Mikrofluidische Herstellung von Core-Shell-Mikrokapseln mit humanen pluripotenten Stammzellsphäroiden

Zusammenfassung

Dieser Artikel beschreibt die Verkapselung von humanen pluripotenten Stammzellen (hPSCs) mit einem koaxialen Flussfokussiergerät. Wir zeigen, dass diese mikrofluidische Verkapselungstechnologie eine effiziente Bildung von hPSC-Sphäroiden ermöglicht.

Zusammenfassung

Dreidimensionale (3D) oder sphäroide Kulturen humaner pluripotenter Stammzellen (hPS-Zellen) bieten die Vorteile verbesserter Differenzierungsergebnisse und Skalierbarkeit. In diesem Artikel beschreiben wir eine Strategie für die robuste und reproduzierbare Bildung von hPSC-Sphäroiden, bei der eine koaxiale Flussfokussierungsvorrichtung verwendet wird, um hPSCs in Kern-Shell-Mikrokapseln einzuschließen. Die Kernlösung enthielt Einzelzellsuspension von hPS-Zellen und wurde durch den Einbau von hochmolekularem Polyethylenglykol (PEG) und Dichtegradientenmedien viskos gemacht. Der Schalenstrom bestand aus PEG-4-Armmaleimid oder PEG-4-Mal und floss entlang des Kernstroms zu zwei aufeinanderfolgenden Ölverbindungen. Die Tröpfchenbildung erfolgte an der ersten Ölverbindung, wobei sich die Schalenlösung um den Kern wickelte. Die chemische Vernetzung der Schale erfolgte am zweiten Ölübergang durch Einbringen eines Dithiol-Vernetzers (1,4-Dithiothreitol oder DTT) in diese Tröpfchen. Der Vernetzer reagiert mit Malemid-funktionellen Gruppen über die Klickchemie, wodurch eine Hydrogelhülle um die Mikrokapseln gebildet wird. Unsere Verkapselungstechnologie produzierte Kapseln mit einem Durchmesser von 400 μm bei einer Rate von 10 Kapseln pro Sekunde. Die resultierenden Kapseln hatten eine Hydrogelhülle und einen wässrigen Kern, der es einzelnen Zellen ermöglichte, sich schnell zu Aggregaten zusammenzusetzen und Sphäroide zu bilden. Der Prozess der Verkapselung wirkte sich nicht negativ auf die Lebensfähigkeit von hPSCs aus, wobei 3 Tage nach der Verkapselung eine Lebensfähigkeit von >95% beobachtet wurde. Zum Vergleich: In festen Gel-Mikropartikeln (ohne wässrigen Kern) verkapselte hPS-Zellen bildeten keine Sphäroide und hatten 3 Tage nach der Verkapselung eine <50%ige Lebensfähigkeit. Die Sphäroidbildung von hPS-Zellen in Kernhüllen-Mikrokapseln erfolgte innerhalb von 48 h nach der Verkapselung, wobei der Sphäroiddurchmesser eine Funktion der Zellimpfdichte war. Insgesamt war die in diesem Protokoll beschriebene mikrofluidische Verkapselungstechnologie für die Verkapselung und Sphäroidbildung von hPSCs gut geeignet.

Einleitung

Aufgrund der verbesserten Pluripotenz und des Differenzierungspotenzials dieses Kulturformats ^1,2,3 besteht ein erhebliches Interesse an 3D-Kulturen humaner pluripotenter Stammzellen (^hPSCs). hPS-Zellen werden typischerweise mittels Bioreaktoren, Mikrotöpfen, Hydrogelen und polymeren Gerüsten zu Sphäroiden oder anderen 3D-Kulturformaten geformt ^4,5,6. Die Verkapselung bietet eine weitere Möglichkeit, einzelne hPSCs in Sphäroide zu organisieren. Einmal verkapselte hPSC-Sphäroide können mit Leichtigkeit gehandhabt und in Mikrotiterplatten zur Differenzierung, Krankheitsmodellierung oder Drogentestexperimenten übertragen werden. Die Einkapselung von hPSCs in einer Hydrogelschicht schützt die Zellen auch vor Scherschäden und ermöglicht es, Sphäroide in einem Bioreaktor mit hohen Rührraten zu kultivieren⁷.

Unsere Methodik zur Stammzellverkapselung hat sich im Laufe der Zeit weiterentwickelt. Zunächst konzentrierten wir uns auf feste Hydrogel-Mikropartikel und demonstrierten eine erfolgreiche Verkapselung und Kultivierung von embryonalen Stammzellen (mES-Zellen) der Maus)⁸. Es wurde jedoch festgestellt, dass menschliche embryonale Stammzellen (hES-Zellen) eine geringe Lebensfähigkeit aufwiesen, wenn sie in solchen Hydrogel-Mikropartikeln verkapselt wurden, vermutlich aufgrund der größeren Notwendigkeit für diese Zellen, Zell-Zell-Kontakte nach der Verkapselung wiederherzustellen. Wir argumentierten, dass heterogene Mikrokapseln, die einen wässrigen Kern besitzen, besser für die Verkapselung von Zellen geeignet sein könnten, die auf einer schnellen Wiederherstellung von Zell-Zell-Kontakten beruhen. Das Konzept der koaxialen Strömungsfokussierung mikrofluidischer Vorrichtung zur Herstellung von wässrigen Kern- / Hydrogel-Hüllen-Mikrokapseln wurde von He et ^al.9 übernommen, aber anstelle von Alginat, das im ursprünglichen Ansatz verwendet wurde, wurde ein PEG-basiertes Hydrogel in die Schale integriert. Wir zeigten zunächst eine erfolgreiche Verkapselung und Sphäroidbildung von primären Hepatozyten in Kernhüllen-Mikrokapseln¹⁰ und beschrieben zuletzt die Verkapselung von hES- und iPS-Zellen⁷. Wie in Abbildung 1A dargestellt, werden Kapseln in einer Strömungsfokussierungsvorrichtung hergestellt, bei der die Schalen- und Kernströme von Seite zu Seite in koaxiale Strömung übergehen, bevor sie in die Ölphase ausgestoßen werden. Der Kernstrom enthält Zellen und Additive, die die Viskosität der Lösung erhöhen (nicht-reaktives PEG MW 35kD und Iodixanol - Handelsname OptiPrep), während der Schalenstrom reaktive Moleküle enthält (PEG-4-Mal). Der kontinuierliche koaxiale Strömungsstrom wird in Tröpfchen diskretisiert, die die Kern-Shell-Architektur beibehalten. Die Kern-Schalen-Struktur wird durch die Exposition gegenüber Di-Thiol-Vernetzer (DTT) dauerhaft, der mit PEG-4-Mal über Klickchemie reagiert und zur Bildung einer dünnen (~ 10 μm) Hydrogelhaut oder -schale führt. Nachdem die Emulsion gebrochen und die Kapseln in eine wässrige Phase überführt wurden, diffundieren Moleküle des PEG aus dem Kern und werden durch Wassermoleküle ersetzt. Dies führt zu wässrigen Kern- und Hydrogelschalen-Mikrokapseln.

Im Folgenden finden Sie Schritt-für-Schritt-Anleitungen zur Herstellung mikrofluidischer Geräte, zur Vorbereitung von Zellen und zur Verkapselung von hPS-Systemen.

Protokoll

1. Geräteherstellung

1. Erstellen Sie die Entwürfe für die Mikroverkapselungsvorrichtung und die Dissoziationsvorrichtung mit der CAD-Software^10,11.
2. Schichten Sie die drei Schichten des SU-8-Fotolacks nacheinander auf einem Siliziumwafer (Abbildung 2A), um Strukturen mit den gewünschten Höhen zu erreichen: 60, 100 und 150 μm.
   HINWEIS: Der Prozess für die oberen und unteren Formen ist identisch.
   1. Schichten Sie einen sauberen 10-cm-Siliziumwafer mit SU-8 2025-Negativ-Fotolack bei 1.100 U / min, um die erste 60-μm-Schicht zu erzeugen. Nach einem weichen Backen bei 65 °C für 3 min und 95 °C für 10 min auf einer heißen Platte belichten Sie die Form mit einem maskenlosen Aligner, indem Sie die Designdatei des Kernkanalmusters auf den μPG 101 PC hochladen. Fahren Sie dann mit dem Nachbelichtungsbacken bei 65 ° C für 3 Minuten und bei 95 ° C für 10 Minuten fort.
   2. Schichten Sie die zweite SU-8 2025-Schicht (40 μm) mit 1.500 U / min und belichten Sie, indem Sie die entsprechende CAD-Datei für das Schalenkanalmuster hochladen.
      HINWEIS: Weiche und Nachbelichtungsbacken ähnelten dem vorherigen Schritt.
   3. Schichten Sie die dritte SU-8 2025-Schicht mit 1.400 U / min an, um eine Höhe von 50 μm zu erreichen, und wiederholen Sie den obigen Vorgang, legen Sie jedoch die Strukturen für die Ölphase frei.
   4. Entwickeln Sie die Form mit allen drei Schichten in einem einzigen Schritt durch Eintauchen in SU-8 Developer, bis der gesamte unbelichtete Fotolack entfernt ist.
   5. Backen Sie die Form auf einer heißen Platte bei 160 ° C für 10 Minuten, um die Haftung zu verbessern und kleinere Risse zu versiegeln, die nach der Entwicklung auftreten könnten.
   6. Setzen Sie die Form Chlortrimethylsilan aus, um im nächsten Schritt eine Elastomerbindung zu vermeiden, und legen Sie sie bis zur Verwendung in 15 cm große Petrischalen ein.
3. Bereiten Sie die Form der Dissoziationsvorrichtung auf die gleiche Weise vor, wie in Abbildung 1D und Abbildung 2B beschrieben. Schichten Sie eine Schicht SU-8-Fotolack auf einen Siliziumwafer, wie weiter oben in Schritt 1.2.3 beschrieben, um Strukturen mit der gewünschten Höhe zu erreichen: 50 μm. Führen Sie das weiche Backen, die Entwicklung und das harte Backen nach der Belichtung ähnlich wie im vorherigen Schritt durch.
   HINWEIS: Eine Reihe von dreieckigen Pfosten bedeckte die gesamte Kammer, wobei der Abstand zwischen den Pfosten abnahm, wenn die Kammerbreite zum Auslass hin abnahm. Die Dreieckspfosten betrugen 200 μm pro Seite mit einer Steigung von 400 μm (am Einlass) bis 30 μm (am Auslass).
4. Bereiten Sie die Formen durch Softlithographie mit Polydimethylsiloxan (PDMS) vor.
   1. Mischen Sie PDMS-Elastomerbasis und Elastomerhärter im Verhältnis 10:1 w/w in einer Planetenzentrifuge. Gießen Sie die Mischung sowohl auf Mikroverkapselungs-Master-Formen als auch auf Dissoziations-Master-Form, um eine 3-4-mm-Schicht zu erzeugen.
      HINWEIS: Eine Mischung aus 50 g Elastomerbasis mit 5 g Härter reicht aus, um eine Masterform mit 3 mm Dicke abzudecken.
   2. Legen Sie die Petrischalen mit den Formen für 15 Minuten in einen Vakuum-Exsikkator, um das nicht ausgehärtete PDMS zu entgasen.
   3. Die Petrischalen in den Ofen schieben und bei 80 °C mindestens 60 min backen.
   4. Entfernen Sie die Master-Formen aus dem Ofen und lassen Sie sie abkühlen. Schneiden Sie das PDMS vorsichtig mit einem Präzisionsmesser nach der Form des Wafers und ziehen Sie die PDMS-Stücke aus der Masterform ab.
   5. Schneiden Sie die PDMS-Platten aus, indem Sie die Kanten jedes Geräts mit einem Skalpell beschneiden, und stanzen Sie dann die Einlass-/Auslassfluidikanschlüsse in der Dissoziationsvorrichtung und nur im oberen mikrofluidischen Gerät mit Edelstahlnadeln aus. Decken Sie die Geräte mit magischem Klebeband ab, um eine Kontamination zu vermeiden.
      HINWEIS: Die Nadelanzeige beträgt 14 G bzw. 15 G für Einlass- bzw. Auslassanschlüsse.
   6. Zum Verkleben behandeln Sie die gemusterten Seiten der oberen und unteren PDMS-Stücke mit_O2-Plasma auf einem Plasma-Radierer für 2 min.
   7. Richten Sie beide PDMS-Teile unter einem Stereoskop aus, nachdem Sie eine dünne Trennschicht aus destilliertem Wasser direkt in die Mikrokanäle (2 μL) gegeben haben.
   8. Legen Sie das ausgerichtete PDMS-Gerät über Nacht bei 80 °C in den Ofen, um die Verklebung abzuschließen und das PDMS wieder in seinen ursprünglichen hydrophoben Zustand zu versetzen. Lagern Sie die Geräte bis zur weiteren Verwendung.
      HINWEIS: Dies führt zu einem koaxialen Flussfokussiergerät mit drei verschiedenen Höhen von 120 μm für den Kern, 200 μm für die Schale und 300 μm für Ölkanäle.
   9. Um das Gerät direkt nach der Plasmabindung zu verwenden, injizieren Sie vorsichtig, aber fest 30 μL hydrophobe Beschichtungslösung in die fluidischen Kanäle, um eine hydrophobe Beschichtung zu erreichen. Dann spülen Sie sofort Luft in die Kanäle, bis keine Rückstände der hydrophoben Beschichtungslösung im Gerät beobachtet werden.
   10. Verkleben Sie die Dissoziationsvorrichtung, indem Sie zuerst die gemusterte Seite des Geräts und ein gereinigtes Objektträgerglas für 2 min mit_O2-Plasma behandeln und dann über Nacht zur weiteren Aushärtung im Ofen bei 80 °C zusammenbauen.
       HINWEIS: Geräte können bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt werden.

2. Vorbereitung von Lösungen

1. Lagerlösungen. Bereiten Sie zunächst Stammlösungen (konzentrierte Lösungen) vor, die für den tatsächlichen Gebrauch auf niedrigere Konzentrationen verdünnt werden.
   HINWEIS: Lagerlösungen werden verwendet, um Vorbereitungszeit zu sparen, Materialien zu sparen, Lagerplatz zu reduzieren und die Genauigkeit bei der Herstellung einer Arbeitslösung in niedrigeren Konzentrationen zu verbessern.
   1. Bereiten Sie 30 ml 2x Kernlösung (16% PEG und 34% Dichtegradientenmedien) vor: Mischen Sie 4,8 g 35 kDa PEG, 10,2 ml Dichtegradientenmedien und 19,8 ml DMEM/F12-Medien. Filtern Sie diese Kernlösung mit einem 0,22 μm Spritzenfilter.
   2. Bereiten Sie 50 ml Mineralöl mit 3% Tensid vor: Mischen Sie 48,5 ml Mineralöl und 1,5 ml Tensid. Nach der Filtration durch einen 0,22 μm Spritzenfilter in einem sterilen Zustand halten.
   3. Bereiten Sie 50 ml Mineralöl mit 0,5% Tensid vor: Mischen Sie 49,75 ml Mineralöl und 0,25 ml Tensid. In sterilem Zustand aufbewahren.
   4. 1 M Dithiotheritol (DTT) herstellen: 1,5425 g DVB-t in 10 ml destilliertem Wasser auflösen. In sterilem Zustand aufbewahren.
   5. 1 M Triethanolamin (TEA) herstellen: 66,4 μL TEA in 433,6 μL destilliertem Wasser hinzufügen. In sterilem Zustand aufbewahren.
   6. Bereiten Sie 1% Pluronic F127 (PF127) vor: 100 mg PF127 in 10 ml destilliertem Wasser auflösen. In sterilem Zustand aufbewahren.
2. Funktionierende Lösungen
   1. Bereiten Sie eine Vernetzeremulsion vor, indem Sie 4,5 ml Mineralöl mit 3% Tensid und 300 μL 1 M DTT (Verhältnis 1:15) mischen. Wirbeln Sie die Lösung für 2 min vor und beschallen Sie für 45-60 min in einem Ultraschallbad bei 20 °C. Laden Sie diese Lösung in eine 5-ml-Spritze mit einer 27-G-Nadel.
      HINWEIS: Emulsion entsteht durch Beschallung von Öl/Wasser-Gemisch.
   2. Bereiten Sie Abschirmöllösung vor, indem Sie das Mineralöl mit 0,5% Tensid auf eine 5-ml-Spritze mit einer 27-G-Nadel laden.
   3. Bereiten Sie die Schalenlösung (8% w/v PEG-4-Mal und 15 mM TEA) vor, indem Sie 32 mg PEG-4-Mal in 400 μL 1x DPBS hinzufügen, um 8% w/v Lösung zu bilden, und wirbeln Sie die Lösung für 2 min. Fügen Sie dann 6 μL von 1 M TEA hinzu (Endkonzentration 15 mM TEA). Zum Schluss 5 min durch einen Schleuderfilter bei 13.000 x g zentrifugieren und 30 min im Dunkeln auf der Wippe halten. Dann laden Sie diese Lösung in eine 1-ml-Spritze mit einer 27-G-Nadel.
      HINWEIS: Lassen Sie den PEG-4-Mal-Behälter 10 Minuten lang bei Raumtemperatur sitzen, bevor Sie den Deckel öffnen, und blasen Sie_N2-Gas, um das O2 durch_N2 zu ersetzen, bevor Sie den Deckel schließen. Vortex TEA vor dem Hinzufügen zur Lösung.
3. Bereiten Sie die Zellsuspension in der Kernlösung vor
   1. Behandeln Sie die hPSCs mit Trypsin für 5 bis 10 min bei 37 °C. Dann sammle sie von Tellern. Löschen Sie das Trypsin nach der Zellablösung mit dem Medium und übertragen Sie die Zellen dann in eine 15 ml konische Röhre.
   2. Die Bulk-Cell-Suspension zentrifugieren (400 x g, 5 min). Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab und suspendieren Sie dann das Zellpellet mit einem minimalen Volumen an Wachstumsmedium. Zählen Sie die Zellen mithilfe eines automatisierten Zellzählers.
      HINWEIS: Typische Zellaliquoten enthalten 12-20 x 10⁶ Zellen und reichen aus, um 400 μL der Kernlösung herzustellen.
   3. Nehmen Sie 12-20 x 10⁶ Zellen aus der Bulk-Zellsuspension und zentrifugieren Sie die Zell-/Mediensuspension (400 x g, 5 min).
   4. Saugen Sie vorsichtig Medien aus dem Zellpellet ab. Dann 200 μL Medien und 200 μL 2x PEG-Lösung (Endkonzentration 30-50 x 10⁶ Zellen/ml) hinzufügen und vorsichtig mischen.
      HINWEIS: Niedrige Zellkonzentrationen (weniger als 20 x 10⁶ Zellen/ml) führten zu vielen leeren Kapseln.
   5. 30 μL 1% PF127 in die Lösung geben.
   6. Führen Sie eine Mikro-Rührstange (2 mm x 7 mm) in eine 1-ml-Spritze ein und laden Sie dann die Zelle, die die Kernlösung enthält, mit einer 27-G-Nadel auf die Spritze. Halten Sie die Lösung während des gesamten Verkapselungsprozesses mit Eis kalt.

3. Versuchsaufbau

1. Platzieren Sie geklebte PDMS-Tröpfchenvorrichtung, vier Stück 20 cm lang und ein Stück 5 cm lange Einlassmikroröhrchen (0,38 mm I.D. x 1,1 mm O.D.), ein Stück 10 cm Auslassrohr (0,5 mm I.D. x 1,5 mm O.D.) und sechs Stück 0,5 cm passende Rohre (1 mm I.D. x 1,8 mm O.D.) unter einer keimtötenden Lichtquelle (typischerweise in biologische Sicherheitswerkbänke eingebaut) und sterilisieren Sie für 30 Min.
2. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Schlauch in die fluidischen Einlassanschlüsse und die Dissoziationsöffnungen einzupassen.
3. Verwenden Sie die drei Stücke von 20 cm langen Einlassmikroröhrchen für die Schale, Öl, Vernetzer-Emulsionseinlässe und ein Stück für den Einlass der Dissoziationsvorrichtung. Führen Sie dann das gegenüberliegende Ende der Röhrchen mit der entsprechenden Lösung in die Nadel der Spritze ein. Verbinden Sie in der Zwischenzeit den Kerneinlass der mikrofluidischen Vorrichtung und den Auslass der Dissoziationsvorrichtung mit einem 5 cm großen Mikroröhrchen (Abbildung 1C).
   HINWEIS: Die Einlassmikroröhrchen sollten fest in den Armaturenrohren befestigt werden, die im letzten Schritt eingeführt wurden.
4. Stecken Sie ein Auslassrohr in den Fluidic-Auslassanschluss und legen Sie das gegenüberliegende Ende in ein Auffangbecken.
5. Stellen Sie das Gerät auf einen Mikroskoptisch und befestigen Sie den Schlauch, um ein Bewegen zu vermeiden. Richten und fokussieren Sie das Mikroskop zur Durchflusskontrolle auf die Gerätedüse.
6. Legen Sie jede Spritze auf verschiedene Spritzenpumpen und befestigen Sie sie ordnungsgemäß (Abbildung 1B). Programmieren Sie jede Pumpe gemäß den Protokollen des Herstellers auf die folgenden Durchflussraten: Kern (3-5 μL/min), Schale (3-5 μL/min), Abschirmöl (20-80 μL/min) und Vernetzungsöl (40-60 μL/min). Starten Sie den Durchfluss in allen Pumpen.
7. Warten Sie, bis jede Flüssigkeit in das Gerät gelangt ist, und füllen Sie die Kanäle auf, während Sie die verbleibende Luft herausdrücken.
   HINWEIS: Wenn sich eine große Menge Luft im Einlassschlauch befindet, erhöhen Sie vorübergehend jede Durchflussrate, bis die Luft vollständig entfernt ist. Beachten Sie, dass eine übermäßige Durchflussrate zu einem Ausfall der PDMS-zu-PDMS-Bindung führen kann.
8. Wenn die Kapselbildung stabilisiert ist (Abbildung 3), platzieren Sie das gegenüberliegende Ende des Auffangrohrs in einem neuen konischen Röhrchen mit 5 ml mTeSR-Medien.
   HINWEIS: Das Medium enthält 10 μM ROCK-Inhibitor, 100 U / ml Penicillin und 100 μg / ml Streptomycin.
9. Nachdem eine ausreichende Anzahl von Kapseln gesammelt wurde, bei 37 °C mit 5% CO₂ für 10 min inkubieren. Kapseln, die sich in der Ölphase befinden, befinden sich oben auf dem Röhrchen (siehe Abbildung 4A). Durch sanftes Klopfen auf die Röhre gelangen Kapseln zu Bodensedimenten. Danach kann der größte Teil des Öls und der Medien angesaugt werden.
10. Sammeln Sie die Kapseln vom Boden des konischen Röhrchens, legen Sie sie auf ein Zellsieb (100 μm Porengröße) und waschen Sie sie mit reichlich Medien. Sammeln Sie dann Mikrokapseln mit 2 ml Medien in einer 6-Well-Kulturplatte, indem Sie das Medium durch den Filter laufen lassen, während es auf der Oberseite der Well-Platte invertiert wird (siehe Abbildung 4A).

4. hPSC-Kultur und -Analyse in Mikrokapseln

1. Grundkultur
   1. Die Stammzellkapseln in einer 6-Well-Plattenkulturschale bei 37 °C mit 5% CO₂ inkubieren.
   2. Wechseln Sie die Medien jeden zweiten Tag, indem Sie die Kapseln auf einem Zellsiebfilter sammeln, sie mit überschüssigen Medien waschen und sie in einem neuen Vertiefungsbereich in 6-Well-Platten mit 2-ml-Medien aufhängen, wie in Schritt 3.10 durchgeführt.
   3. Gießen Sie die Kapseln für mindestens 10 Tage.
2. Führen Sie den Lebend-/Totentest durch, um die Lebensfähigkeit verkapselter Stammzellen zu bestimmen.
   1. Tauen Sie lebende/tote Assay-Lösungen auf (Ethidium homodimer-1 und Calcein AM).
   2. 4 μL der 2 μM Ethidium Homodimer-1 und 1 μL der 4 μM Calcein AM Lösungen zu 2 mL sterilem DPBS geben. Vortex, um eine vollständige Mischung zu gewährleisten.
   3. Sammeln Sie ungefähr 100 Mikrokapseln auf einem Zellsieb und spülen Sie sie mit sterilem DPBS ab, um die Diffusion von Medium aus den Kapseln zu ermöglichen.
   4. Sie werden erneut zu einer Kulturplatte mit 12 Vertiefungen gesammelt, indem Sie 1 ml der in Schritt 4.2.2 hergestellten Lösung verwenden. 20 min bei 37 °C inkubieren.
   5. Visualisieren Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop.
      HINWEIS: Die Zelllebensfähigkeit wird quantifiziert, indem der Prozentsatz der lebenden Zellen, die als grün visualisiert werden, an der Gesamtzahl der Zellen berechnet wird.
3. Charakterisierung der Sphäroidgröße.
   1. Legen Sie bei Bedarf die Vertiefungsplatte mit Mikrokapseln unter das Mikroskop und messen Sie den Durchmesser der in der zugehörigen Software gezeigten Sphäroide mit geeigneten Maßstabsstäben.
   2. Messen und analysieren Sie die Sphäroidgröße.

Ergebnisse

Durch die Befolgung des oben genannten Protokolls wird der Leser in der Lage sein, mikrofluidische Geräte herzustellen und zelltragende Mikrokapseln herzustellen. Abbildung 3A zeigt Beispiele für optimale und suboptimale Mikrokapseln, die mittels mikrofluidischer Tröpfchenerzeugung hergestellt werden. Verschiedene Formulierungen von PEG-4-Mal führten zu Kapseln unterschiedlicher Morphologien - faltige Kapseln waren mit schlechter Gelierung, geringer mechanischer Integrität verbunden und...

Diskussion

Der hier beschriebene Verkapselungsprozess führt zu einer reproduzierbaren Bildung von hPSC-Sphäroiden. Das Mikrokapselformat erleichtert die Abgabe von Sphäroiden in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte für Experimente zur Verbesserung / Optimierung von Differenzierungsprotokollen oder zum Testen von Therapien. Verkapselte Stammzellsphäroide können auch in Suspensionskulturen verwendet werden, in denen die Hydrogelhülle die Zellen vor scherinduzierten Schäden schützt⁷.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe Filters	Genesee Scientific	25-244
1 ml syringe luer-lock tip	BD	309628
1x DPBS	Corning	23220003
4-arm PEG maleimide, 10kDa	Laysan Inc.	164-68
5 ml syringe luer-lock tip	BD	309646
6-WELL NON-TREATED PLATE	USA Scientific	CC7672-7506
Aquapel Applicator Pack	Aquapel Glass Treatment	47100
CAD software	Autodesk	AutoCAD v2020
CELL STRAINER 100 µm pore size	cardinal	335583
Chlorotrimethylsilane	Aldrich	386529-100mL
Countess II FL Automated Cell Counter	Life technology	A27974
Digital hot plate	Dataplate
Digital vortex mixer	Fisher Scientific	215370
Distilled water	Gibco	15230-162
Dithiotheritol (DTT)	Sigma	D0632-10G
DMEM/F12 media	gibco	11320-033
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge	live	13-100-675
HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Inverted Fluorescence Motorized Microscope	Olympus	Olympus IX83
Laurell Spin Coaters	Laurell Technologies	WS-650MZ-23NPPB
Live/Dead mammalian staining kit	Fisher	L3224
Magic tape	Staples	483535
Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.)	Scientific Commodities, Inc	BB31695-PE/2
Micro stir bar	Daigger Scientific	EF3288E
MilliporeSigma Filter Forceps	Fisher scientific	XX6200006P
Mineral oil	Sigma	M8410-1L
mTeSR 1 Basal Medium	STEMCELL TECHNOLOGY	85850
Needles-Stainless Steel  14 Gauge	CML supply	901-14-025
Needles-Stainless Steel  15 Gauge	CML supply	901-15-050
OptiPrep	STEMCELL TECHNOLOGY	7820
Oven	Thermo Scientific	HERA THERM Oven
Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)	Gemini	400-109
Petri Dish 150X20 Sterile Vent	Sarstedt, Inc.	82.1184.500
Plasma Cleaning System	Yield Engineering System, Inc.	YES-G500
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
Poly(ethylene glycol) 35kDa	Sigma	94646-250G-F
PrecisionGlide Needle 27G	BD	305109
Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride	SELLECK CHEM	S1049-10mg
Silicon wafer 100mm	University Wafer	452
Slide glass (75mm ´ 25mm)	CardinalHealth	M6146
Span 80	Sigma	S6760-250ML
SpeedMixer	Thinky	ARE-310
Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm)	Costar	8160
SU-8 2025	Kayaku Advanced Materials	Y111069 0500L1GL
SU-8 developer	Kayaku Advanced Materials	Y020100 4000L1PE
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades	fisher scientific	22-079-684
SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	2065622
Syringe pump	New Era Pump System, Inc	NE-4000
Triethanolamine	Sigma-aldrich	T58300-25G
TrypLE Express	Gibco	12604-013
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.)	Cole-Parmer	06419-01
Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.)	Cole-Parmer	06419-04
Ultrasonic cleaner FS20D	Fisher Scientific	CPN-962-152R
Vacuum desiccator	Bel-Art	F42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x	ZEISS	435421-0000-000
μPG 101 laser writer	Heidelberg Instruments	HI 1128