによってDNA構築物および他の成分の濃度を操作する能力は、液体処理ロボット^34,35によって駆動されるハイスループット実験を可能にすることによって、アプローチをさらに魅力的にする。プロトタイピングにCFPSを使用した成功が報告されていますが、CFPSの結果が細胞内の機能を確実に予測できるコンテキストではまだ確認されていないことに注意することが重要です。

ここでは、従来のセルベースのアプローチと比較して、速度、スループット、およびコストの利点を強調したCFPSプロトタイピングの方法を紹介します。このアプローチは、CFPSを使用して転写因子TetR³²によって調節されるT7プロモーターバリアントのライブラリを迅速に特徴付け、当時の文献で利用可能であった少数の調節されたT7プロモーターバリアントを大幅に拡張した以前の研究に由来しています^36,37。他のものは、それ以来、そのようなプロ^{モーター38}の範囲をさらに拡大した。私たちの方法では、PCRを使用して、レポーター遺伝子に変異遺伝子部分を追加するプライマーを介してテンプレートDNAを増幅することにより、遺伝子構築物の組み立てを加速します。384ウェルプレートでの音響液体処理は、スループットを向上させ、必要な材料の量を減らすために使用されます。以前の研究では、大幅に低い容量^39,40での音響液体処理の使用に成功し、より大きな容量の手動ピペッティングに匹敵する変動性^{を示しました41}。この方法に加えて、トラブルシューティング情報と潜在的なコストと時間の節約の評価を提供します。Sunら⁴²に基づく無細胞ライセートを製造するためのプロトコルをここに含めているが、他の多くの市販のキットおよびプロトコル^43,44も機能するはずであることに注意してください。同様に、我々は、プロモーター変異体³²の特性評価のための方法を実証するが、リボレギュレーター、リボソーム結合部位(RBS)、絶縁体、タンパク質タグ、およびターミネーターなどの他の部分は、PCR増幅によって交換され得る。この方法論が、合成生物学コミュニティが有用な機能を備えた予測可能な遺伝子回路の組み立てのために特徴付けられた部品の数を増やし続けるのに役立つことを願っています。

プロトコル

1.細胞抽出液の調製

1. メディアの準備
   1. 2xYT培地の場合:16 gのトリプトン、10 gの酵母エキス、および5 gのNaClを900 mLの脱イオン水に加え、5 M NaOHでpHを7.0に調整します。脱イオン水を使用して溶液容量を1 Lに上げ、オートクレーブまたはフィルター滅菌します。または、2xYTメディアを購入します。
   2. S30Bバッファーの場合:14 mM Mg-グルタミン酸、60 mM K-グルタミン酸、および5 mMトリスを2 Lの脱イオン水に溶解した溶液を調製します。2 M Trisを使用してpHを8.2に調整し、オートクレーブで4°Cで保存します。 使用直前にジチオスレイトール(DTT)を終濃度1 mMまで添加して溶液を完成させます。
2. 細胞の調製
   1. 大腸菌BL21(DE3)Rosetta2細胞または他の選択した細胞株(最近の包括的なレビューについてはCole et ^al.44を参照)をLB(Lysogeny Broth)寒天プレートにストリークし、37°Cで10〜14時間インキュベートします。
   2. 単一の 大腸菌 コロニーを使用して、10 mLの培養チューブに3 mLの2xYT培地を接種します。このチューブを37°Cで250rpmで8時間振とうしながらインキュベートします。
   3. 3 mL 培養液から 50 μL を使用して、500 mL フラスコに 50 mL の 2xYT 培地を接種します。このフラスコを37°Cでインキュベートし、250rpmで8時間振とうします。
   4. 50 mLの培養液から7.5 mLを使用して、0.75 Lの2xYT培地を含む4つの4 Lバッフルフラスコにそれぞれ接種します。これらのフラスコを37°Cでインキュベートし、約3〜4時間後に2〜4の600 nmで光学密度に達するまで220 rpmで振とうします。
   5. 各フラスコから細胞を回収し、1 L容器に移し、5,000 x g で4°Cで12分間遠心分離します。 上清を廃液容器にデカントして廃棄する。
   6. 各細胞ペレットを150 mLの氷冷S30Bバッファーでピペットで完全に再懸濁して細胞塊を破壊して洗浄した後、5,000 x g で12分間遠心分離して細胞を再度回収します。上澄み液を捨てる。
   7. 各細胞ペレットを完全に再懸濁し、ピペットを使用して細胞塊を破壊して、40 mLの氷冷S30Bバッファーで再度洗浄します。細胞を事前に秤量した50 mLコニカルチューブに移し、2,000 x g で4°Cで8分間遠心分離して細胞を再度回収します。 上澄み液をデカントして廃棄する。
   8. 湿電池ペレットの重量を量る。チューブを液体窒素に直接入れてセルペレットを瞬間凍結し、-80°Cで保存します。
3. 細胞溶解
   1. セルペレットを氷上で解凍します。
   2. 各細胞ペレットをボルテックスにより細胞ペレット1 gあたり1.4 mLのS30B緩衝液に再懸濁します。
   3. 4°Cで640psiのフレンチ圧力セルで細胞を溶解します。 氷上の微量遠心チューブにライセートを収集し、溶解直後にライセート1 mLあたり3 μLの1 M DTTを追加します。
      注意: 均一な圧力を維持し、圧力の急激な低下を避けるために、小さな金属棒でフランスのプレスリリースバルブをタップするのが最善です。
   4. 30,000 x g で4°Cで30分間遠心分離してライセートを除去し、ペレットを壊さないように注意しながら、上清を新しい氷冷マイクロ遠心チューブにピペッティングした後、ペレットを廃棄します。
   5. 上清を30,000 x g で4°Cで30分間2回遠心分離します。 得られた上清を氷冷した微量遠心チューブにピペットで入れます。ペレットを廃棄します。
   6. 上清を37°Cの水浴中で1時間インキュベートします。
   7. 15,000 x g で4°Cで15分間遠心分離して上清を除去し、得られた上清をペレットを乱さないように注意しながら氷冷のマイクロ遠心チューブに移します。
   8. 上清を15,000 x g で4°Cで15分間2回遠心分離し、得られた上清を氷冷した微量遠心チューブに移し、残りのペレットを破壊しないように注意します。
   9. 上清を100 μLのアリコートで1.5 mLの微量遠心チューブに分配し、液体窒素に直接入れて瞬間凍結します。上清は-80°Cで保存する。

2. リニアテンプレートの準備

1. プライマー設計
   1. コア配列を PCR テンプレートとして選択します。少なくとも、sfGFP(スーパーフォルダー緑色蛍光タンパク質)、LacZ、ホウレンソウアプタマーなどのレポーター配列を含めます。デザインに応じて、ターミネーター、プロモーター、RBSなど、スクリーニングされたバリアント間で修正される他の部品を含めます。
      注:ターミネーターを含めることは、無細胞系における線状DNAからの発現に必ずしも必要ではありません。
   2. フォワードプライマーの場合、コア配列の5'�末端をプライマーの3'末端として一致させる最低20 bpを選択します。構築物の5'末端に部分を追加する場合は、プライマーの5'末端の残りの部分を設計して、PCR増幅を介して目的の遺伝子部分をコア配列に追加します(図1A および 図2)。
      注:~60 bpを超えるプライマーはコストが劇的に増加することが多いため、複数の重複するプライマーを設計して、より長い配列または複数の部分を追加することができます。1回のPCR反応で複数のプライマーを使用できますが、複数回のPCRを行うことをお勧めします。
   3. リバースプライマーの場合、コア配列の3'末端をプライマーの3'末端として一致させるために、最低20 bpを選択します。構築物の3'末端に部分を追加する場合は、プライマーの5'末端の残りの部分を設計して、PCR増幅を介して目的の遺伝子部分をコア配列に追加します(図1A および 図2)。リバースプライマーのアニーリング温度が、フォワードプライマー全体のアニーリング温度の5°C以内であることを確認します。
2. 線形テンプレート増幅
   1. コア配列の数に基づいて実行するPCR反応の数を決定し、 表1を使用して必要な各成分の量を計算します。
   2. 表1に従ってマスターミックスを調製し、氷上に保管します。マスターミックスの30または40 μL(表1を参照)を決定された数のPCRチューブに分注し、各可変プライマー(すなわち、一部変化をコードするプライマー、表1を参照)を5 μMで10 μLずつ適切に標識したPCRチューブに加えます。
   3. PCRチューブをサーモサイクラーに入れ、次のPCRプログラムを実行します:98°Cで3分間;98°Cで15秒、XX°Cで20秒、72°CでYY分の30サイクル。72°Cで10分間の最終延長。その後、反応液を4°Cで保持した。
      ここで、XXは低いアニーリング温度を有するプライマーのアニーリング温度を表し、YYは使用されるハイフィデリティポリメラーゼに関するメーカーの推奨に基づいてアンプリコンの長さについて計算された伸長時間を表す。必要に応じて、さまざまなプライマーやテンプレートに対してこれらの条件を最適化します。
   4. (オプション)1 μLのDpnI制限酵素を加えて、元のテンプレートを消化します。反応液を37°Cで1時間インキュベートします。この手順は、元のテンプレートがプラスミドDNAである場合にのみ実行します。
   5. 各PCR産物の5 μLをゲル電気泳動で分析します。1%アガロースゲルを180 Vで20分間分離します。選択したコア シーケンスと追加されたパーツの長さによって異なる正しいバンド サイズを確認します。
3. 市販のPCR精製キットを使用して、または好ましいPCRクリーンアップ方法によって、リニアテンプレートを精製します。ゲル電気泳動分析で複数のバンドが存在する場合は、PCR条件を最適化するか、メーカーの推奨に従って市販のゲル抽出キットを使用して正しい分子量バンドを精製してください。
4. 分光光度計を使用して各DNAテンプレートを定量します。260 nm/280 nmの比率が約1.8であることを確認して、DNAテンプレートの品質を評価します。
5. (オプション)1%アガロースゲルを使用して180 Vで20分間、DNAテンプレートの一部を分離し、テンプレート精製中に不要なバンドが除去されていることを確認します。
6. 精製したDNAテンプレートをすぐに使用するか、-20°Cで保存してください。

3.精製タンパク質製剤

1. タンパク質発現
   1. 発現させるタンパク質ごとに、適切な発現コンストラクトを組み立てます。コドン- 大腸菌での発現のために遺伝子を最適化します。好ましいプラスミドアセンブリ法を介して、遺伝子をpET-22b発現ベクターまたは他の適切な発現ベクターに挿入します。発現プラスミドをBL21(DE3)Rosetta2発現細胞または他の適切な細胞株に形質転換します。
   2. 各タンパク質について、単一のコロニーを使用して、10 mLの培養チューブに3 mLのLB培地を接種します。これらのチューブを37°Cでインキュベートし、250rpmで一晩振とうします。
   3. 750 mLのLB培地を含む2 Lフラスコに1 mLの一晩培養液を接種します。これらのフラスコを37°Cでインキュベートし、250rpmで振とうして、_OD600 が0.6〜1.0に達するまでインキュベートします。
   4. 各フラスコに水中の1 Mイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド(IPTG)0.75 mLを加えてタンパク質発現を誘導し、250 rpmで4時間振とうしながら37°Cでインキュベートし続けます。
   5. 各フラスコから細胞を回収し、1 L遠心ボトルを使用して、5,000 x g で12分間遠心分離します。上澄み液を捨てる。
   6. ペレットを50 mLコニカルチューブに移し、各ペレットを計量します。細胞を液体窒素で瞬間凍結し、-80°Cで保存するか、ステップ3.2に進みます。
      注:0.75 mLあたり2〜5 gの細胞がこのステップから生じると予想されます。
2. ニッケルアフィニティーカラムクロマトグラフィーによるタンパク質精製
   1. 50 mM Tris-Cl、500 mM NaCl、および5 mM イミダゾールを組み合わせて溶解バッファーを調製します。pH 8.0に調整します。
   2. 50 mM Tris-Cl、500 mM NaCl、および25 mMイミダゾールを組み合わせて洗浄バッファーを調製します。pH 8.0に調整します。
   3. 50 mM Tris-Cl、500 mM NaCl、および250 mMイミダゾールを組み合わせて溶出バッファーを調製します。pH 8.0に調整します。
   4. 50 mM NaHPO₄、100 mM NaCl、および2% DMSOを組み合わせて透析バッファーを調製します。pH 7.5に調整します。
   5. チューブを室温の水に入れてセルペレットを解凍します。細胞ペレット1 gあたり5 mLの溶解バッファーを加え、ボルテックスにより再懸濁します。
   6. 超音波処理によって細胞を溶解する。50 mLのコニカルチューブあたり30 mL以下になるようにセルホモジネートを分離し、各チューブを氷上に置きます。直径0.16cmのプローブを備えた超音波処理器を使用して、30秒の休憩で15秒のラウンドで細胞を溶解し、10回。
      注:これはタンパク質を変性させるので、発泡を避けてください。泡の形成は、それが動作している間、超音波処理器の先端を溶解液中に少なくとも2/3沈めておくことによって回避することができる。超音波処理以外の細胞溶解の他の方法も可能である⁴⁴。
   7. 15,000 x g で4°Cで30分間遠心分離してライセートを除去し、上清を新しい50 mLコニカルチューブに入れます。
   8. 上清5mLごとにニッケル-ニトリロ三酢酸(Ni-NTA)樹脂1mLを加える。細胞ライセート/Ni-NTAスラリーを、50 mLのコニカルチューブあたり36 mL以下になるように分割します。チューブローテーター上で4°C、10rpmで1時間インキュベートします。
   9. 細胞ライセート/Ni-NTAスラリーを2 mL 床容量クロマトグラフィーカラムにデカントしてレジンをロードし、必要に応じて溶離液を収集してさらなる分析を行い、それ以外の場合は廃棄します。10 容量のレジンベッドの洗浄バッファーでレジンを洗浄します。
   10. 3 つのレジンベッド容量の溶出バッファーをカラムに加えてタンパク質を回収し、各タンパク質に適した分子量カットオフメンブレンを備えた遠心濃縮器を使用して容量を 1.5 mL まで濃縮します。
   11. タンパク質を2 Lの透析バッファーに対して4°Cで1時間透析します。2 Lの透析バッファーに対して4°Cで一晩タンパク質を再度透析します。
   12. 280 nmでのモル吸光係数と吸光度を使用してタンパク質を定量します。ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)を使用してタンパク質を分離することにより、タンパク質の純度を分析します。タンパク質を-80°Cで保存します。

4. 無細胞タンパク質合成

1. CFPS反応混合物の調製
   1. Sunら⁴²のアミノ酸溶液調製、エネルギー溶液調製、およびバッファー調製の手順に従って、サプリメントミックスを調製します。別々に保存するか、アリコートで-80°Cで組み合わせて保存してください。最終濃度が、TX-TL反応の実験的実行セクションのSunら⁴² に記載されている濃度と一致することを確認してください。
   2. 線状DNAを分解から保護するための添加剤を準備します。GamS^33,45を使用する場合は、上記のセクション3の手順で準備するか、商用ベンダーから入手してください。他のアプローチについては、対応する文献^46,47,48を確認してください。あるいは、添加剤⁴⁹を必要としないCFPSシステムを使用する。
   3. 上記のセクション3の手順を使用してT7ポリメラーゼ、リプレッサータンパク質、およびその他の添加剤を調製するか、市販のベンダーから入手してください。
   4. 実行するCFPS反応の数を決定し、 表2を使用して必要な各成分の量を計算しました。必要に応じて成分を追加または削除するなど、成分の濃度を変更し、各反応混合物の最終容量が常に10 μLになるように水の量を調整します。同様に、必要に応じて音響液体の取り扱いによって他のコンポーネントのディスペンスを容易にするようにマスターミックスを変更します(「 ディスカッション」 セクションを参照)。
   5. すべての成分を氷上で解凍し、上記で計算したように各成分を混合してマスターミックスを調製します。ピペットですべての成分を完全に混合します。特にアミノ酸混合物については、沈殿を避けるために細心の注意を払ってください。マスターミックスを氷の上に置いておきます。
   6. 384ウェルプレートを氷上で冷却し、マスターミックスを9 μLアリコートで各ウェルに分配します。
      注意: これらのコンポーネントは、音響液体の取り扱いによって分配することは可能ですが、適切に分配されるように注意する必要があります(トラブルシューティングについては、「 ディスカッション 」セクションを参照してください)。
2. 音響液体処理による追加コンポーネントの分配
   1. すべてのCFPS反応に必要なリプレッサータンパク質(およびその他のオプション成分)の量を計算します。
   2. リプレッサータンパク質を氷上で解凍し、音響液体処理ソースプレートまたは他の適切なプレートに分配します。使用するソースプレートのタイプに必要な適切な量のデッドボリュームが含まれていることを確認してください。
   3. リプレッサータンパク質を1 μL容量でリキッドハンドラーを介して適切なウェルに分配します。ディストリビューションのトラブルシューティングの詳細については、「 ディスカッション 」セクションを参照してください。
3. 標準曲線
   1. 精製レポーターの段階希釈(タンパク質精製についてはセクション3を参照)⁴¹ または適切な化学標準⁵⁰をプレートに含めて、他の研究や他のラボと結果を比較できるようにします。使用するレポーターに適した濃度の範囲と、実験の予想される発現範囲を選択してください。
4. CFPS リアクションの実行
   1. プレートリーダーを30°Cに予熱します。 プレートリーダーを、ステップを振らずにコアシーケンスで使用されるレポーターに適した設定で読み取るように設定します。
      注:ここでは30°Cが使用されますが、29°Cと37°Cも一般的に使用され、このプロトコルでうまく機能します。他の温度は、代替の無細胞反応調製物のために好ましいかもしれない。読み取り間隔の場合、ここに示す代表的なデータの良好な分解能を達成するには10分で十分です。ただし、レポータータンパク質と特定のCFPSレシピによっては、他の解像度の方が優れている場合があります。
   2. (オプション)最初にテスト反応を実行して、適切なゲインまたは感度設定を設定し、シグナルオーバーフローなしで蛍光の変化をキャプチャします。
   3. 蒸発を防ぐために、384ウェルプレートを不浸透性のプラスチック製の密閉可能な蓋で密封します。可能であれば、機器で1°Cの垂直温度勾配を設定して、シールの結露を制限します。384ウェルプレートをプレートホルダーに置き、読み取りを開始します。

結果

我々の方法の有用性を実証するために、T7 RNA駆動発現の制御に対するT7プロモーターへのtetO配列の近接性の影響を説明する結果を提示します。完全な結果とその含意は、McManusらの研究³²で見つけることができます。このワークフローを図 1 に示します。プロトコルのセクション2に記載されているように、各プロモーター変異体(図2)を追加するように設計されたプライマーでsfGFPレポーターをPCR増幅することにより、tetO配列に対するT7プロモーターの距離のみが変化する15の線形テンプレートを調製しました。CFPS反応成分および反応は、プロトコールに従って調製した。sfGFPの発現を、音響液体ハンドラーを用いて、12の異なる濃度のTetRタンパク質の滴定で各鋳型から三重に測定した。テンプレートあたり36のCFPS反応と15のテンプレートで、T7-tetOの組み合わせのセット全体で合計540の反応が行われました。全体の評価は、2つのプレートリーダーで2つのプレートで行った。このデータの分析により、T7 RNAPは、T7転写産物の開始から13 bp下流まで、T7駆動型発現を均等にダウンレギュレートすることが示されました(図3)。この結果は、他のリプレッサーによるT7の効果的な抑制のための推定ウィンドウを記述することにより、制御可能なT7駆動遺伝子回路の将来の設計に影響を及ぼします。ここで説明したプロトコルの結果と従来のクローニングによって調製されたDNAを比較すると、フォーマット間のTetR抑制の程度に小さいながらも統計的に有意な違いがあることが明らかになりました。我々は、TetRのベクターDNAへの非特異的結合が観察された違いを説明できると仮定した。実験結果は、線形テンプレートDNAとの反応に線形ベクターDNAを追加すると、非統計的有意性への差が減少することを示しましたが、線形フォーマットと円形フォーマットのDNAらせんの周期性の違いなど、TetR結合に影響を与える可能性のある他の要因からの寄与を排除しませんでした。アプリケーションによっては、リニアテンプレートの使用に追加の検証が必要になる場合があります。

さらに、音響液体処理を使用した正確な分注に関する潜在的な問題に関する代表的なデータを含めます(図4)。0.25 mMのタートラジン色素を含む1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)、pH 7.4の溶液を使用して、容量>1 μLを分注するように音響液体ハンドラーをプログラミングする2つの方法を評価しました。液体分注後、宛先プレートを密閉し、1,500 x gで1分間遠心分離し、プレートリーダーで425 nmの吸光度を測定しました。9つの実験の代表的な結果が示され、5 μLの移送を別々の1 μL分注に分割した場合、一連の8つのデスティネーションウェル間でより一貫した分注が実証されています。これらの観察結果に基づいて、>1 μLのトランスファーを≤1 μLの複数のトランスファーに分解することが推奨されます。プロトコルのこの重要な側面のトラブルシューティングの詳細については、「 ディスカッション 」セクションを参照してください。

図1:無細胞抽出物中のプロモーター部分を評価するための1日のワークフロー。 (A)レポーターは、評価対象の遺伝子部分を含むプライマーを使用してPCR増幅されます(2〜5時間)。(B)無細胞反応ミックスは、プロトコルに詳述されているように調製され、PCR増幅テンプレートとともに384ウェルプレートに分配されます(30分)。(C)アコースティックリキッドハンドリングは、リプレッサータンパク質、エフェクター分子、およびその他の条件付きエフェクター(10分)を含む追加のコンポーネントを分配するために使用されます。(D)各反応からのレポータータンパク質発現をプレートリーダーで測定する(CFPSレシピおよび構築物に応じて2〜16時間)。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:PCR増幅によりレポーター遺伝子に遺伝子部分を付加するためのプライマー設計 。 (A)sfGFPレポーター遺伝子(緑)を増幅し、PCRによりRBS(赤)とT7プロモーター(青)を追加します。(B)sfGFP(緑)とRBS(赤)を増幅し、 PCRによってtetO 配列(金)とT7プロモーター(青)を追加します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:T7駆動発現の制御に対する tetO 位置の影響。 線形および円形テンプレートの最大抑圧値を tetO 位置の関数として正規化しました。トレースは、3回の反復の平均と標準偏差を表します。この図は、クリエイティブ・コモンズのCC-BYライセンスの下でMcManus et ^al.32 から修正されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図4:タートラジン染料を使用して、音響液体ハンドラーで液体の分注を検証します。 黒いバーは、単一のプログラミングコマンドを使用して、単一のソースウェルから384ウェルプレートの8つの連続したデスティネーションウェルのそれぞれに5 μLのタートラジン溶液を分注することを示します。灰色のバーは、1つのプログラミングコマンドを使用して、1つのソースウェルから8つの連続するデスティネーションウェルのそれぞれに1 μLを分注し、このステップを4回繰り返して、各デスティネーションウェルに合計5 μLを分注することを示します。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

コンポーネント名	1反応容量(μL)	X反応数の110%に対する体積(μL)
Q5 PCRプレミックス	25
水	4
テンプレート (1–3 ng/μL)	1
(固定の場合 1)フォワードプライマー (5 μM)	0 または 10
(固定の場合 1)リバースプライマー (5 μM)	0 または 10
マスターミックス合計:	30 または 40
(変数1 の場合)フォワードプライマー (5 μM)	0 または 10
(変数1 の場合)リバースプライマー (5 μM)	0 または 10

表1:PCR反応用試薬の調製のためのワークシート。 右端の列の値は、意図した反応数に応じてユーザーが入力できます。 ¹可変プライマーは、PCR反応で添加される特定の部分を含み、フォワードプライマー、リバースプライマー、またはその両方にすることができます。固定プライマーは一部を追加せず、フォワードプライマーまたはリバースプライマーにすることができますが、両方にすることはできません。

コンポーネント名	1反応容量(μL)	X反応数の110%に対する体積(μL)
細胞エキス	4.2
サプリメントミックス	3.3
ガムSタンパク質 (207 μM)	0.15
テンプレート DNA (20 nM)	1
T7ポリメラーゼ (13 mg/mL)	0.12
水	0.73 (この数値は異なる場合があります)
マスターミックス合計:	9
リプレッサータンパク質:	1

表2:CFPS反応用試薬の調製のためのワークシート。 右端の列の値は、意図した反応数に応じてユーザーが入力できます。

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ディスカッション

ここで説明するプロトコルは、CFPSによるレポータータンパク質の発現を介して遺伝子部分をスクリーニングするための費用効果が高く迅速な手段を提供します。十分に特徴付けられた遺伝子部分は、有用な機能を備えた予測可能な遺伝子回路の設計に不可欠です。この方法論は、細胞ライセートでのタンパク質発現の代謝プロセスを保持することにより、細胞環境を反映する機能を維持しながら、生細胞で働く必要を排除することにより、スループットを向上させ、新しい遺伝子部分のスクリーニングに必要な時間を短縮します。私たちのプロトコルは、プライマーの受領後1日で実行できます(反応準備の場合は~2.5-6時間、CFPS反応の場合は2-16時間; 図1)、従来のクローニングのための少なくとも3日(構築物の組み立ておよび形質転換、クローンの配列検証、および評価のための細胞の培養のためにそれぞれ1日)と比較した。さらに、線状DNAを使用した構築物あたりのコストは、従来のクローニングの約3分の1であると推定しています(78ドル対237ドル; 別表1)メソッド。現在、商用合成サービスはサイズに応じて最低4営業日を見積もりますが、線形フラグメントをCFPSで直接スクリーニングする場合、当社の方法と同様のコストがかかります(78ドル対91ドル)。このアプローチは検証されていません。CFPSで部品を評価するためのコストは、テンプレートDNAの生成と比較して小さいですが(0.05ドル/反応²² 対テンプレートあたり78ドル)、バルク試薬と溶解装置の初期費用は少なくとも数千ドルであることに注意してください。音響液体ハンドラーの使用は、0.5μLまでの小容量を可能にすることにより、コストをわずかに改善するだけです⁴⁰。より重要な利点は、反応を調製する時間の短縮(反応数に応じて~10分対最大1時間)であり、特に多数の反応を調製すると、インキュベーション前に調製反応を長時間放置する懸念が生じる。

迅速かつ費用対効果は高いものの、CFPSプロトタイピングが in vivo 機能を適切に予測する場合の限界はまだ見られません。例えば、ゲノムDNAとの交差反応性は、CFPSシステムの製造中に宿主ゲノムが除去されるため検出されません。また、成分濃度は、細胞⁵¹よりもCFPSで1〜2桁低くなる可能性があり、これは、異なる高分子クラウディング条件の結果として、一部の部分の挙動に影響を与える可能性がある。さらに、線状DNAが in vivo 機能を予測する能力は、例えば、DNA二次構造が重要な役割を果たす場合、制限され得る。最後の制限は、関数をテストする前にコンストラクトがシーケンス検証されないことです。特性評価された部品が、実際には意図した理論シーケンスと整合していない場合があります。これらの制限の全ては、意図された in vivo アプリケーションにおいて、この方法によってスクリーニングされた部品のサブセットを検証することによって軽減することができる。

我々はもともと、ハイブリッドT7-tetOプロ^{モーター32}に対するオペレーターの位置を変えることの影響を調べるためにこの方法論を開発しました。ここでは、プロモーター、オペレーター、リボソーム結合配列、絶縁体、およびターミネーターに適用できるように、より一般的な形式でプロトコルを示しました。これらの遺伝子部分は、各設計のプライマーを使用したPCRによってレポーター遺伝子の5'または3'末端に追加できるため、テストするための各バリアントの合成またはクローニングが不要になります。得られたPCR産物は、レポータータンパク質の発現を介して評価するための鋳型DNAとして機能します。私たちの研究では、ここで提供されるアフィニティー精製プロトコルがTetRとGamSに使用されました。同じ手順を、他のリプレッサー、アクチベーター、ポリメラーゼ、シグマ因子、および目的の遺伝的部分に同義の他のタンパク質の発現および精製に使用することができるが、発現される所望のタンパク質には修飾が必要な場合がある。これらのタンパク質を精製してCFPS反応に滴定することで、特定の遺伝子部分のより詳細な特性評価が可能になります。最後に、多数の代替CFPSプロトコルが存在し、それぞれが方法論の部品スクリーニング部分に適している必要があります。一例として、本発明者らは、このプロトコールに透析ステップを含めず、これは、天然細菌プロ^{モーター22}からの発現に重要であることを他の人が見出した。CFPSの基礎となる構成成分の濃度を変えることも可能です。リキッドハンドリングの使用は、スループットを増加させ、必要な材料を減らすことにより、無数の条件をテストする能力を高めます^34,35。

重要なトラブルシューティングが必要になる可能性のある領域の1つは、音響液体ハンドラーの最適化です。アコースティックリキッドハンドラーディスペンシングは、移送されるコンポーネントごとに最適化する必要があり、データを収集する前に、コントロールを実行して適切な分布と再現性を検証することを強くお勧めします。理想的なソースプレートタイプと液体クラスの設定は、分注する特定の液体とその成分によって異なります。アミンコーティングはDNAと相互作用する可能性があるため、DNAを分注するためにアミンコーティングプレートを使用することはお勧めしません。特定の成分のより高い濃度を分配する能力は、音響液体ハンドラーモデルに依存し得ることにも留意すべきである。試験液の移送は、ホイルプレートシールに分注して、液滴形成の成功を視覚化することによって行うことができます。ただし、このテストでは限られた情報しか提供されず、異なる設定からの液滴が同じように見える場合があります。タートラジンなどの水溶性染料の使用は、所与の設定またはワークフローで分配される正しい量をより正確に検証するために使用され得る( 代表的な結果を参照)。液体移送の最適なプログラミングは、生成されるデータの精度と一貫性にも影響を与える可能性があります。1つのソースウェルから1つのデスティネーションウェルへの>1 μLの移送では、系統的なウェル間の変動を低減するために≤1 μLの順次移送をプログラムする必要があることがわかりました(図4)。最後に、理論上および実際のソースウェルデッドボリュームは、ソースプレートのタイプ、液体クラスの設定、および特定の液体の成分によって大幅に異なる場合があります。プログラムを実行する前に、音響液体ハンドラー調査機能を使用して井戸の体積を評価すると、機器が特定の液体をどれだけ正確に測定できるかを測定するのに役立ちます。

CFPS反応性能は、異なるユーザー、材料のバッチ、プレートリーダー、およびラボ⁴¹間で結果を比較するときに異なる場合があります。遺伝子回路のプロトタイピング中にこのような比較が必要な場合は、実験セットアップ間で結果を正規化するために、各反応プレートに標準構成プロモーターを使用した内部制御反応を含めることをお勧めします。DNA調製の方法もCFPS活性に大きく寄与する可能性があります。エタノール沈殿ステップを含めることが推奨されます。加えて、最適な反応組成は、抽出物³⁴のバッチによって変化し得る。最適なグルタミン酸マグネシウムおよびグルタミン酸カリウム濃度は、特に、バッチ⁴² によって、または使用されたプロモーターまたはレポータータンパク質²⁴によって変動することが示されている。これらの成分の濃度は、タンパク質発現の最適条件を決定するために、遺伝子構築物および細胞抽出物調製物ごとに各成分の数濃度にわたってスクリーニングすることによって最適化されるべきである。最後に、一貫したCFPS反応性能のためのベストプラクティスには、徹底的な混合、慎重なピペッティング、および各試薬成分の調製における一貫性が含まれます。

個々の部品の特性評価を超えて、論理回路¹⁶または発振器^52、53などの複雑な回路を形成する部品の組み合わせをスクリーニングするために同じ方法を使用してもよい。この方法は、疫学診断54,55,56,57またはハザード検出および定量^化3,58,59におけるアプリケーションのためのバイオセンサのスクリーニングおよび最適化にも適用することができる。アクティブラーニング³⁴などのAI駆動型技術の適用は、この方法の高スループットの性質と組み合わせて、複雑な生物学的設計空間の迅速な探索を推進することもできます。最終的には、このアプローチが合成生物学における新しい遺伝子設計の開発期間の短縮をサポートすることを想定しています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x YT medium	Sigma-Aldrich	Y2377-250G	Alternative to making 2xYT media
Agar	Bacto	214010	For plating cells
Chromatography column (5 cm diameter)	BIO-RAD	731-1550	Used for protein purification.
Destination plate	Thermo Scientific Nunc plate	142761	For CFPS reactions
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650	For dialysis buffer
DpnI	NEB	R0176L	For digestion of plasmid templates
DTT	Roche	20871723	S30 Buffer B
E. coli BL21(DE3) Rosetta2	Novagen	70954	Cell line used for production of lysate and purified proteins
Echo acoustic liquid handler	Labcyte	525	Acoustic liquid handler
French pressure cell	Thermo Spectronic	FA-078	For lysing cells for CFPS
Imidazole	Sigma-Aldrich	56750	For buffers
Impermeable plastic sealable lid	Thermo	232702	Plate seal
IPTG	RPI	I56000-25.0	Used for protein induction.
K-Glu	Sigma-Aldrich	g1501-500G	S30 Buffer B
Labcyte Echo source plate	Labcyte	PL-05525	For use with Echo acoustic liquid handler
Mg-Glu	Sigma-Aldrich	49605-250G	S30 Buffer B
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653-250G	For buffers
NaHPO4	Sigma-Aldrich	71505	For dialysis buffer
NaOH	Mallinckrodt Chemicals	7708-10	For making 2xYT media. Currently not produced by Mallinckrodt. Alternate: Sigma-Aldrich S0899
Ni-NTA resin	Invitrogen	R901-15	For production of purified proteins
PCR H2O	Ambion	AM9937	PCR of linear templates
Plate Reader	BioTek	H10	Plate reader used
Q5 PCR Master Mix	NEB	M0494S	PCR of linear templates
QIAquick Gel Extraction Kit	Qiagen	28606	PCR of linear templates
QIAquick PCR Purification Kit	Qiagen	28004	PCR of linear templates
QSonica Ultrasonic Processor	Qsonica	Q700	Cell disruption during protein purification
RTS Amino Acid Sampler	biotechrabbit	BR1401801	Updated supplier from Sun et al.
Tris	MP	819623	S30 Buffer B
Tris-Cl	Sigma-Aldrich	T5941	For buffers
Tryptone	Fluka	T7293	For making 2xYT media
Yeast Extract	Bacto	212750	For making 2xYT media