Fabrication microfluidique de microcapsules noyau-coquille transportant des sphéroïdes de cellules souches pluripotentes humaines

Résumé

Cet article décrit l’encapsulation de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) à l’aide d’un dispositif de focalisation à flux coaxial. Nous démontrons que cette technologie d’encapsulation microfluidique permet la formation efficace de sphéroïdes hPSC.

Résumé

Les cultures tridimensionnelles (3D) ou sphéroïdes de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) offrent les avantages d’une différenciation améliorée et d’une évolutivité améliorée. Dans cet article, nous décrivons une stratégie pour la formation robuste et reproductible de sphéroïdes hPSC où un dispositif de focalisation d’écoulement coaxial est utilisé pour piéger les hPSC à l’intérieur de microcapsules noyau-coque. La solution de base contenait une suspension unicellulaire de CSEh et a été rendue visqueuse par l’incorporation de poly(éthylène glycol) (PEG) de haut poids moléculaire et de milieux de gradient de densité. Le flux de coquille composé de maléimide de bras PEG-4 ou PEG-4-Mal et s’écoulait le long du flux de noyau vers deux jonctions pétrolières consécutives. La formation de gouttelettes s’est produite à la première jonction d’huile avec une solution de coquille s’enroulant autour du noyau. La réticulation chimique de la coquille s’est produite au deuxième carrefour d’huile en introduisant un réticulant di-thiol (1,4-dithiothréitol ou DTT) dans ces gouttelettes. Le réticulant réagit avec les groupes fonctionnels de maléimide via la chimie du clic, ce qui entraîne la formation d’une coquille d’hydrogel autour des microcapsules. Notre technologie d’encapsulation a produit des capsules de 400 μm de diamètre à raison de 10 capsules par seconde. Les capsules résultantes avaient une coquille d’hydrogel et un noyau aqueux qui permettaient aux cellules individuelles de s’assembler rapidement en agrégats et de former des sphéroïdes. Le processus d’encapsulation n’a pas eu d’effet négatif sur la viabilité des CSH, avec une viabilité de >95 % observée 3 jours après l’encapsulation. À titre de comparaison, les CSEh encapsulés dans des microparticules de gel solide (sans noyau aqueux) n’ont pas formé de sphéroïdes et avaient une viabilité de <50% 3 jours après l’encapsulation. La formation de sphéroïdes de CSEh à l’intérieur des microcapsules noyau-enveloppe s’est produite dans les 48 heures suivant l’encapsulation, le diamètre du sphéroïde étant fonction de la densité d’inoculation cellulaire. Dans l’ensemble, la technologie d’encapsulation microfluidique décrite dans ce protocole était bien adaptée à l’encapsulation des HSPC et à la formation de sphéroïdes.

Introduction

Il existe un intérêt considérable pour les cultures 3D de cellules souches pluripotentes humaines (CSEh) en raison de l’amélioration de la pluripotence et du potentiel de différenciation offerts par ce format^{de culture 1,2,3}. Les cSEh sont généralement formés en sphéroïdes ou en d’autres formats de culture 3D au moyen de bioréacteurs, de micropuits, d’hydrogels et d’échafaudages polymères ^4,5,6. L’encapsulation offre un autre moyen d’organiser des hPSC simples en sphéroïdes. Une fois encapsulés, les sphéroïdes hPSC peuvent être manipulés facilement et transférés dans des plaques de microtitrage pour la différenciation, la modélisation de la maladie ou les expériences de test de médicaments. L’enrobage des CSEh dans une couche d’hydrogel protège également les cellules contre les dommages de cisaillement et permet de cultiver des sphéroïdes dans un bioréacteur à des taux d’agitation élevés⁷.

Notre méthodologie pour l’encapsulation des cellules souches a évolué au fil du temps. Tout d’abord, nous nous sommes concentrés sur les microparticules d’hydrogel solides et avons démontré le succès de l’encapsulation et de la culture de cellules souches embryonnaires (CSM) de ^souris8. Cependant, il a été noté que les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) avaient une faible viabilité lorsqu’elles étaient encapsulées dans de telles microparticules d’hydrogel, probablement en raison de la plus grande nécessité pour ces cellules de rétablir les contacts cellule-cellule après l’encapsulation. Nous avons estimé que la microcapsule hétérogène, possédant un noyau aqueux, pourrait être mieux adaptée à l’encapsulation de cellules qui dépendent du rétablissement rapide des contacts cellule-cellule. Le concept de dispositif microfluidique de focalisation à écoulement coaxial pour la fabrication de microcapsules à noyau aqueux / coquille d’hydrogel a été adapté de He et ^al.9, mais au lieu de l’alginate utilisé dans l’approche originale, un hydrogel à base de PEG a été incorporé dans la coque. Nous avons d’abord démontré avec succès l’encapsulation et la formation de sphéroïdes d’hépatocytes primaires dans des microcapsules noyau-enveloppe¹⁰ et, plus récemment, nous avons décrit l’encapsulation de cellules hES et iPS⁷. Comme indiqué à la figure 1A, les capsules sont fabriquées dans un dispositif de focalisation de l’écoulement où la coque et les flux d’écoulement du noyau passent d’un flux d’un côté à l’autre à l’écoulement coaxial avant l’éjection dans la phase huileuse. Le flux de noyau contient des cellules et des additifs qui augmentent la viscosité de la solution (PEG MW 35kD non réactif et iodixanol - nom commercial OptiPrep) tandis que le flux de coquille contient des molécules réactives (PEG-4-Mal). Le flux d’écoulement coaxial continu est discrétisé en gouttelettes qui conservent l’architecture noyau-coque. La structure noyau-coquille est rendue permanente par l’exposition à un réticulant di-thiol (DTT), qui réagit avec le PEG-4-Mal via la chimie du clic et entraîne la formation d’une peau ou d’une coquille d’hydrogel mince (~ 10 μm). Une fois l’émulsion brisée et les capsules transférées en phase aqueuse, les molécules de PEG diffusent du noyau et sont remplacées par des molécules d’eau. Il en résulte des microcapsules aqueuses à noyau et à enveloppe d’hydrogel.

Vous trouverez ci-dessous des instructions étape par étape sur la fabrication de dispositifs microfluidiques, la préparation des cellules et l’encapsulation des CSEh.

Protocole

1. Fabrication de l’appareil

1. Réalisez les conceptions du dispositif de microencapsulation et du dispositif de dissociation à l’aide du logiciel de CAO^10,11.
2. Spin-coat les trois couches de résine photosensible SU-8 séquentiellement sur une plaquette de silicium (Figure 2A) pour obtenir des structures avec les hauteurs souhaitées: 60, 100 et 150 μm.
   REMARQUE: Le processus pour les moules supérieur et inférieur est identique.
   1. Spin coat une plaquette de silicium propre de 10 cm avec la résine photosensible négative SU-8 2025 à 1 100 tr/min pour créer la première couche de 60 μm. Après une cuisson molle à 65 °C pendant 3 min et à 95 °C pendant 10 min sur une plaque chauffante, exposez le moule à l’aide d’un aligneur sans masque en téléchargeant le fichier de conception du motif de canal principal sur le PC μPG 101. Ensuite, procéder à la cuisson post-exposition à 65 °C pendant 3 min et à 95 °C pendant 10 min.
   2. Faites tourner la deuxième couche SU-8 2025 (40 μm) à 1 500 tr/min et exposez-la en téléchargeant le fichier CAO approprié pour le motif de canal de coque.
      REMARQUE: Les cuissons molles et post-exposition étaient similaires à l’étape précédente.
   3. Spin coat la troisième couche SU-8 2025 à 1 400 tr/min pour atteindre une hauteur de 50 μm et répéter le processus ci-dessus mais exposer les structures pour la phase huileuse.
   4. Développez le moule avec les trois couches en une seule étape par immersion dans le révélateur SU-8 jusqu’à ce que toute la résine photosensible non exposée soit retirée.
   5. Cuire le moule sur une plaque chauffante à 160 °C pendant 10 min pour améliorer l’adhérence et sceller les fissures mineures qui pourraient apparaître après le développement.
   6. Exposez le moule au chlorotriméthylsilane pour éviter la liaison élastomère à l’étape suivante et placez-le dans des boîtes de Petri de 15 cm jusqu’à utilisation.
3. Préparez le moule du dispositif de dissociation de la même manière, comme décrit dans les figures 1D et 2B. Spin coat une couche de résine photosensible SU-8 sur une plaquette de silicium, comme décrit précédemment à l’étape 1.2.3, pour obtenir des structures avec la hauteur souhaitée: 50 μm. Effectuez la cuisson molle et post-exposition, le développement et la cuisson dure de la même manière que l’étape précédente.
   REMARQUE: Un ensemble de poteaux de forme triangulaire couvrait toute la chambre, l’espacement entre les poteaux diminuant à mesure que la largeur de la chambre diminuait vers la sortie. Les poteaux triangulaires étaient de 200 μm par côté avec un pas allant de 400 μm (à l’entrée) à 30 μm (à la sortie).
4. Préparer les moules par lithographie douce à l’aide de polydiméthylsiloxane (PDMS).
   1. Mélanger la base d’élastomère PDMS et l’agent de durcissement de l’élastomère dans un rapport de 10:1 p / w dans une centrifugeuse planétaire. Versez le mélange sur les moules maîtres de microencapsulation et les moules maîtres de dissociation pour créer une couche de 3 à 4 mm.
      REMARQUE: Un mélange de 50 g de base d’élastomère avec 5 g d’agent de durcissement est suffisant pour couvrir un moule maître de 3 mm d’épaisseur.
   2. Placez les boîtes de Petri contenant les moules dans un dessiccateur sous vide pendant 15 minutes pour désamorcer le PDMS non durci.
   3. Déplacer les boîtes de Petri au four et cuire au four à 80 °C pendant au moins 60 min.
   4. Retirez les moules principaux du four et laissez-les refroidir. À l’aide d’un couteau de précision, coupez soigneusement le PDMS en suivant la forme de la plaquette et décollez les pièces PDMS du moule maître.
   5. Découpez les dalles PDMS en coupant les bords de chaque appareil avec un scalpel, puis perforez les orifices fluidiques d’entrée / sortie dans le dispositif de dissociation et uniquement dans le dispositif microfluidique supérieur à l’aide d’aiguilles en acier inoxydable. Couvrez les appareils avec du ruban magique pour éviter toute contamination.
      REMARQUE: La jauge de l’aiguille est de 14 G et 15 G pour les ports d’entrée et de sortie, respectivement.
   6. Pour le collage, traiter les côtés à motifs des pièces PDMS supérieure et inférieure avec du plasma O₂ sur un graveur de plasma pendant 2 min.
   7. Alignez les deux pièces PDMS sous un stéréoscope après avoir ajouté une fine couche de séparation d’eau distillée directement dans les microcanaux (2 μL).
   8. Placez le dispositif PDMS aligné dans le four à 80 °C pendant la nuit pour terminer le collage et restaurer le PDMS à son état hydrophobe d’origine. Conservez les appareils jusqu’à ce qu’ils soient utilisés ultérieurement.
      REMARQUE: Il en résulte un dispositif coaxial de focalisation du flux avec trois hauteurs différentes de 120 μm pour le noyau, 200 μm pour la coque et 300 μm pour les canaux d’huile.
   9. Afin d’utiliser l’appareil juste après le collage plasma, injecter soigneusement mais fermement 30 μL de solution de revêtement hydrophobe dans les canaux fluidiques pour obtenir un revêtement hydrophobe. Ensuite, purgez immédiatement l’air dans les canaux jusqu’à ce qu’aucun résidu de la solution de revêtement hydrophobe ne soit observé dans l’appareil.
   10. Liez le dispositif de dissociation en traitant d’abord le côté à motifs de l’appareil et un verre coulissant nettoyé avec du plasma_O2 pendant 2 minutes, puis assemblez-les pour un durcissement ultérieur dans le four à 80 ° C pendant la nuit.
       REMARQUE: Les appareils peuvent être stockés jusqu’à une utilisation ultérieure.

2. Préparation des solutions

1. Solutions de stock. Tout d’abord, préparez des solutions mères (solutions concentrées) qui seront diluées à des concentrations plus faibles pour une utilisation réelle.
   REMARQUE: Les solutions de stock sont utilisées pour économiser du temps de préparation, conserver les matériaux, réduire l’espace de stockage et améliorer la précision lors de la préparation d’une solution de travail à des concentrations plus faibles.
   1. Préparer 30 mL de solution à 2x noyau (16 % de PEG et 34 % de milieux de gradient de densité) : mélanger 4,8 g de PEG de 35 kDa, 10,2 mL de milieux de gradient de densité et 19,8 mL de milieux DMEM/F12. Filtrer cette solution centrale à l’aide d’un filtre à seringue de 0,22 μm.
   2. Préparer 50 mL d’huile minérale avec 3 % de tensioactif : mélanger 48,5 mL d’huile minérale et 1,5 mL de tensioactif. Conserver dans un état stérile après filtration à travers un filtre à seringue de 0,22 μm.
   3. Préparer 50 mL d’huile minérale avec 0,5 % de tensioactif : mélanger 49,75 mL d’huile minérale et 0,25 mL de tensioactif. Conserver dans un état stérile.
   4. Préparer 1 M de dithiotheritol (DTT) : dissoudre 1,5425 g de DTT dans 10 mL d’eau distillée. Conserver dans un état stérile.
   5. Préparer 1 M de triéthanolamine (TEA) : ajouter 66,4 μL de TEA dans 433,6 μL d’eau distillée. Conserver dans un état stérile.
   6. Préparer 1% de Pluronic F127 (PF127) : dissoudre 100 mg de PF127 dans 10 mL d’eau distillée. Conserver dans un état stérile.
2. Solutions de travail
   1. Préparer une émulsion réticulante en mélangeant 4,5 mL d’huile minérale avec 3 % de tensioactif et 300 μL de 1 M TNT (rapport 1:15). Vortex la solution pendant 2 min et sonicate pendant 45-60 min dans un bain à ultrasons à 20 °C. Chargez cette solution dans une seringue de 5 mL avec une aiguille de 27 G.
      REMARQUE: L’émulsion est générée par un mélange d’huile / eau sonique.
   2. Préparer une solution d’huile de protection en chargeant l’huile minérale avec un tensioactif à 0,5% dans une seringue de 5 mL avec une aiguille de 27 G.
   3. Préparer la solution de coquille (8 % p/v de PEG-4-Mal et 15 mM de TEA) en ajoutant 32 mg de PEG-4-Mal dans 400 μL de 1x DPBS pour former une solution à 8 % p/v, et faire tourbillonner la solution pendant 2 min. Ensuite, ajouter 6 μL de 1 M TEA (concentration finale 15 mM TEA). Enfin, centrifugez à 13 000 x g pendant 5 min à travers un filtre à rotation et maintenez-le dans l’obscurité sur la bascule pendant 30 min. Ensuite, chargez cette solution dans une seringue de 1 mL avec une aiguille de 27 G.
      REMARQUE: Laissez le récipient PEG-4-Mal reposer à température ambiante pendant 10 minutes avant d’ouvrir le couvercle et soufflez le gaz N₂ pour remplacer le O_{2 par} N₂ avant de fermer le couvercle. Vortex TEA avant d’ajouter à la solution.
3. Préparer la suspension cellulaire en solution centrale
   1. Traiter les cSEh avec de la trypsine pendant 5 à 10 min à 37 °C. Ensuite, récupérez-les dans des assiettes. Trempez la trypsine avec le milieu après le détachement cellulaire, puis transférez les cellules dans un tube conique de 15 mL.
   2. Centrifuger la suspension de cellule en vrac (400 x g, 5 min). Aspirer soigneusement le surnageant, puis remettre en suspension la pastille cellulaire en utilisant un volume minimal de milieu de croissance. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé.
      REMARQUE: Les aliquotes cellulaires typiques contiennent 12-20 x 10⁶ cellules et sont suffisantes pour faire 400 μL de la solution de base.
   3. Prélever 12-20 x 10⁶ cellules de la suspension de cellules en vrac et centrifuger la suspension de cellules/milieux (400 x g, 5 min).
   4. Aspirer soigneusement les milieux de la pastille cellulaire. Ensuite, ajouter 200 μL de milieu et 200 μL de solution de PEG 2x (concentration finale 30-50 x 10⁶ cellules/mL) et mélanger doucement.
      REMARQUE: De faibles concentrations cellulaires (moins de 20 x 10⁶ cellules / mL) ont entraîné de nombreuses capsules vides.
   5. Ajouter 30 μL de 1% de PF127 à la solution.
   6. Insérez une barre de micro-agitateur (2 mm x 7 mm) dans une seringue de 1 mL, puis chargez la solution de noyau contenant la cellule dans la seringue avec une aiguille de 27 G. Gardez la solution froide avec de la glace pendant tout le processus d’encapsulation.

3. Configuration expérimentale

1. Placer le dispositif de gouttelettes PDMS collé, quatre pièces de 20 cm de long et une pièce de microtubes d’entrée de 5 cm de long (0,38 mm D.I. x 1,1 mm O.D.), une pièce de tube de sortie de 10 cm (0,5 mm I.D. x 1,5 mm O.D.), et six pièces de tubes de raccord de 0,5 cm (1 mm I.D. x 1,8 mm O.D.) sous une source de lumière germicide (généralement intégrée dans les armoires de sécurité biologique) et stériliser pendant 30 Min.
2. Utilisez des pinces pour insérer le tube dans les orifices d’entrée fluidiques et les orifices de dissociation.
3. Utilisez les trois morceaux de microtubes d’entrée de 20 cm de long pour la coque, l’huile, les entrées d’émulsion de réticulation et une pièce pour l’entrée du dispositif de dissociation. Ensuite, insérez l’extrémité opposée des tubes à l’aiguille de la seringue avec la solution correspondante. Pendant ce temps, connectez l’entrée centrale du dispositif microfluidique et la sortie du dispositif de dissociation avec un microtube de 5 cm (Figure 1C).
   REMARQUE: Les microtubes d’entrée doivent être étroitement fixés dans les tubes de raccord, qui ont été insérés à la dernière étape.
4. Insérez un tube de sortie dans l’orifice de sortie fluidique et placez l’extrémité opposée dans un réservoir de collecte.
5. Placez l’appareil sur une scène de microscope et fixez le tube pour éviter de bouger. Alignez et concentrez le microscope sur la buse de l’appareil pour l’inspection du débit.
6. Placez chaque seringue sur différentes pompes à seringues et fixez-la correctement (Figure 1B). Programmez chaque pompe selon les protocoles du fabricant aux débits suivants : noyau (3-5 μL/min), coque (3-5 μL/min), huile de blindage (20-80 μL/min) et huile de réticulation (40-60 μL/min). Démarrez le débit dans toutes les pompes.
7. Attendez que chaque fluide pénètre dans l’appareil et remplissez les canaux tout en poussant l’air restant.
   REMARQUE: S’il y a une grande quantité d’air dans le tuyau d’entrée, augmentez temporairement chaque débit jusqu’à ce que l’air soit complètement éliminé. Gardez à l’esprit qu’un débit excessif pourrait entraîner une défaillance de la liaison PDMS-PDMS.
8. Lorsque la formation de la capsule est stabilisée (Figure 3), placer l’extrémité opposée du tube de collecte sur un nouveau tube conique avec 5 mL de milieu mTeSR.
   REMARQUE: Le milieu contient 10 μM d’inhibiteur de ROCK, 100 U / mL de pénicilline et 100 μg / mL de streptomycine.
9. Après avoir recueilli un nombre suffisant de capsules, incuber à 37 °C avec 5% de CO₂ pendant 10 min. Les capsules résidant en phase huileuse seront en haut du tube (voir Figure 4A). En tapotant doucement sur le tube, les capsules se sédimentent au fond. Après cela, la plupart de l’huile et des médias peuvent être aspirés.
10. Recueillez les capsules au fond du tube conique, placez-les sur une passoire cellulaire (taille des pores de 100 μm) et lavez-les avec de grandes quantités de milieu. Ensuite, collectez les microcapsules à l’aide d’un milieu de 2 mL dans une plaque de culture de 6 puits en faisant passer le média à travers le filtre lorsqu’il est inversé sur la plaque du puits (voir la figure 4A).

4. Culture et analyse de cSEh dans des microcapsules

1. Culture de base
   1. Incuber les capsules de cellules souches dans une boîte de culture à 6 puits à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   2. Changez le média tous les deux jours en collectant les capsules sur un filtre à tamis cellulaire, en les lavant avec un excès de média et en les resusmettant dans un nouveau puits dans des plaques de 6 puits avec un média de 2 mL comme cela a été fait à l’étape 3.10.
   3. Cultivez les capsules pendant au moins 10 jours.
2. Effectuer le test vivant/mort pour déterminer la viabilité des cellules souches encapsulées.
   1. Décongeler les solutions d’essai vivantes/mortes (homodimère d’éthidium-1 et calcéine AM).
   2. Ajouter 4 μL de l’homodimère d’éthidium 2 μM 1 et 1 μL des solutions AM de calcéine 4 μM à 2 mL de DPBS stérile. Vortex pour assurer un mélange complet.
   3. Recueillir environ 100 microcapsules sur une passoire cellulaire et les rincer avec du DPBS stérile pour permettre la diffusion du milieu hors des capsules.
   4. Collectez-les à nouveau sur une plaque de culture de 12 puits en utilisant 1 mL de la solution préparée à l’étape 4.2.2. Incuber à 37 °C pendant 20 min.
   5. Visualisez les cellules sous un microscope à fluorescence.
      REMARQUE: La viabilité cellulaire est quantifiée en calculant le pourcentage de cellules vivantes, qui sont visualisées en vert, parmi le nombre total de cellules.
3. Caractérisation de la taille des sphéroïdes.
   1. Si vous le souhaitez, placez la plaque de puits avec des microcapsules sous le microscope et mesurez le diamètre des sphéroïdes indiqué sur le logiciel associé avec des barres d’échelle appropriées.
   2. Mesurez et analysez la taille des sphéroïdes.

Résultats

En suivant le protocole mentionné ci-dessus, le lecteur sera en mesure de fabriquer des dispositifs microfluidiques et de produire des microcapsules porteuses de cellules. La figure 3A montre des exemples de microcapsules optimales et sous-optimales fabriquées à l’aide de la génération de gouttelettes microfluidiques. Différentes formulations de PEG-4-Mal ont donné lieu à des capsules de morphologies variables - les capsules ridées étaient associées à une mauvaise gélification...

Discussion

Le processus d’encapsulation décrit ici entraîne la formation reproductible de sphéroïdes hPSC. Le format microcapsule facilite la distribution de sphéroïdes dans les puits d’une plaque de microtitrage pour des expériences visant à améliorer / optimiser les protocoles de différenciation ou à tester des thérapies. Les sphéroïdes de cellules souches encapsulés peuvent également être utilisés dans des cultures en suspension où l’enveloppe d’hydrogel protège les cellules contre les dommages induit...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe Filters	Genesee Scientific	25-244
1 ml syringe luer-lock tip	BD	309628
1x DPBS	Corning	23220003
4-arm PEG maleimide, 10kDa	Laysan Inc.	164-68
5 ml syringe luer-lock tip	BD	309646
6-WELL NON-TREATED PLATE	USA Scientific	CC7672-7506
Aquapel Applicator Pack	Aquapel Glass Treatment	47100
CAD software	Autodesk	AutoCAD v2020
CELL STRAINER 100 µm pore size	cardinal	335583
Chlorotrimethylsilane	Aldrich	386529-100mL
Countess II FL Automated Cell Counter	Life technology	A27974
Digital hot plate	Dataplate
Digital vortex mixer	Fisher Scientific	215370
Distilled water	Gibco	15230-162
Dithiotheritol (DTT)	Sigma	D0632-10G
DMEM/F12 media	gibco	11320-033
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge	live	13-100-675
HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Inverted Fluorescence Motorized Microscope	Olympus	Olympus IX83
Laurell Spin Coaters	Laurell Technologies	WS-650MZ-23NPPB
Live/Dead mammalian staining kit	Fisher	L3224
Magic tape	Staples	483535
Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.)	Scientific Commodities, Inc	BB31695-PE/2
Micro stir bar	Daigger Scientific	EF3288E
MilliporeSigma Filter Forceps	Fisher scientific	XX6200006P
Mineral oil	Sigma	M8410-1L
mTeSR 1 Basal Medium	STEMCELL TECHNOLOGY	85850
Needles-Stainless Steel  14 Gauge	CML supply	901-14-025
Needles-Stainless Steel  15 Gauge	CML supply	901-15-050
OptiPrep	STEMCELL TECHNOLOGY	7820
Oven	Thermo Scientific	HERA THERM Oven
Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)	Gemini	400-109
Petri Dish 150X20 Sterile Vent	Sarstedt, Inc.	82.1184.500
Plasma Cleaning System	Yield Engineering System, Inc.	YES-G500
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
Poly(ethylene glycol) 35kDa	Sigma	94646-250G-F
PrecisionGlide Needle 27G	BD	305109
Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride	SELLECK CHEM	S1049-10mg
Silicon wafer 100mm	University Wafer	452
Slide glass (75mm ´ 25mm)	CardinalHealth	M6146
Span 80	Sigma	S6760-250ML
SpeedMixer	Thinky	ARE-310
Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm)	Costar	8160
SU-8 2025	Kayaku Advanced Materials	Y111069 0500L1GL
SU-8 developer	Kayaku Advanced Materials	Y020100 4000L1PE
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades	fisher scientific	22-079-684
SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	2065622
Syringe pump	New Era Pump System, Inc	NE-4000
Triethanolamine	Sigma-aldrich	T58300-25G
TrypLE Express	Gibco	12604-013
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.)	Cole-Parmer	06419-01
Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.)	Cole-Parmer	06419-04
Ultrasonic cleaner FS20D	Fisher Scientific	CPN-962-152R
Vacuum desiccator	Bel-Art	F42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x	ZEISS	435421-0000-000
μPG 101 laser writer	Heidelberg Instruments	HI 1128