АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой статье описывается инкапсуляция плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) с использованием коаксиального устройства фокусировки потока. Мы демонстрируем, что эта технология микрофлюидной инкапсуляции позволяет эффективно формировать сфероиды hPSC.

Аннотация

Трехмерные (3D) или сфероидные культуры плюрипотентных стволовых клеток человека (hPSCs) предлагают преимущества улучшения результатов дифференцировки и масштабируемости. В этой статье мы описываем стратегию надежного и воспроизводимого образования сфероидов hPSC, где коаксиальное устройство фокусировки потока используется для захвата hPSC внутри микрокапсул ядра-оболочки. Основной раствор содержал одноклеточную суспензию гПСК и становился вязким путем включения высокомолекулярного поли(этиленгликоля) (ПЭГ) и среды градиента плотности. Поток оболочки состоял из ПЭГ-4 арм-малеимида или ПЭГ-4-Мал и протекал вдоль основного потока к двум последовательным нефтяным соединениям. Образование капель происходило при первом масляном соединении с раствором оболочки, обернутым вокруг ядра. Химическое сшивание оболочки происходило на втором масляном переходе путем введения в эти капли ди-тиолового сшивки (1,4-дитиотрейтола или ДТТ). Сшиватель реагирует с функциональными группами малеймидов посредством щелковой химии, в результате чего вокруг микрокапсул образуется гидрогелевая оболочка. Наша технология инкапсуляции производила капсулы диаметром 400 мкм со скоростью 10 капсул в секунду. Полученные капсулы имели гидрогелевую оболочку и водное ядро, которое позволяло отдельным клеткам быстро собираться в агрегаты и образовывать сфероиды. Процесс инкапсуляции не оказывал негативного влияния на жизнеспособность гПСК, при этом >95% жизнеспособность наблюдалась через 3 дня после инкапсуляции. Для сравнения, hPSCs, инкапсулированные в твердые гелевые микрочастицы (без водного ядра), не образовывали сфероидов и имели <50% жизнеспособность через 3 дня после инкапсуляции. Сфероидное образование hPSCs внутри микрокапсул ядра-оболочки происходило в течение 48 ч после инкапсуляции, причем диаметр сфероида был функцией плотности прививки клеток. В целом, технология микрофлюидной инкапсуляции, описанная в этом протоколе, хорошо подходила для инкапсуляции hPSCs и формирования сфероидов.

Введение

Существует значительный интерес к 3D-культурам человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) из-за улучшенной плюрипотентности и дифференцировочного потенциала, обеспечиваемого этим форматом культуры 1,2,3. hPSCs обычно формируются в сфероиды или другие форматы 3D-культур с помощью биореакторов, микроэлементов, гидрогелей и полимерных каркасов 4,5,6. Инкапсуляция предлагает еще одно средство для организации отдельных HPSC в сфероиды. После инкапсулирования сфероиды hPSC могут быть легко обработаны и перенесены в микротитрные пластины для дифференцировки, моделирования заболеваний или экспериментов по тестированию лекарств. Пленение гПСК в гидрогелевом слое также защищает клетки от повреждения сдвигом и позволяет культивировать сфероиды в биореакторе при высоких скоростях перемешивания7.

Наша методология инкапсуляции стволовых клеток развивалась с течением времени. Во-первых, мы сосредоточились на твердых микрочастицах гидрогеля и продемонстрировали успешную инкапсуляцию и культивирование эмбриональных стволовых клеток мышей (mESCs)8. Однако было отмечено, что эмбриональные стволовые клетки человека (hESCs) имеют низкую жизнеспособность при инкапсуляции в таких микрочастицах гидрогеля, по-видимому, из-за большей необходимости для этих клеток восстанавливать контакты между клетками после инкапсуляции. Мы рассуждали, что гетерогенная микрокапсула, обладающая водным ядром, может лучше подходить для инкапсуляции клеток, которые полагаются на быстрое восстановление клеточных контактов. Концепция коаксиального потока, фокусирующего микрофлюидное устройство для получения микрокапсул водного ядра / гидрогелевой оболочки, была адаптирована из He et al.9, но вместо альгината, используемого в первоначальном подходе, в оболочку был включен гидрогель на основе ПЭГ. Впервые мы продемонстрировали успешную инкапсуляцию и сфероидное образование первичного гепатоцита в микрокапсулахядра-оболочки 10 и совсем недавно описали инкапсуляцию hES и iPS-клеток7. Как показано на фиг.1А, капсулы изготавливаются в устройстве фокусировки потока, где потоки потока оболочки и ядра переходят из стороны в сторону в коаксиальный поток перед выбросом в масляную фазу. Основной поток содержит клетки и добавки, которые увеличивают вязкость раствора (нереакционноспособный ПЭГ MW 35кД и йодиксанол - коммерческое название OptiPrep), в то время как оболочка потока содержит реакционноспособные молекулы (ПЭГ-4-Мал). Непрерывный поток коаксиального потока дискретизируется на капли, которые сохраняют архитектуру ядра-оболочки. Структура ядра-оболочки становится постоянной путем воздействия ди-тиолового сшивателя (DTT), который реагирует с PEG-4-Mal через химию щелчка и приводит к образованию тонкой (~ 10 мкм) гидрогелевой кожи или оболочки. После того, как эмульсия нарушается и капсулы переводятся в водную фазу, молекулы ПЭГ диффундируют из ядра и заменяются молекулами воды. Это приводит к образованию микрокапсул водного ядра и гидрогелевой оболочки.

Ниже приведены пошаговые инструкции о том, как создавать микрофлюидные устройства, как подготовить клетки и как проводить инкапсуляцию гПСК.

протокол

1. Изготовление устройств

  1. Составьте конструкции устройства микроинкапсулирования и устройства диссоциации с помощью программного обеспечения CAD10,11.
  2. Раскрутите три слоя фоторезиста СУ-8 последовательно на кремниевой пластине (рисунок 2А) для достижения структур с желаемой высотой: 60, 100 и 150 мкм.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс для верхней и нижней форм идентичен.
    1. Отжимное покрытие чистой кремниевой пластиной 10 см с отрицательным фоторезистом SU-8 2025 со скоростью вращения 1 100 об/мин для создания первого слоя 60 мкм. После мягкой выпечки при 65 °C в течение 3 мин и 95 °C в течение 10 мин на конфорке подвергайте форму с помощью безмаскочного элайнера, загрузив файл конструкции шаблона основного канала на ПК μPG 101. Затем продолжайте выпекать после воздействия при 65 °C в течение 3 мин и при 95 °C в течение 10 мин.
    2. Спиновое покрытие второго слоя SU-8 2025 (40 мкм) при 1 500 об/мин и экспонирование путем загрузки соответствующего файла CAD для шаблона канала оболочки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мягкая и постэкспозиционная выпечка были аналогичны предыдущему шагу.
    3. Спиновое покрытие третьего слоя СУ-8 2025 при 1 400 об/мин для достижения высоты 50 мкм и повторения вышеуказанного процесса, но обнажения структур для масляной фазы.
    4. Разработайте форму со всеми тремя слоями за один шаг путем погружения в СУ-8 разработчика до тех пор, пока не будет удален весь неэкспонированный фоторезист.
    5. Жестко запекайте форму на конфорке при 160 °C в течение 10 мин, чтобы улучшить адгезию и заделать незначительные трещины, которые могут появиться после разработки.
    6. Подвергайте форму воздействию хлортриметилсилана, чтобы избежать склеивания эластомеров на следующем этапе, и поместите его в чашку Петри по 15 см до использования.
  3. Подготовьте форму устройства диссоциации таким же образом, как описано на рисунках 1D и 2B. Спиновое покрытие одним слоем фоторезиста СУ-8 на кремниевой пластине, как описано ранее на этапе 1.2.3, для достижения структур с желаемой высотой: 50 мкм. Проводите мягкую и постэкспозиционную выпечку, развитие и твердую выпечку аналогично предыдущему этапу.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Массив столбов треугольной формы покрывал всю камеру, причем расстояние между стойками уменьшалось по мере уменьшения ширины камеры к выходу. Треугольные стойки были по 200 мкм на сторону с шагом от 400 мкм (на входе) до 30 мкм (на выходе).
  4. Подготовьте формы методом мягкой литографии с использованием полидиметилсилоксана (PDMS).
    1. Смешайте основание эластомера PDMS и эластомерный отверждающий агент в соотношении 10:1 w/w в планетарной центрифуге. Вылейте смесь как на мастер-формы микрокапсулирования, так и на форму диссоциации, чтобы создать слой 3-4 мм.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смеси 50 г эластомерной основы с 5 г отверждающего агента достаточно для покрытия основной формы толщиной 3 мм.
    2. Поместите чашки Петри, содержащие формы, в вакуумный осушитель на 15 минут, чтобы дегазировать неотвержденную PDMS.
    3. Переместите чашку Петри в духовку и выпекайте при 80 °C в течение минимум 60 минут.
    4. Снимите мастер-формы из духовки и дайте им остыть. С помощью прецизионного ножа аккуратно вырежьте PDMS по форме пластины и вырежьте кусочки PDMS из основной формы.
    5. Вырежьте плиты PDMS, обрезав края каждого устройства скальпелем, затем выбивайте впускные/выпускные жидкостные порты в диссоциационном устройстве и только в верхнем микрофлюидном устройстве с помощью игл из нержавеющей стали. Накройте устройства волшебной лентой, чтобы избежать загрязнения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Игольчатый калибр составляет 14 G и 15 G для входных и выходных отверстий соответственно.
    6. Для склеивания обрабатывают узорчатые стороны верхней и нижней частей PDMS плазмой O2 на плазменном травиле в течение 2 мин.
    7. Выровняйте обе части PDMS под стереоскопом после добавления тонкого разделительного слоя дистиллированной воды непосредственно в микроканалы (2 мкл).
    8. Поместите выровненное устройство PDMS в печь при температуре 80 °C на ночь, чтобы завершить склеивание и восстановить PDMS до исходного гидрофобного состояния. Храните устройства до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В результате получается коаксиальное устройство фокусировки потока с тремя различными высотами 120 мкм для сердечника, 200 мкм для оболочки и 300 мкм для масляных каналов.
    9. Чтобы использовать устройство сразу после плазменного склеивания, осторожно, но твердо вводят 30 мкл раствора гидрофобного покрытия в псевдоожиженные каналы для достижения гидрофобного покрытия. Затем немедленно продуть воздух в каналы до тех пор, пока в устройстве не будут наблюдаться остатки раствора гидрофобного покрытия.
    10. Свяжите диссоциационное устройство, сначала обработав узорчатую сторону устройства и очищенное скользящее стекло плазмой O2 в течение 2 мин, а затем соберите их для дальнейшего отверждения в печи при 80 °C в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Устройства можно хранить до дальнейшего использования.

2. Приготовление растворов

  1. Складские решения. Во-первых, готовят исходные растворы (концентрированные растворы), которые будут разбавлены до более низких концентраций для фактического использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Складские растворы используются для экономии времени приготовления, экономии материалов, уменьшения пространства для хранения и повышения точности при приготовлении рабочего раствора в более низких концентрациях.
    1. Приготовьте 30 мл 2-кратного основного раствора (16% ПЭГ и 34% среды с градиентом плотности): смешайте 4,8 г ПЭГ 35 кДа, 10,2 мл среды с градиентом плотности и 19,8 мл среды DMEM/F12. Отфильтруйте этот основной раствор с помощью шприцевого фильтра 0,22 мкм.
    2. Приготовить 50 мл минерального масла с 3% поверхностно-активным веществом: смешать 48,5 мл минерального масла и 1,5 мл поверхностно-активного вещества. Хранить в стерильном состоянии после фильтрации через шприцевой фильтр 0,22 мкм.
    3. Приготовить 50 мл минерального масла с 0,5% поверхностно-активным веществом: смешать 49,75 мл минерального масла и 0,25 мл поверхностно-активного вещества. Хранить в стерильном состоянии.
    4. Приготовить 1 М дитиотеритол (ДТТ): растворить 1,5425 г ДТТ в 10 мл дистиллированной воды. Хранить в стерильном состоянии.
    5. Приготовьте 1 М триэтаноламина (TEA): добавьте 66,4 мкл TEA в 433,6 мкл дистиллированной воды. Хранить в стерильном состоянии.
    6. Приготовьте 1% Pluronic F127 (PF127): растворите 100 мг PF127 в 10 мл дистиллированной воды. Хранить в стерильном состоянии.
  2. Рабочие решения
    1. Приготовьте сшивающую эмульсию, смешав 4,5 мл минерального масла с 3% поверхностно-активным веществом и 300 мкл 1 М DTT (соотношение 1:15). Вихрь раствора в течение 2 мин и ультразвуком в течение 45-60 мин в ультразвуковой ванне при 20 °C. Загрузите этот раствор в шприц объемом 5 мл с иглой 27 г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эмульсия образуется путем обработки ультразвуком смеси масла и воды.
    2. Приготовьте раствор защитного масла, загрузив минеральное масло 0,5% поверхностно-активным веществом в шприц объемом 5 мл с иглой 27 г.
    3. Готовят скорлупный (8% мас./об.ПЭГ-4-Маль и 15 мМ ТЭА) раствор, добавляя 32 мг ПЭГ-4-Маль в 400 мкл 1x DPBS с образованием 8% мас./об.раствора, и вихря раствор в течение 2 мин. Затем добавляют 6 мкл 1 М ЧАЙ (конечная концентрация 15 мМ ЧАЙ). Наконец, центрифугу при 13 000 х г в течение 5 мин через спин-фильтр и держите ее в темноте на коромысле в течение 30 мин. Затем загрузите этот раствор в шприц объемом 1 мл с иглой 27 г.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Оставьте контейнер PEG-4-Mal сидеть при комнатной температуре в течение 10 мин перед открытием крышки и выдуйте газN2 , чтобы заменить O2 на N2 перед закрытием крышки. Вихрь TEA перед добавлением в раствор.
  3. Приготовьте клеточную суспензию в основном растворе
    1. Обрабатывайте гПСК трипсином в течение 5-10 мин при 37 °C. Затем соберите их с тарелок. Гасить трипсин средой после отслоения клеток, а затем перенести клетки в коническую трубку объемом 15 мл.
    2. Центрифуга объемной клеточной суспензии (400 х г, 5 мин). Осторожно аспирируйте супернатант, а затем повторно суспендируйте клеточную гранулу, используя минимальный объем питательной среды. Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Типичные клеточные аликвоты содержат 12-20 х 106 клеток и достаточны для получения 400 мкл основного раствора.
    3. Взять 12-20 х 106 ячеек из суспензии объемной ячейки и центрифугировать суспензию ячейки/среды (400 х г, 5 мин).
    4. Осторожно аспирировать среду из ячейки гранулы. Затем добавляют 200 мкл среды и 200 мкл 2-кратного раствора ПЭГ (конечная концентрация 30-50 х 106 клеток/мл) и аккуратно перемешивают.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Низкие концентрации в клетках (менее 20 х 106 клеток/мл) приводили к образованию многих пустых капсул.
    5. Добавьте в раствор 30 мкл 1% PF127.
    6. Вставьте микромешалку (2 мм х 7 мм) в шприц объемом 1 мл, а затем загрузите ячейку, содержащую основной раствор, в шприц иглой 27 G. Держите раствор холодным со льдом в течение всего процесса инкапсуляции.

3. Экспериментальная установка

  1. Поместите связанное капельное устройство PDMS, четыре куска длиной 20 см и один кусок впускных микротрубок длиной 5 см (0,38 мм I.D. x 1,1 мм O.D.), один кусок выходной трубки 10 см (0,5 мм I.D. x 1,5 мм O.D.) и шесть частей 0,5 см фитинговых трубок (1 мм I.D. x 1,8 мм O.D.) под бактерицидным источником света (обычно встроенным в шкафы биологической безопасности) и стерилизуйте в течение 30 Мин.
  2. Используйте щипцы для установки трубки в жидкостные входные отверстия и диссоциационные отверстия.
  3. Используйте три куска впускных микротрубок длиной 20 см для оболочки, масла, сшивающих эмульсийных входов и один кусок для входного отверстия устройства диссоциации. Затем вставьте противоположный конец трубок к игле шприца с соответствующим раствором. Между тем, соедините входное отверстие микрофлюидного устройства и выходное отверстие устройства диссоциации с одной микропробиркой 5 см (рисунок 1C).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Входные микротрубки должны быть плотно закреплены внутри фитинговых трубок, которые были вставлены на последнем этапе.
  4. Вставьте одну выпускную трубку в выходное отверстие для жидкости и поместите противоположный конец в резервуар для сбора.
  5. Поместите устройство на ступень микроскопа и прикрепите трубку, чтобы избежать движения. Выровняйте и сфокусируйте микроскоп на сопле прибора для контроля потока.
  6. Поместите каждый шприц на разные шприцевые насосы и закрепите их должным образом (рисунок 1B). Программируйте каждый насос в соответствии с протоколами производителя на следующие скорости потока: ядро (3-5 мкл/мин), оболочка (3-5 мкл/мин), защитное масло (20-80 мкл/мин) и сшивающее масло (40-60 мкл/мин). Запустите поток во всех насосах.
  7. Подождите, пока каждая жидкость войдет в устройство, и заполните каналы, выталкивая оставшийся воздух.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если во входной трубке находится большое количество воздуха, временно увеличьте каждый расход до тех пор, пока воздух не будет полностью удален. Имейте в виду, что чрезмерный расход может привести к отказу связи PDMS-to-PDMS.
  8. Когда образование капсулы стабилизируется (рисунок 3), поместите противоположный конец коллекторной трубки в новую коническую трубку с 5 мл среды mTeSR.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среда содержит 10 мкМ ингибитора ROCK, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
  9. После сбора достаточного количества капсул инкубируют при 37 °C с 5% CO2 в течение 10 мин. Капсулы, находящиеся в масляной фазе, будут находиться в верхней части трубки (см. Рисунок 4А). Осторожно постукивание по трубке приводит к тому, что капсулы оседают на дно. После этого большая часть масла и среды может быть аспирирована.
  10. Соберите капсулы со дна конической трубки, поместите их на клеточный ситечко (размер пор 100 мкм) и промыть обильным количеством среды. Затем соберите микрокапсулы, используя среду 2 мл в 6-луночной культуральной пластине, проведя среду через фильтр, поскольку она перевернута поверх пластины скважины (см. Рисунок 4A).

4. Культура и анализ hPSC в микрокапсулах

  1. Базовая культура
    1. Инкубируйте капсулы стволовых клеток в 6-луночной чашке для культивирования при 37 °C с 5% CO2.
    2. Меняйте среду через день, собирая капсулы на фильтре клеточного сетчатого фильтра, промывая их избыточной средой и повторно помещая их в новую скважину в 6-луночных пластинах со средой 2 мл, как это было сделано на этапе 3.10.
    3. Культивируйте капсулы не менее 10 дней.
  2. Выполните анализ живых/мертвых, чтобы определить жизнеспособность инкапсулированных стволовых клеток.
    1. Разморозить живые/мертвые растворы анализа (гомодимер этидия-1 и кальцеин АМ).
    2. Добавьте 4 мкл гомодимера этидия-1 и 1 мкл 4 мкМ растворов кальциина AM к 2 мл стерильного DPBS. Вихрь для обеспечения полного перемешивания.
    3. Соберите приблизительно 100 микрокапсул на клеточном ситечке и промойте их стерильным DPBS, чтобы обеспечить диффузию среды из капсул.
    4. Снова соберите их на 12-луночную культуральную пластину, используя 1 мл раствора, приготовленного на этапе 4.2.2. Инкубировать при 37 °C в течение 20 мин.
    5. Визуализируйте клетки под флуоресцентным микроскопом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жизнеспособность клеток количественно определяется путем расчета процента живых клеток, которые визуализируются как зеленые, среди общего числа клеток.
  3. Характеристика размера сфероида.
    1. При желании поместите пластину скважины с микрокапсулами под микроскоп и измерьте диаметр сфероидов, показанный на соответствующем программном обеспечении, с соответствующими шкалами стержней.
    2. Измерьте и проанализируйте размер сфероида.

Результаты

Следуя вышеупомянутому протоколу, считыватель сможет изготавливать микрофлюидные устройства и производить микрокапсулы, несущие клетки. На рисунке 3А показаны примеры оптимальных и субоптимальных микрокапсул, изготовленных с использованием микрофлюидной генерации ...

Обсуждение

Описанный здесь процесс инкапсуляции приводит к воспроизводимому образованию сфероидов hPSC. Формат микрокапсул позволяет легко дозировать сфероиды в колодцы микротитровой пластины для экспериментов, направленных на улучшение/оптимизацию протоколов дифференциации или тестирование ...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Это исследование было частично поддержано грантами Центра регенеративной медицины клиники Майо, Фонда J. W. Kieckhefer, Фонда Аль Нахайяна, Регенеративной медицины Миннесоты (RMM 101617 TR 004) и NIH (DK107255).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 µm Syringe FiltersGenesee Scientific25-244
1 ml syringe luer-lock tipBD309628
1x DPBSCorning23220003
4-arm PEG maleimide, 10kDaLaysan Inc.164-68
5 ml syringe luer-lock tipBD309646
6-WELL NON-TREATED PLATEUSA ScientificCC7672-7506
Aquapel Applicator PackAquapel Glass Treatment47100
CAD softwareAutodeskAutoCAD v2020
CELL STRAINER 100 µm pore sizecardinal335583
ChlorotrimethylsilaneAldrich386529-100mL
Countess II FL Automated Cell CounterLife technologyA27974
Digital hot plateDataplate
Digital vortex mixerFisher Scientific215370
Distilled waterGibco15230-162
Dithiotheritol (DTT)SigmaD0632-10G
DMEM/F12 mediagibco11320-033
Falcon 15 mL Conical Centrifuge TubesFisher scientific14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifugelive13-100-675
HERACELL VIOS 160i CO2 IncubatorThermo Scientific50144906
Inverted Fluorescence Motorized MicroscopeOlympusOlympus IX83
Laurell Spin CoatersLaurell TechnologiesWS-650MZ-23NPPB
Live/Dead mammalian staining kitFisherL3224
Magic tapeStaples483535
Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.)Scientific Commodities, IncBB31695-PE/2
Micro stir barDaigger ScientificEF3288E
MilliporeSigma Filter ForcepsFisher scientificXX6200006P
Mineral oilSigmaM8410-1L
mTeSR 1 Basal MediumSTEMCELL TECHNOLOGY85850
Needles-Stainless Steel  14 GaugeCML supply901-14-025
Needles-Stainless Steel  15 GaugeCML supply901-15-050
OptiPrepSTEMCELL TECHNOLOGY7820
OvenThermo ScientificHERA THERM Oven
Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)Gemini400-109
Petri Dish 150X20 Sterile VentSarstedt, Inc.82.1184.500
Plasma Cleaning SystemYield Engineering System, Inc.YES-G500
Pluronic F-127SigmaP2443-250G
Poly(ethylene glycol) 35kDaSigma94646-250G-F
PrecisionGlide Needle 27GBD305109
Rock inhibitor Y-27632 dihydroclorideSELLECK CHEMS1049-10mg
Silicon wafer 100mmUniversity Wafer452
Slide glass (75mm ´ 25mm)CardinalHealthM6146
Span 80SigmaS6760-250ML
SpeedMixerThinkyARE-310
Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm)Costar8160
SU-8 2025Kayaku Advanced MaterialsY111069 0500L1GL
SU-8 developerKayaku Advanced MaterialsY020100 4000L1PE
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Bladesfisher scientific22-079-684
SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)Dow Corning2065622
Syringe pumpNew Era Pump System, IncNE-4000
TriethanolamineSigma-aldrichT58300-25G
TrypLE ExpressGibco12604-013
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.)Cole-Parmer06419-01
Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.)Cole-Parmer06419-04
Ultrasonic cleaner FS20DFisher ScientificCPN-962-152R
Vacuum desiccatorBel-ArtF42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32xZEISS435421-0000-000
μPG 101 laser writerHeidelberg InstrumentsHI 1128

Ссылки

  1. Zhu, Z., Huangfu, D. Human pluripotent stem cells: an emerging model in developmental biology. Development. 140 (4), 705-717 (2013).
  2. Liu, G., David, B. T., Trawczynski, M., Fessler, R. G. Advances in pluripotent stem cells: history, mechanisms, technologies, and applications. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (1), 3-32 (2020).
  3. Chan, S. W., Rizwan, M., Yim, E. K. Emerging methods for enhancing pluripotent stem cell expansion. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 70 (2020).
  4. Lei, Y., Schaffer, D. V. A fully defined and scalable 3D culture system for human pluripotent stem cell expansion and differentiation. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (52), 5039-5048 (2013).
  5. Olmer, R., et al. Suspension culture of human pluripotent stem cells in controlled, stirred bioreactors. Tissue Engineering Part C: Methods. 18 (10), 772-784 (2012).
  6. Kraehenbuehl, T. P., Langer, R., Ferreira, L. S. Three-dimensional biomaterials for the study of human pluripotent stem cells. Nature Methods. 8 (9), 731-736 (2011).
  7. Fattahi, P., et al. Core-shell hydrogel microcapsules enable formation of human pluripotent stem cell spheroids and their cultivation in a stirred bioreactor. Scientific Reports. 11 (1), 1-13 (2021).
  8. Siltanen, C., et al. Microfluidic fabrication of bioactive microgels for rapid formation and enhanced differentiation of stem cell spheroids. Acta Biomaterialia. 34, 125-132 (2016).
  9. Agarwal, P., et al. One-step microfluidic generation of pre-hatching embryo-like core-shell microcapsules for miniaturized 3D culture of pluripotent stem cells. Lab on a Chip. 13 (23), 4525-4533 (2013).
  10. Siltanen, C., et al. One step fabrication of hydrogel microcapsules with hollow core for assembly and cultivation of hepatocyte spheroids. Acta Biomaterialia. 50, 428-436 (2017).
  11. Rahimian, A., Siltanen, C., Feyzizarnagh, H., Escalante, P., Revzin, A. Microencapsulated immunoassays for detection of cytokines in human blood. ACS Sensors. 4 (3), 578-585 (2019).
  12. Kim, M., Lee, J., Jones, C. N., Revzin, A., Tae, G. Heparin-based hydrogel as a matrix for encapsulation and cultivation of primary hepatocytes. Biomaterials. 31, 3596-3603 (2010).
  13. Shin, D. S., et al. Photodegradable hydrogels for capture, detection, and release of live cells. Angewandte Chemie International Edition. , (2014).
  14. You, J., et al. Bioactive photodegradable hydrogel for cultivation and retrieval of embryonic stem cells. Advanced Functional Materials. , (2015).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

176

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены