ヒト多能性幹細胞スフェロイドを担持したコアシェル型マイクロカプセルのマイクロ流体作製

要約

この記事では、同軸流集束装置を用いたヒト多能性幹細胞(hPSC)のカプセル化について説明する。我々は、このマイクロ流体封止技術がhPSCスフェロイドの効率的な形成を可能にすることを実証する。

要約

ヒト多能性幹細胞(hPSC)の三次元(3D)またはスフェロイド培養は、分化転帰およびスケーラビリティの改善という利点を提供する。本稿では、コアシェルマイクロカプセル内にhPSCを閉じ込めるために同軸流集束装置を利用するhPSCスフェロイドの堅牢で再現性のある形成のための戦略を説明する。コア溶液はhPSCsの単一細胞懸濁液を含み、高分子量ポリ(エチレングリコール)(PEG)および密度勾配培地の混入によって粘性を持たせた。シェルストリームはPEG-4アームマレイミドまたはPEG-4-Malで構成され、コアストリームに沿って2つの連続したオイルジャンクションに向かって流れました。液滴形成は、シェル溶液がコアの周りに自分自身を包み込む最初のオイル接合部で起こった。シェルの化学的架橋は、これらの液滴にジチオール架橋剤(1,4−ジチオスレイトールまたはDTT)を導入することによって、第2の油接合部で起こった。架橋剤は、クリック化学 を介して マレイミド官能基と反応し、マイクロカプセルの周囲にヒドロゲルシェルを形成する。当社のカプセル化技術は、直径400μmのカプセルを毎秒10カプセルの割合で製造しました。得られたカプセルは、ヒドロゲルシェルと水性コアを有し、単一細胞が迅速に凝集体に集合し、スフェロイドを形成することを可能にする。カプセル化のプロセスはhPSCの生存率に悪影響を及ぼさず、カプセル化後3日目に>95%の生存率が観察された。比較のために、固体ゲル微粒子(水性コアなし)に封入されたhPSCはスフェロイドを形成せず、封入後3日目に<50%の生存率を有していた。コアシェル型マイクロカプセル内のhPSCのスフェロイド形成は、封入後48時間以内に起こり、スフェロイド直径は細胞接種密度の関数である。全体として、このプロトコルに記載されているマイクロ流体カプセル化技術は、hPSCsカプセル化および回転楕円体形成に適していた。

概要

ヒト多能性幹細胞(hPSC)の3D培養には、この培養フォーマットによってもたらされる改善された多能性および分化能のためにかなりの関心がある¹、^2、3。hPSCは、典型的には、バイオリアクター、マイクロウェル、ヒドロゲル、およびポリマー足場⁴、⁵、⁶によってスフェロイドまたは他の3D培養フォーマットに成形される。カプセル化は、単一のhPSCを回転楕円体に編成するための別の手段を提供する。一旦カプセル化されたhPSCスフェロイドは、容易に取り扱い、分化、疾患モデリング、または薬物検査実験のためにマイクロタイタープレートに移され得る。ヒドロゲル層にhPSCを包み込むと、剪断損傷から細胞を保護し、バイオリアクター内でスフェロイドを高い攪拌速度で培養することができます⁷。

幹細胞カプセル化のための私たちの方法論は、時間の経過とともに進化しました。まず、固体ヒドロゲル微粒子に着目し、マウス胚性幹細胞(mESC)の内包・培養に成功したことを実証しました⁸。しかし、ヒト胚性幹細胞(hESC)は、このようなヒドロゲル微粒子に封入した場合の生存率が低いことが注目されたが、これはおそらく、これらの細胞が封入後に細胞間接触を再確立する必要性が大きいためである。我々は、水性コアを有する不均一なマイクロカプセルが、細胞間接触の迅速な再確立に依存する細胞のカプセル化に適している可能性があると推論した。水性コア/ヒドロゲルシェルマイクロカプセルを製造するための同軸流集束マイクロ流体装置の概念は、He et ^al.9から適応されたが、元のアプローチで採用されたアルギン酸塩の代わりに、PEGベースのヒドロゲルがシェルに組み込まれた。我々はまず、コアシェル型マイクロカプセル¹⁰ における初代肝細胞のカプセル化およびスフェロイド形成の成功を実証し、最近ではhESおよびiPS細胞のカプセル化⁷について説明した。 図1Aで概説されているように、カプセルは、シェルおよびコアの流れが油相に放出される前に、左右から同軸の流れに移行するフロー集束装置内で製造される。コアフローには溶液の粘度を増加させる細胞および添加剤(非反応性PEG MW 35kDおよびイオジキサノール - 商品名OptiPrep)が含まれ、シェルストリームには反応性分子(PEG-4-Mal)が含まれています。連続的な同軸流流は、コアシェルアーキテクチャを保持する液滴に離散化される。コアシェル構造は、クリック化学 を介して PEG-4-Malと反応し、薄い(〜10μm)ヒドロゲルスキンまたはシェルの形成をもたらすジチオール架橋剤(DTT)への曝露によって恒久的になる。エマルジョンが破壊され、カプセルが水相に移された後、PEGの分子はコアから拡散し、水分子によって置き換えられる。これは、水性コアおよびヒドロゲルシェルマイクロカプセルをもたらす。

以下に、マイクロ流体デバイスの製造方法、細胞の調製方法、およびhPSCのカプセル化方法に関するステップバイステップの手順を示します。

プロトコル

1. デバイス製造

1. マイクロカプセル化装置及び解離装置の設計は、CADソフトウェア^10,11を用いて^行う。
2. SU-8フォトレジストの3層をシリコンウェーハ上に順次スピンコートし(図2A)、所望の高さ(60、100、および150μm)の構造を達成する。
   メモ: 上部金型と下部金型のプロセスは同じです。
   1. SU-8 2025ネガ型フォトレジストでクリーンな10cmシリコンウェハを1,100rpmでスピンコートし、最初の60μm層を作成しました。ホットプレート上で65°Cで3分間、95°Cで10分間ソフトベークした後、μPG 101PCにコアチャネルパターンの設計ファイルをアップロードしてマスクレスアライナーを用いて金型を露出させた。その後、65°Cで3分間、95°Cで10分間露光後ベークを進めた。
   2. 2番目のSU-8 2025レイヤー(40μm)を1,500rpmでスピンコートし、シェルチャンネルパターンに適したCADファイルをアップロードして露光します。
      メモ: ソフトベイクと露光後のベイクは、前の手順と類似していました。
   3. 3番目のSU-8 2025層を1,400rpmでスピンコートして高さ50μmを達成し、上記のプロセスを繰り返しますが、油相の構造を露出させます。
   4. 未露光のフォトレジストが全て除去されるまでSU-8現像液に浸漬して3層全てを1段階で現像する。
   5. 金型を160°Cのホットプレート上で10分間ハードベークして密着性を向上させ、現像後に発生する可能性のある小さなクラックをシールします。
   6. 次のステップでエラストマーの結合を避けるために金型をクロロトリメチルシランにさらし、使用するまで15cmのペトリ皿に入れます。
3. 図1D及び図2Bで説明したように、同様に解離装置用モールドを準備する。ステップ1.2.3で前述したように、シリコンウェーハ上にSU-8フォトレジストの1層をスピンコートして、所望の高さ(50μm)の構造を達成する。前のステップと同様に、ソフトベイクと露光後のベイク、現像、ハードベイクを行います。
   注:三角形の支柱の配列がチャンバ全体を覆い、チャンバの幅が出口に向かって減少するにつれてポスト間の間隔が狭まりました。三角形の支柱は、400 μm(入口)から30 μm(出口)の範囲のピッチで、片面あたり200 μmであった。
4. ポリジメチルシロキサン(PDMS)を用いたソフトリソグラフィー法により金型を作製した。
   1. PDMSエラストマーベースとエラストマー硬化剤を遊星遠心分離機で10:1のw / w比で混合します。マイクロカプセル化マスターモールドと解離マスターモールドの両方に混合物を注ぎ、3〜4mmの層を作成します。
      注:50gのエラストマーベースと5gの硬化剤の混合物は、厚さ3mmのマスターモールドを覆うのに十分です。
   2. 金型を入れたシャーレを真空デシケーターに15分間置き、未硬化PDMSを脱気した。
   3. ペトリ皿をオーブンに移し、80°Cで最低60分間焼く。
   4. オーブンからマスターモールドを取り外し、冷却させます。精密ナイフを使用して、ウェーハの形状に合わせてPDMSを慎重に切断し、PDMS片をマスターモールドから剥がします。
   5. メスで各デバイスのエッジをトリミングしてPDMSスラブを切り取り、解離デバイスの入口/出口流体ポートをパンチアウトし、ステンレス製の針を使用して上部のマイクロ流体デバイスのみにパンチアウトします。汚染を避けるために、デバイスをマジックテープで覆います。
      メモ: ニードルゲージは、入口ポートと出口ポートでそれぞれ 14 G と 15 G です。
   6. 接合のために、PDMS片の上下のパターン化された側面を、プラズマエッチャー上の_O2 プラズマで2分間処理する。
   7. 両方のPDMS部品を立体鏡の下に合わせ、蒸留水の薄い分離層をマイクロチャネル(2μL)に直接加えます。
   8. アライメントされたPDMS装置を80°Cのオーブンに一晩置いて接合を完了し、PDMSを元の疎水性状態に戻した。さらに使用するまで、デバイスを保管してください。
      注:これにより、コア用に120μm、シェル用に200μm、オイルチャネル用に300μmの3つの異なる高さを有する同軸フローフォーカシング装置が得られます。
   9. プラズマ接合直後にデバイスを使用するには、疎水性コーティング溶液30 μLを流体チャネルに慎重に、しかししっかりと注入し、疎水性コーティングを達成します。次いで、疎水性コーティング溶液の残留物が装置内で観察されなくなるまで、チャネルに空気を直ちにパージする。
   10. まず装置のパターン化された側と洗浄されたスライドガラスを_O2 プラズマで2分間処理して解離装置を接着し、次いで80°Cのオーブンで一晩さらに硬化させるためにそれらを組み立てる。
       メモ: デバイスは、その後使用するまで保管できます。

2. 溶液の調製

1. ストックソリューション。まず、実際の使用のためにより低い濃度に希釈されるストック溶液(濃縮溶液)を調製する。
   注:ストックソリューションは、低濃度で作業溶液を調製する際の準備時間の節約、材料の節約、保管スペースの削減、および精度の向上に使用されます。
   1. 30 mL の 2x コア溶液 (16% PEG および 34% 密度グラジエント培地) を調製します: 4.8 g の 35 kDa PEG、10.2 mL の密度グラジエントメディア、および 19.8 mL の DMEM/F12 培地を混合します。このコア溶液を0.22μmのシリンジフィルターを使用してろ過します。
   2. 50 mLの鉱物油を3%界面活性剤で調製する:48.5 mLの鉱物油と1.5 mLの界面活性剤を混ぜる。0.22 μmのシリンジフィルターでろ過した後、滅菌状態に保ちます。
   3. 50 mLの鉱物油を0.5%界面活性剤で調製する:49.75 mLの鉱物油と0.25 mLの界面活性剤を混ぜる。無菌状態に保ちます。
   4. 1 Mジチオセリトール(DTT)を調製する:1.5425gのDTTを10mL蒸留水に溶解する。無菌状態に保ちます。
   5. 1 Mトリエタノールアミン(TEA)を調製する:433.6 μLの蒸留水に66.4 μLのTEAを加える。無菌状態に保ちます。
   6. 1%プルロニックF127(PF127)を調製する:100mgのPF127を10mLの蒸留水に溶解する。無菌状態に保ちます。
2. 実用的なソリューション
   1. 4.5 mL の鉱物油と 3% 界面活性剤、および 300 μL の 1 M DTT (1:15 比) を混合して架橋剤エマルジョンを調製します。溶液を2分間ボルテックスし、20°Cの超音波浴中で45〜60分間超音波処理する。 この溶液を27G針で5mLシリンジにロードする。
      注:エマルジョンは、油/水混合物を超音波処理することによって生成されます。
   2. 27G針で5mLシリンジに0.5%界面活性剤を含む鉱物油をロードすることによって遮蔽油溶液を調製する。
   3. 400 μLの1x DPBSに32 mgのPEG-4-Malを加えてシェル(8% w/v PEG-4-Malおよび15 mM TEA)溶液を調製し、8% w/v溶液を形成し、この溶液を2分間渦巻きます。その後、6 μLの1 M TEA(終濃度15 mM TEA)を添加する。最後に、スピンフィルターを通して13,000 x g で5分間遠心分離し、ロッカーの上で30分間暗闇の中に保ちます。次に、この溶液を27G針で1mLシリンジにロードする。
      注:蓋を開ける前にPEG-4-Mal容器を室温で10分間放置し、蓋を閉じる前にN2ガスを吹き込んでO2を_N2に置き換えてください。 溶液に添加する前にボルテックスTEAを。
3. コア溶液中の細胞懸濁液を調製する
   1. hPSCをトリプシンで37°Cで5〜10分間処理する。 それから、それらを皿から集めます。細胞剥離後にトリプシンを培地でクエンチし、次いで細胞を15mL円錐管に移す。
   2. バルク細胞懸濁液を遠心分離機(400 x g、5分間)する。上清を注意深く吸引し、次いで、最小限の体積の増殖培地を用いて細胞ペレットを再懸濁する。自動セルカウンターを使用してセルをカウントします。
      注:典型的な細胞アリコートは12〜20 x¹⁰⁶ 個の細胞を含み、400 μLのコア溶液を作るのに十分である。
   3. バルク細胞懸濁液から12〜20 x¹⁰⁶ 個の細胞を取り、細胞/培地懸濁液を遠心分離する(400 x g、5分間)。
   4. 細胞ペレットから培地を注意深く吸引する。次いで、200 μL培地および200 μLの2x PEG溶液(最終濃度30〜50 x¹⁰⁶ cell/mL)を加え、穏やかに混合する。
      注:低い細胞濃度(20 x¹⁰⁶ 細胞/ mL未満)は、多くの空のカプセルをもたらした。
   5. 30 μLの1% PF127を溶液に加える。
   6. マイクロスターラーバー (2 mm x 7 mm) を 1 mL シリンジに挿入し、コア溶液を含むセルを 27 G 針でシリンジにロードします。カプセル化プロセス全体を通して、溶液を氷で冷たく保ちます。

3. 実験セットアップ

1. 結合したPDMS液滴装置、長さ20cm、長さ5cmの入口マイクロチューブ(内径0.38mm×外径1.1mm)、出口チューブ1本(内径0.5mm×外径1.5mm)、および0.5cmフィッティングチューブ6本(内径1mm×外径1.8mm)を殺菌光源(通常は生物学的安全キャビネットに内蔵)の下に置き、30分間滅菌します。分。
2. 鉗子を使用して、チューブを流体入口ポートと解離ポートにフィットさせます。
3. シェルには長さ20cmのマイクロチューブの3本、オイル、架橋剤エマルジョンの注入口には1本、解離装置の入口には1本を使用します。次に、チューブの反対側の端を、対応する溶液でシリンジの針に挿入する。一方、マイクロ流体デバイスのコア入口と解離デバイスの出口を1本の5cmマイクロチューブで接続する(図1C)。
   メモ: 入口マイクロチューブは、最後のステップで挿入された継手チューブ内にしっかりと固定する必要があります。
4. 1 本の出口チューブを流体出口ポートに挿入し、反対側の端を収集リザーバーに入れます。
5. 装置を顕微鏡ステージに置き、チューブを取り付けて動かないようにします。流量検査のために、顕微鏡をデバイスノズルに合わせ、焦点を合わせます。
6. 各シリンジを異なるシリンジポンプの上に置き、適切に固定します(図1B)。メーカーのプロトコルに従って、各ポンプを次の流量にプログラムします:コア(3-5 μL/分)、シェル(3-5 μL/分)、シールドオイル(20-80 μL/分)、および架橋オイル(40-60 μL/分)。すべてのポンプでフローを開始します。
7. 各流体がデバイスに入るのを待ち、残りの空気を押し出しながらチャネルをいっぱいにします。
   メモ: 入口チューブに大量の空気がある場合は、空気が完全に除去されるまで、各流量を一時的に増やしてください。過剰な流量は、PDMSとPDMS間の結合不良につながる可能性があることに注意してください。
8. カプセル形成が安定したら(図3)、収集チューブの反対側の端を、5mLのmTeSR培地を含む新しい円錐形チューブに置きます。
   注:培地には、10 μM ROCK阻害剤、100 U/mLペニシリン、および100 μg/mLストレプトマイシンが含まれています。
9. 十分な数のカプセルが回収された後、5%_CO2 と共に37°Cで10分間インキュベートする。油相に常駐するカプセルは、チューブの上部にある( 図4A参照)。チューブを軽く叩くと、カプセルが底に沈降します。この後、ほとんどの油および媒体が吸引され得る。
10. 円錐管の底からカプセルを集め、セルストレーナー(孔径100μm)の上に置き、大量の培地で洗浄する。次いで、2mL培地を用いてマイクロカプセルを6ウェル培養プレートに集め、培地をウェルプレートの上に反転させたままフィルターに通した( 図4A参照)。

4. マイクロカプセル中のhPSC培養および分析

1. 基本的な文化
   1. 幹細胞カプセルを6ウェルプレート培養皿中で5%_CO2と共に37°Cでインキュベートする。
   2. 1日おきに培地を交換するには、カプセルをセルストレーナーフィルターに集め、余分な培地で洗浄し、ステップ3.10で行ったように2mL培地で6ウェルプレートの新しいウェルに再懸濁します。
   3. カプセルを少なくとも10日間培養する。
2. 生/死アッセイを実行して、封入幹細胞の生存率を判断します。
   1. 生/死アッセイ溶液(エチジウムホモダイマー-1およびカルセインAM)を解凍する。
   2. 4 μL の 2 μM エチジウムホモ二量体-1 および 1 μL の 4 μM カルセイン AM 溶液を 2 mL の滅菌 DPBS に加えます。完全な混合を確実にするための渦。
   3. セルストレーナーに約100個のマイクロカプセルを集め、滅菌DPBSですすぎ、カプセルから培地を拡散させます。
   4. ステップ4.2.2で調製した溶液1mLを用いて、それらを再び12穴培養プレートに集める。37°Cで20分間インキュベートする。
   5. 蛍光顕微鏡下で細胞を可視化する。
      注: 細胞生存率は、細胞の総数のうち、緑色で視覚化された生細胞の割合を計算することによって定量化されます。
3. 回転楕円体サイズの特性評価。
   1. 必要に応じて、マイクロカプセルの入ったウェルプレートを顕微鏡下に置き、適切なスケールバーを使用して関連ソフトウェアに表示される回転楕円体の直径を測定します。
   2. 回転楕円体のサイズを測定および分析します。

結果

上記のプロトコルに従うことによって、読者はマイクロ流体デバイスを作製し、細胞運搬マイクロカプセルを製造することができるであろう。 図3A は、マイクロ流体液滴生成を用いて作製された最適および非最適マイクロカプセルの例を示す。PEG−4−Malの異なる製剤は、様々な形態のカプセルをもたらした - しわのあるカプセルは、貧弱なゲル化、低い機械的完全性?...

ディスカッション

ここで説明するカプセル化プロセスは、hPSCスフェロイドの再現性のある形成をもたらす。マイクロカプセル形式により、分化プロトコルの改善/最適化または治療法の試験を目的とした実験のために、マイクロタイタープレートのウェルにスフェロイドを簡単に分配できます。封入幹細胞スフェロイドは、ヒドロゲルシェルが剪断誘発損傷から細胞を保護する懸濁培養においても使用され得?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe Filters	Genesee Scientific	25-244
1 ml syringe luer-lock tip	BD	309628
1x DPBS	Corning	23220003
4-arm PEG maleimide, 10kDa	Laysan Inc.	164-68
5 ml syringe luer-lock tip	BD	309646
6-WELL NON-TREATED PLATE	USA Scientific	CC7672-7506
Aquapel Applicator Pack	Aquapel Glass Treatment	47100
CAD software	Autodesk	AutoCAD v2020
CELL STRAINER 100 µm pore size	cardinal	335583
Chlorotrimethylsilane	Aldrich	386529-100mL
Countess II FL Automated Cell Counter	Life technology	A27974
Digital hot plate	Dataplate
Digital vortex mixer	Fisher Scientific	215370
Distilled water	Gibco	15230-162
Dithiotheritol (DTT)	Sigma	D0632-10G
DMEM/F12 media	gibco	11320-033
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge	live	13-100-675
HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Inverted Fluorescence Motorized Microscope	Olympus	Olympus IX83
Laurell Spin Coaters	Laurell Technologies	WS-650MZ-23NPPB
Live/Dead mammalian staining kit	Fisher	L3224
Magic tape	Staples	483535
Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.)	Scientific Commodities, Inc	BB31695-PE/2
Micro stir bar	Daigger Scientific	EF3288E
MilliporeSigma Filter Forceps	Fisher scientific	XX6200006P
Mineral oil	Sigma	M8410-1L
mTeSR 1 Basal Medium	STEMCELL TECHNOLOGY	85850
Needles-Stainless Steel  14 Gauge	CML supply	901-14-025
Needles-Stainless Steel  15 Gauge	CML supply	901-15-050
OptiPrep	STEMCELL TECHNOLOGY	7820
Oven	Thermo Scientific	HERA THERM Oven
Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)	Gemini	400-109
Petri Dish 150X20 Sterile Vent	Sarstedt, Inc.	82.1184.500
Plasma Cleaning System	Yield Engineering System, Inc.	YES-G500
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
Poly(ethylene glycol) 35kDa	Sigma	94646-250G-F
PrecisionGlide Needle 27G	BD	305109
Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride	SELLECK CHEM	S1049-10mg
Silicon wafer 100mm	University Wafer	452
Slide glass (75mm ´ 25mm)	CardinalHealth	M6146
Span 80	Sigma	S6760-250ML
SpeedMixer	Thinky	ARE-310
Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm)	Costar	8160
SU-8 2025	Kayaku Advanced Materials	Y111069 0500L1GL
SU-8 developer	Kayaku Advanced Materials	Y020100 4000L1PE
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades	fisher scientific	22-079-684
SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	2065622
Syringe pump	New Era Pump System, Inc	NE-4000
Triethanolamine	Sigma-aldrich	T58300-25G
TrypLE Express	Gibco	12604-013
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.)	Cole-Parmer	06419-01
Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.)	Cole-Parmer	06419-04
Ultrasonic cleaner FS20D	Fisher Scientific	CPN-962-152R
Vacuum desiccator	Bel-Art	F42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x	ZEISS	435421-0000-000
μPG 101 laser writer	Heidelberg Instruments	HI 1128