인간 다능성 줄기 세포 구상체를 운반하는 코어-쉘 마이크로캡슐의 미세유체 제조

요약

이 기사는 동축 유동 초점 장치를 사용하여 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 캡슐화를 설명합니다. 우리는이 미세 유체 캡슐화 기술이 hPSC 구상체의 효율적인 형성을 가능하게한다는 것을 보여줍니다.

초록

인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 3차원 (3D) 또는 스페로이드 배양은 향상된 분화 결과 및 확장성의 이점을 제공한다. 이 논문에서는 동축 흐름 초점 장치를 사용하여 코어 쉘 마이크로 캡슐 내부에 hPSC를 포획하는 hPSC 구상체의 견고하고 재현 가능한 형성을위한 전략을 설명합니다. 코어 용액은 hPSCs의 단일 세포 현탁액을 함유하고, 고분자량 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG) 및 밀도 구배 매질의 혼입에 의해 점성으로 만들어졌다. 쉘 스트림은 PEG-4 암-말레이미드 또는 PEG-4-Mal로 구성되고, 코어 스트림과 함께 두 개의 연속적인 오일 접합부를 향해 흘렀다. 액적 형성은 첫 번째 오일 접합부에서 발생했으며 쉘 용액은 코어 주위를 감싸고 있습니다. 쉘의 화학적 가교결합은 이들 액적에 디티올 가교결합제(1,4-디티오트레이톨 또는 DTT)를 도입함으로써 제2 오일 접합부에서 발생하였다. 가교제는 클릭 화학을 통해 말레이미드 작용기와 반응하여 마이크로 캡슐 주위에 하이드로겔 쉘을 형성합니다. 당사의 캡슐화 기술은 초당 10 캡슐의 속도로 직경 400 μm 캡슐을 생산했습니다. 결과 캡슐에는 하이드로겔 쉘과 수성 코어가있어 단일 세포가 응집체로 빠르게 조립되어 구상체를 형성 할 수있었습니다. 캡슐화 과정은 hPSCs의 생존력에 악영향을 미치지 않았으며, 캡슐화 후 3 일 동안 관찰 된 >95 %의 생존력으로 나타났습니다. 비교를 위해, (수성 코어 없이) 고체 겔 미세입자로 캡슐화된 hPSCs는 구상체를 형성하지 않았고, 캡슐화 3일 후에 <50%의 생존력을 가졌다. 코어-쉘 마이크로캡슐 내부의 hPSCs의 스페로이드 형성은 캡슐화 후 48시간 이내에 발생했으며, 스페로이드 직경은 세포 접종 밀도의 함수이다. 전반적으로, 이 프로토콜에 기술된 미세유체 캡슐화 기술은 hPSCs 캡슐화 및 스페로이드 형성에 매우 적합하였다.

서문

인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)의 3D 배양에는 이러한 배양 형식 ^1,2,3에 의해 제공되는 향상된 다능성 및 분화 잠재력으로 인해 상당한 관심이 있다. hPSC는 전형적으로 생물반응기, 마이크로웰, 하이드로겔 및 중합체성 스캐폴드 ^4,5,6을 통해 구상체 또는 다른 3D 배양 포맷으로 형성된다. 캡슐화는 단일 hPSC를 구상체로 조직하는 또 다른 방법을 제공합니다. 일단 캡슐화된 hPSC 구상체는 용이하게 처리되고 분화, 질병 모델링, 또는 약물 시험 실험을 위해 마이크로타이터 플레이트로 옮겨질 수 있다. 하이드로겔 층에 hPSC를 포위하는 것은 또한 전단 손상으로부터 세포를 보호하고, 높은 교반 속도로 생물반응기에서 구상체를 배양할 수 있게^한다(7).

줄기 세포 캡슐화에 대한 우리의 방법론은 시간이 지남에 따라 진화했습니다. 첫째, 우리는 고체 하이드로겔 미세입....

프로토콜

1. 장치 제작

1. CAD 소프트웨어^10,11을 사용하여 마이크로 캡슐화 장치 및 해리 장치에 대한 설계를 ^{수행합니다.}
2. SU-8 포토레지스트의 세 층을 실리콘 웨이퍼 상에 순차적으로 스핀 코팅하여(도 2A) 원하는 높이의 구조를 달성한다: 60, 100 및 150 μm.
   참고: 상단 및 하단 금형의 공정은 동일합니다.
   1. 깨끗한 10 cm 실리콘 웨이퍼를 SU-8 2025 네거티브 포토레지스트를 1,100 rpm으로 스핀 코팅하여 첫 번째 60 μm 층을 만들었다. 핫플레이트 상에서 3분 동안 및 95°C에서 10분 동안 65°C에서 소프트 베이킹한 후, 코어 채널 패턴의 설계 파일을 μPG 101 PC에 업로드하여 마스크리스 얼라이너를 사용하여 몰드를 노출시킨다. 이어서, 노광 후 베이크를 65°C에서 3분 동안 및 95°C에서 10분 동안 진행한다.
   2. 두 번째 SU-8 2025 레이어(40μm)를 1,500rpm으로 회전시키고 셸 채널 패턴에 적합한 CAD 파일을 업로드하여 노출합니다.
      참고: 소프트 베이크와 노출 후 베이크는 이전 단계와 비슷했습니다.
   ....

결과

상기 언급된 프로토콜에 따라, 리더는 미세유체 장치를 제조하고 세포 운반 마이크로캡슐을 생산할 수 있을 것이다. 도 3A는 마이크로유체 액적 생성을 사용하여 제조된 최적 및 차선책의 마이크로캡슐의 예를 도시한다. PEG-4-Mal의 상이한 제형은 다양한 형태의 캡슐을 초래하였다 - 주름진 캡슐은 불량한 겔화, 낮은 기계적 완전성과 관련되었고, 교반된 생물반응기에서의 배?.......

토론

여기에 설명된 캡슐화 과정은 hPSC 구상체의 재현 가능한 형성을 초래한다. 마이크로 캡슐 형식을 사용하면 분화 프로토콜 개선 / 최적화 또는 치료법 테스트를 목표로하는 실험을 위해 구상체를 마이크로 타이터 플레이트의 웰에 쉽게 분배 할 수 있습니다. 캡슐화된 줄기 세포 구상체는 또한 하이드로겔 쉘이 전단-유도된 손상으로부터 세포를 보호하는 현탁 배양물에서 사용될 수 있다

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe Filters	Genesee Scientific	25-244
1 ml syringe luer-lock tip	BD	309628
1x DPBS	Corning	23220003
4-arm PEG maleimide, 10kDa	Laysan Inc.	164-68
5 ml syringe luer-lock tip	BD	309646
6-WELL NON-TREATED PLATE	USA Scientific	CC7672-7506
Aquapel Applicator Pack	Aquapel Glass Treatment	47100
CAD software	Autodesk	AutoCAD v2020
CELL STRAINER 100 µm pore size	cardinal	335583
Chlorotrimethylsilane	Aldrich	386529-100mL
Countess II FL Automated Cell Counter	Life technology	A27974
Digital hot plate	Dataplate
Digital vortex mixer	Fisher Scientific	215370
Distilled water	Gibco	15230-162
Dithiotheritol (DTT)	Sigma	D0632-10G
DMEM/F12 media	gibco	11320-033
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge	live	13-100-675
HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Inverted Fluorescence Motorized Microscope	Olympus	Olympus IX83
Laurell Spin Coaters	Laurell Technologies	WS-650MZ-23NPPB
Live/Dead mammalian staining kit	Fisher	L3224
Magic tape	Staples	483535
Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.)	Scientific Commodities, Inc	BB31695-PE/2
Micro stir bar	Daigger Scientific	EF3288E
MilliporeSigma Filter Forceps	Fisher scientific	XX6200006P
Mineral oil	Sigma	M8410-1L
mTeSR 1 Basal Medium	STEMCELL TECHNOLOGY	85850
Needles-Stainless Steel  14 Gauge	CML supply	901-14-025
Needles-Stainless Steel  15 Gauge	CML supply	901-15-050
OptiPrep	STEMCELL TECHNOLOGY	7820
Oven	Thermo Scientific	HERA THERM Oven
Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)	Gemini	400-109
Petri Dish 150X20 Sterile Vent	Sarstedt, Inc.	82.1184.500
Plasma Cleaning System	Yield Engineering System, Inc.	YES-G500
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
Poly(ethylene glycol) 35kDa	Sigma	94646-250G-F
PrecisionGlide Needle 27G	BD	305109
Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride	SELLECK CHEM	S1049-10mg
Silicon wafer 100mm	University Wafer	452
Slide glass (75mm ´ 25mm)	CardinalHealth	M6146
Span 80	Sigma	S6760-250ML
SpeedMixer	Thinky	ARE-310
Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm)	Costar	8160
SU-8 2025	Kayaku Advanced Materials	Y111069 0500L1GL
SU-8 developer	Kayaku Advanced Materials	Y020100 4000L1PE
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades	fisher scientific	22-079-684
SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	2065622
Syringe pump	New Era Pump System, Inc	NE-4000
Triethanolamine	Sigma-aldrich	T58300-25G
TrypLE Express	Gibco	12604-013
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.)	Cole-Parmer	06419-01
Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.)	Cole-Parmer	06419-04
Ultrasonic cleaner FS20D	Fisher Scientific	CPN-962-152R
Vacuum desiccator	Bel-Art	F42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x	ZEISS	435421-0000-000
μPG 101 laser writer	Heidelberg Instruments	HI 1128