ייצור מיקרופלואידי של מיקרו-מעטפת ליבה הנושאים כדוריות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Summary

מאמר זה מתאר אנקפסולציה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) באמצעות התקן מיקוד זרימה צירית משותפת. אנו מראים שטכנולוגיית אנקפסולציה מיקרופלואידית זו מאפשרת היווצרות יעילה של כדוריות hPSC.

Abstract

תרביות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) או ספרואידיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) מציעות את היתרונות של תוצאות דיפרנציאציה משופרות ומדרגיות. במאמר זה, אנו מתארים אסטרטגיה להיווצרות חזקה וניתנת לשחזור של כדוריות hPSC שבהן נעשה שימוש בהתקן מיקוד זרימה צירית משותפת כדי ללכוד hPSCs בתוך מיקרו-קפסולות של מעטפת ליבה. תמיסת הליבה הכילה תרחיף של תאים בודדים של hPSCs ונעשתה צמיגת על ידי שילוב של פולי(אתילן גליקול) בעל משקל מולקולרי גבוה (PEG) ומדיה הדרגתית של צפיפות. זרם הפגזים כלל PEG-4 זרוע-מלימיד או PEG-4-Mal וזרם לצד זרם הליבה לעבר שני צמתי שמן רצופים. היווצרות טיפות התרחשה בצומת השמן הראשון כאשר תמיסת המעטפת עוטפת את עצמה סביב הליבה. הצלבה כימית של הקונכייה התרחשה בצומת השמן השני על ידי החדרת צלב די-תיול (1,4-dithiothreitol או DTT) לטיפות אלה. ההצלבה מגיבה עם קבוצות פונקציונליות של מאלימיד באמצעות כימיה של קליקים, וכתוצאה מכך נוצרת מעטפת הידרוג'ל סביב המיקרו-קפסולות. טכנולוגיית האנקפסולציה שלנו ייצרה כמוסות בקוטר 400 מיקרומטר בקצב של 10 כמוסות בשנייה. הכמוסות שהתקבלו היו בעלות קליפת הידרוג'ל ולייבה מימית שאפשרה לתאים בודדים להתקבץ במהירות לאגרגטים וליצור ספרואידים. תהליך האנקפסולציה לא השפיע לרעה על הכדאיות של hPSCs, כאשר הכדאיות >95% נצפתה 3 ימים לאחר האנקפסולציה. לשם השוואה, hPSCs עטופים במיקרו-חלקיקי ג'ל מוצקים (ללא ליבה מימית) לא יצרו כדוריות והיו בעלי כדאיות <50% 3 ימים לאחר האנקפסולציה. היווצרות כדורית של hPSCs בתוך מיקרו-קפסולות של קליפת ליבה התרחשה תוך 48 שעות לאחר האנקפסולציה, כאשר קוטר הספרואידים הוא פונקציה של צפיפות חיסון התא. באופן כללי, טכנולוגיית האנקפסולציה המיקרופלואידית המתוארת בפרוטוקול זה התאימה היטב לאנקפסולציה של hPSCs ולהיווצרות ספרואידים.

Introduction

יש עניין רב בתרביות תלת-ממדיות של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) בשל הפלוריפוטנטיות המשופרת ופוטנציאל ההתמיינות שמעניקה תבנית תרבית זו ^1,2,3. hPSCs נוצרים בדרך כלל לספרואידים או לפורמטים אחרים של תרבית תלת-ממדית באמצעות ביו-ריאקטורים, מיקרו-וולים, הידרוג'לים ופיגומים פולימריים ^4,5,6. אנקפסולציה מציעה אמצעי נוסף לארגון hPSCs בודדים לספרואידים. לאחר עטיפת כדורי hPSC ניתן לטפל בקלות ולהעבירם ללוחות מיקרוטיטר לצורך התמיינות, מידול מחלות או ניסויים בבדיקת תרופות. עטיפת hPSCs בשכבת הידרוג'ל גם מגנה על התאים מפני נזקי גזירה ומאפשרת תרבית ספרואידים בביוריאקטור בקצבים גבוהים של ערבוב⁷.

המתודולוגיה שלנו לאנקפסולציה של תאי גזע התפתחה עם הזמן. ראשית, התמקדנו במיקרו-חלקיקי הידרוג'ל מוצקים והדגמנו אנקפסולציה וטיפוח מוצלחים של תאי גזע עובריים של עכברים (mESCs)⁸. עם זאת, צוין כי לתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) הייתה יכולת קיום נמוכה כאשר הם עטופים במיקרו-חלקיקי הידרוג'ל כאלה, ככל הנראה בשל הצורך הגדול יותר של תאים אלה ליצור מחדש את המגעים בין התא לתאים לאחר האנקפסולציה. סברנו כי מיקרו-קפסולות הטרוגניות, בעלות ליבה מימית, עשויות להתאים יותר לתמצות של תאים המסתמכים על התבססות מחדש מהירה של מגעים בין תאים לתאים. הרעיון של מכשיר מיקרופלואידי ממוקד זרימה צירית משותפת ליצירת מיקרו-קפסולות של מעטפת ליבה/הידרוג'ל מימית הותאם מ-He et ^al.9, אך במקום אלגינט שהופעל בגישה המקורית, הידרוג'ל מבוסס PEG שולב במעטפת. הדגמנו לראשונה אנקפסולציה מוצלחת והיווצרות כדורית של הפטוציטים ראשוניים במיקרו-קפסולות של קליפת ליבה^{10 ולאחרונה} תיארנו אנקפסולציה של תאי hES ו-iPS⁷. כפי שמתואר באיור 1A, הקפסולות מיוצרות בהתקן למיקוד זרימה שבו זרמי הזרימה של המעטפת והליבה עוברים מצד לצד לזרימה קו-צירית לפני שהם נפלטים לתוך שלב השמן. זרימת הליבה מכילה תאים ותוספים המגבירים את צמיגות התמיסה (PEG MW 35kD שאינו תגובתי ויודיקסנול - שם מסחרי OptiPrep) בעוד שזרם הקליפה מכיל מולקולות תגובתיות (PEG-4-Mal). זרם זרימה קו-צירית רציפה מחולק בנפרד לטיפות השומרות על ארכיטקטורת מעטפת הליבה. מבנה הליבה-מעטפת הופך לקבוע על ידי חשיפה ל-di-thiol crosslinker (DTT), המגיב עם PEG-4-Mal באמצעות כימיה של קליקים ומביא להיווצרות של עור או מעטפת הידרוג'ל דקים (כ-10 מיקרומטר). לאחר שהאמולסיה נשברת והקפסולות מועברות לשלב מימי, מולקולות של PEG מתפזרות מהליבה ומוחלפות במולקולות מים. התוצאה היא מיקרו-קפסולות של ליבה מימית ומעטפת הידרוג'ל.

להלן הוראות שלב אחר שלב כיצד ליצור התקנים מיקרופלואידיים, כיצד להכין תאים וכיצד לבצע אנקפסולציה של hPSCs.

Protocol

1. ייצור מכשירים

1. בצע את העיצובים עבור התקן המיקרו-אנקפסולציה והתקן הדיסוציאציה באמצעות תוכנת CAD^10,11.
2. ספין-ציפו את שלוש השכבות של הפוטורסיסט SU-8 ברצף על פרוסת סיליקון (איור 2A) כדי להשיג מבנים בגבהים הרצויים: 60, 100 ו-150 מיקרומטר.
   הערה: התהליך עבור התבניות העליונות והתחתונות זהה.
   1. ספין ציפו פרוסת סיליקון נקייה בקוטר 10 ס"מ עם פוטוריסט שלילי SU-8 2025 ב-1,100 סל"ד כדי ליצור את שכבת ה-60 מיקרומטר הראשונה. לאחר אפייה רכה ב-65 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ו-95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות על צלחת חמה, חשפו את התבנית באמצעות קשת ללא מסיכה על ידי העלאת קובץ העיצוב של תבנית ערוץ הליבה למחשב μPG 101. לאחר מכן, המשיכו עם האפייה לאחר החשיפה בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות ובטמפרטורה של 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   2. סובב את השכבה השנייה של SU-8 2025 (40 מיקרומטר) ב-1,500 סל"ד וחשוף על-ידי העלאת קובץ ה-CAD המתאים לתבנית ערוץ המעטפת.
      הערה: אפיות רכות ולאחר חשיפה היו דומות לשלב הקודם.
   3. ספין מצפה את השכבה השלישית של SU-8 2025 ב-1,400 סל"ד כדי להגיע לגובה של 50 מיקרומטר ולחזור על התהליך הנ"ל אך לחשוף את המבנים של שלב השמן.
   4. פתח את התבנית עם כל שלוש השכבות בצעד אחד על ידי טבילה במפתח SU-8 עד שכל הפוטורסיסט שלא נחשף יוסר.
   5. קשה לאפות את התבנית על צלחת חמה ב 160 °C (66 °F) במשך 10 דקות כדי לשפר את ההדבקה ולאטום סדקים קלים שיכולים להופיע לאחר הפיתוח.
   6. יש לחשוף את העובש לכלורוטרימתילסילן כדי למנוע הדבקת אלסטומר בשלב הבא ולהניח אותה בכלי פטרי בקוטר 15 ס"מ עד לשימוש.
3. הכינו את תבנית התקן הדיסוציאציה באותו אופן, כפי שמתואר באיור 1D ובאיור 2B. ספין מצפה שכבה אחת של פוטוריסט SU-8 על פרוסת סיליקון, כפי שתואר קודם לכן בשלב 1.2.3, כדי להשיג מבנים עם הגובה הרצוי: 50 מיקרומטר. נהלו את האפייה הרכה שלאחר החשיפה, ההתפתחות והאפייה הקשה בדומה לשלב הקודם.
   הערה: מערך של עמודים בצורת משולש כיסה את כל התא, כאשר המרווח בין העמודים הלך ופחת ככל שרוחב התא ירד לכיוון השקע. עמודי המשולש היו 200 מיקרומטרים לכל צד עם גובה שנע בין 400 מיקרומטר (בכניסה) ל-30 מיקרומטר (בשקע).
4. הכן את התבניות על ידי ליתוגרפיה רכה באמצעות פולידימתילסילוקסן (PDMS).
   1. ערבבו את בסיס האלסטומר PDMS ואת חומר הריפוי האלסטומר ביחס של 10:1 w/w בצנטריפוגה פלנטרית. יוצקים את התערובת הן על תבניות מאסטר של מיקרו-אנקפסולציה והן על תבנית ראשית של דיסוציאציה כדי ליצור שכבה של 3-4 מ"מ.
      הערה: מספיקה תערובת של 50 גרם של בסיס אלסטומר עם 5 גרם של חומר ריפוי כדי לכסות תבנית ראשית בעובי 3 מ"מ.
   2. הניחו את צלחות הפטרי המכילות את התבניות במפענח ואקום למשך 15 דקות כדי לנטרל את הגז של ה-PDMS הלא מרוסן.
   3. העבירו את כלי הפטרי לתנור ואופים בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 60 דקות לפחות.
   4. מוציאים את תבניות המאסטר מהתנור ומאפשרים להן להתקרר. באמצעות סכין מדויקת, חתכו בזהירות את ה-PDMS בהתאם לצורת הוופל וקילפו את חלקי ה-PDMS מהתבנית הראשית.
   5. חותכים את לוחות ה-PDMS על ידי חיתוך הקצוות של כל מכשיר עם אזמל, ואז מנקבים יציאות נוזלות כניסה/שקע בהתקן הדיסוציאציה ורק בהתקן המיקרופלואידי העליון באמצעות מחטי נירוסטה. מכסים את המכשירים בקלטת קסם כדי למנוע זיהום.
      הערה: מד המחט הוא 14 G ו- 15 G עבור יציאות כניסה ויציאה, בהתאמה.
   6. לצורך ההדבקה, טפלו בצדדים המעוצבים של חלקי ה-PDMS העליונים והתחתונים עם פלזמה_{O 2} על תחריט פלזמה למשך 2 דקות.
   7. יישרו את שני חלקי ה-PDMS מתחת לסטריאוסקופ לאחר הוספת שכבה מפרידה דקה של מים מזוקקים ישירות במיקרו-ערוצים (2 μL).
   8. הניחו את מכשיר ה-PDMS המיושר בתנור בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי להשלים את ההידבקות ולהחזיר את ה-PDMS למצבו ההידרופובי המקורי. אחסן את המכשירים עד לשימוש נוסף.
      הערה: התוצאה היא התקן ממוקד זרימה קואקסיאלי עם שלושה גבהים שונים של 120 מיקרומטר לליבה, 200 מיקרומטר עבור מעטפת ו- 300 מיקרומטר עבור תעלות שמן.
   9. על מנת להשתמש במכשיר מיד לאחר הדבקת הפלזמה, להזריק בזהירות אך בתקיפות 30 μL של תמיסת ציפוי הידרופובית לתעלות הנוזליות כדי להשיג ציפוי הידרופובי. לאחר מכן, מיד לטהר את האוויר לתוך התעלות עד שלא שאריות של תמיסת הציפוי ההידרופובית נצפו במכשיר.
   10. קשרו את מכשיר הדיסוציאציה על ידי טיפול תחילה בצד המעוצב של המכשיר ובזכוכית החלקה מנוקה עם פלזמת O₂ למשך 2 דקות, ולאחר מכן הרכיבו אותם לריפוי נוסף בתנור בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך הלילה.
       הערה: ניתן לאחסן התקנים עד לשימוש נוסף.

2. הכנת פתרונות

1. פתרונות מלאי. ראשית, הכינו פתרונות מלאי (פתרונות מרוכזים) שידוללו לריכוזים נמוכים יותר לשימוש בפועל.
   הערה: פתרונות מלאי משמשים כדי לחסוך זמן הכנה, לחסוך בחומרים, לצמצם את שטח האחסון ולשפר את הדיוק בעת הכנת פתרון עובד בריכוזים נמוכים יותר.
   1. הכן 30 מ"ל של תמיסת ליבה של 2x (16% PEG ו- 34% מדיית גרדיאנט צפיפות): ערבב 4.8 גרם של 35 kDa PEG, 10.2 מ"ל של מדיית שיפוע צפיפות ו- 19.8 מ"ל של מדיית DMEM/F12. סנן פתרון ליבה זה באמצעות מסנן מזרקים של 0.22 מיקרומטר.
   2. הכינו 50 מ"ל של שמן מינרלי עם 3% חומרים פעילי שטח: ערבבו 48.5 מ"ל של שמן מינרלי ו-1.5 מ"ל של חומרים פעילי שטח. שמור במצב סטרילי לאחר סינון דרך מסנן מזרק 0.22 מיקרומטר.
   3. הכן 50 מ"ל של שמן מינרלי עם 0.5% פעילי שטח: לערבב 49.75 מ"ל של שמן מינרלי ו 0.25 מ"ל של פעילי שטח. שמור במצב סטרילי.
   4. הכן 1 M Dithiotheritol (DTT): להמיס 1.5425 גרם של DTT במים מזוקקים 10 מ"ל. שמור במצב סטרילי.
   5. מכינים 1 M טריאתנולמין (TEA): מוסיפים 66.4 μL של TEA ב-433.6 μL של מים מזוקקים. שמור במצב סטרילי.
   6. הכן 1% Pluronic F127 (PF127): להמיס 100 מ"ג של PF127 ב 10 מ"ל של מים מזוקקים. שמור במצב סטרילי.
2. פתרונות עבודה
   1. הכינו תחליב קרוסלינקר על ידי ערבוב של 4.5 מ"ל של שמן מינרלי עם 3% פעילי שטח ו-300 μL של 1 M DTT (יחס של 1:15). וורטקס את הפתרון במשך 2 דקות ו sonicate במשך 45-60 דקות באמבטיה קולית ב 20 °C (86 °F). טען פתרון זה למזרק 5 מ"ל עם מחט 27 גרם.
      הערה: תחליב נוצר על ידי תערובת שמן/מים.
   2. הכן תמיסת שמן מיגון על ידי העמסת השמן המינרלי בחומר פעילי שטח של 0.5% למזרק 5 מ"ל עם מחט 27 גרם.
   3. הכן תמיסת מעטפת (8% w/v PEG-4-Mal ו-15 mM TEA) על ידי הוספת 32 מ"ג של PEG-4-Mal ב-400 μL של 1x DPBS כדי ליצור תמיסה של 8% w/v, ומערבולת את התמיסה למשך 2 דקות. לאחר מכן, הוסף 6 μL של 1 M TEA (ריכוז סופי 15 mM TEA). לבסוף, צנטריפוגה ב 13,000 x g במשך 5 דקות באמצעות מסנן ספין ולשמור אותו בחושך על הנדנדה במשך 30 דקות. לאחר מכן, טען פתרון זה למזרק 1 מ"ל עם מחט 27 G.
      הערה: השאירו את מיכל PEG-4-Mal לשבת בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות לפני פתיחת המכסה, ופוצצו גז N₂ כדי להחליף את ה-O₂ ב-N₂ לפני סגירת המכסה. וורטקס TEA לפני הוספת הפתרון.
3. הכן את מתלה התא בתמיסת הליבה
   1. טפלו ב-hPSCs עם טריפסין למשך 5 עד 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, לאסוף אותם מצלחות. מרווים את הטריפסין עם המדיום לאחר ניתוק התא, ולאחר מכן מעבירים את התאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל.
   2. צנטריפוגה את תרחיף התא בתפזורת (400 x g, 5 דקות). בזהירות לשאוף את supernatant ולאחר מכן resuspened את גלולת התא באמצעות נפח מינימלי של מדיום גדילה. ספרו את התאים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
      הערה: אליקוטים טיפוסיים של תאים מכילים תאים בגודל 12-20 x 10⁶ ומספיקים כדי ליצור 400 μL של תמיסת הליבה.
   3. קח 12-20 x 10⁶ תאים מתרחיף התא בתפזורת והצנטריפוגה של תרחיף התא / המדיה (400 x גרם, 5 דקות).
   4. שאפו בזהירות מדיה מכדור התא. לאחר מכן, הוסיפו 200 μL מדיה ו-200 μL של תמיסת PEG 2x (ריכוז סופי 30-50 x 10⁶ תאים/מ"ל) וערבבו בעדינות.
      הערה: ריכוזי תאים נמוכים (פחות מ-20 x 10⁶ תאים/מ"ל) גרמו לכמוסות ריקות רבות.
   5. הוסף 30 μL של 1% PF127 לפתרון.
   6. הכנס מוט מערבל מיקרו (2 מ"מ x 7 מ"מ) למזרק של 1 מ"ל, ולאחר מכן טען את התא המכיל תמיסת ליבה למזרק עם מחט של 27 גרם. שמור על הפתרון קר עם קרח במהלך כל תהליך האנקפסולציה.

3. מערך ניסיוני

1. מניחים מכשיר טיפות PDMS מלוכד, ארבע חתיכות באורך 20 ס"מ וחתיכה אחת של מיקרו-צינורות כניסה באורך 5 ס"מ (0.38 מ"מ I.D. x 1.1 מ"מ O.D.), חתיכה אחת של צינור מוצא 10 ס"מ (0.5 מ"מ I.D. x 1.5 מ"מ O.D.), ושש חתיכות של צינורות מתאימים בקוטר 0.5 ס"מ (1 מ"מ I.D. x 1.8 מ"מ O.D.) מתחת למקור אור חיידקי (בדרך כלל מובנה בארונות בטיחות ביולוגיים) ומעקרים עבור 30 דקות.
2. השתמש במלקחיים כדי להתאים את הצינורות ליציאות הכניסה הנוזליות וליציאות הדיסוציאציה.
3. השתמש בשלושת החלקים של מיקרו-צינוריות כניסה באורך 20 ס"מ עבור הקונכייה, שמן, פתחי תחליב קרוסלינקר וחתיכה אחת לכניסת התקן הדיסוציאציה. לאחר מכן, הכנס את הקצה הנגדי של הצינורות למחט של המזרק עם הפתרון המתאים. בינתיים, חברו את כניסת הליבה של המכשיר המיקרופלואידי ואת היציאה של התקן הדיסוציאציה באמצעות מיקרו-צינורית אחת בקוטר 5 ס"מ (איור 1C).
   הערה: יש לאבטח היטב את המיקרו-צינורות הכניסה בתוך צינורות ההתאמה, שהוכנסו בשלב האחרון.
4. הכנס צינור מוצא אחד לתוך יציאת היציאה הנוזלית והכניס את הקצה הנגדי למאגר איסוף.
5. מניחים את המכשיר על במת מיקרוסקופ ומחברים את הצינורות כדי להימנע מתנועה. יישמו את המיקרוסקופ ומקדו את המיקרוסקופ על זרבובית המכשיר לצורך בדיקת זרימה.
6. הניחו כל מזרק על משאבות מזרק שונות והבטיחו כראוי (איור 1B). תכנת כל משאבה על פי פרוטוקולי היצרן לקצבי הזרימה הבאים: ליבה (3-5 μL/min), מעטפת (3-5 μL/min), שמן מיגון (20-80 μL/min) ושמן crosslinking (40-60 μL/min). התחל את הזרימה בכל המשאבות.
7. המתן עד שכל נוזל ייכנס למכשיר ומלא את הערוצים תוך כדי דחיפת האוויר הנותר.
   הערה: אם יש כמות גדולה של אוויר בצינורות הכניסה, הגדל באופן זמני כל קצב זרימה עד להסרת האוויר לחלוטין. שים לב שקצב זרימה מופרז עלול להוביל לכשל באג"ח PDMS ל- PDMS.
8. כאשר מייצבים את היווצרות הקפסולה (איור 3), הניחו את הקצה הנגדי של צינור האיסוף לצינור חרוטי חדש עם 5 מ"ל של מדיית mTeSR.
   הערה: המדיה מכילה מעכב 10 μM ROCK, 100 פניצילין U/mL ו-100 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין.
9. לאחר מספר מספיק של כמוסות נאספים, דגירה ב 37 °C (84 °F) עם 5% CO₂ במשך 10 דקות. כמוסות הנמצאות בשלב השמן יהיו בחלק העליון של הצינור (ראו איור 4A). הקשה עדינה על הצינור גורמת לכמוסות משקעים לתחתית. לאחר מכן, רוב הנפט והתקשורת עשויים להיות שאפתניים.
10. אספו את הכמוסות מתחתית הצינור החרוטי, הניחו אותן על מסננת תאים (בגודל נקבובית של 100 מיקרומטר) ושטפו בכמויות אדירות של מדיה. לאחר מכן, אספו מיקרו-קפסולות באמצעות מדיה של 2 מ"ל בצלחת תרבית של 6 בארות על-ידי העברת המדיה דרך המסנן כשהיא הפוכה על גבי לוח הבאר (ראו איור 4A).

4. תרבית וניתוח hPSC במיקרו-קפסולות

1. תרבות בסיסית
   1. הדגירו את כמוסות תאי הגזע בצלחת תרבית של 6 בארות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO₂.
   2. שנה את המדיה כל יומיים על ידי איסוף הכמוסות על מסנן מסננת תאים, שטיפתן במדיה עודפת, והחזרתן לבאר חדשה בצלחות 6 בארות עם מדיה של 2 מ"ל כפי שנעשה בשלב 3.10.
   3. תרבית את הכמוסות במשך 10 ימים לפחות.
2. בצע את הבדיקה החיה/מתה כדי לקבוע את הכדאיות של תאי גזע עטופים.
   1. להפשיר פתרונות בדיקה חיים/מתים (אתידיום הומודימר-1 וקלצין AM).
   2. הוסף 4 μL של 2 μM ethidium homodimer-1 ו 1 μL של 4 μM calcein AM פתרונות 2 mL של DPBS סטרילי. מערבולת כדי להבטיח ערבוב מלא.
   3. אספו כ-100 מיקרו-קפסולות על מסננת תאים ושטפו אותן ב-DPBS סטרילי כדי לאפשר דיפוזיה של מדיום החוצה מהכמוסות.
   4. אסוף אותם שוב לצלחת תרבית של 12 בארות באמצעות 1 מ"ל של הפתרון שהוכן בשלב 4.2.2. דגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
   5. דמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
      הערה: יכולת הכדאיות של התאים ניתנת לכימות על-ידי חישוב אחוז התאים החיים, המוצגים כירוקים, בין המספר הכולל של התאים.
3. אפיון גודל ספרואידי.
   1. בעת הצורך, הניחו את לוחית הבאר עם מיקרו-קפסולות מתחת למיקרוסקופ ומדדו את קוטר הספרואידים המוצגים בתוכנה הקשורה עם פסי קנה מידה מתאימים.
   2. למדוד ולנתח את גודל הספרואיד.

תוצאות

על ידי ביצוע הפרוטוקול הנ"ל, הקורא יוכל לייצר התקנים מיקרופלואידיים ולייצר מיקרו-קפסולות נושאות תאים. איור 3A מציג דוגמאות למיקרו-קפסולות אופטימליות ולא אופטימליות שיוצרו באמצעות יצירת טיפות מיקרופלואידיות. פורמולציות שונות של PEG-4-Mal הביאו לכמוסות בעלות מורפולוגיות שונות...

Discussion

תהליך האנקפסולציה המתואר כאן מביא להיווצרות ניתנת לשחזור של כדוריות hPSC. פורמט המיקרו-קפסולה מקל על חלוקת הספרואידים לבארות של צלחת מיקרוטיטר לניסויים שמטרתם לשפר/למטב פרוטוקולי התמיינות או לבדוק טיפולים. ניתן להשתמש בספרואידים של תאי גזע עטופים גם בתרביות תרחיפים שבהן מעטפת הידרוג'ל מג?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 µm Syringe Filters	Genesee Scientific	25-244
1 ml syringe luer-lock tip	BD	309628
1x DPBS	Corning	23220003
4-arm PEG maleimide, 10kDa	Laysan Inc.	164-68
5 ml syringe luer-lock tip	BD	309646
6-WELL NON-TREATED PLATE	USA Scientific	CC7672-7506
Aquapel Applicator Pack	Aquapel Glass Treatment	47100
CAD software	Autodesk	AutoCAD v2020
CELL STRAINER 100 µm pore size	cardinal	335583
Chlorotrimethylsilane	Aldrich	386529-100mL
Countess II FL Automated Cell Counter	Life technology	A27974
Digital hot plate	Dataplate
Digital vortex mixer	Fisher Scientific	215370
Distilled water	Gibco	15230-162
Dithiotheritol (DTT)	Sigma	D0632-10G
DMEM/F12 media	gibco	11320-033
Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes	Fisher scientific	14-959-53A
Fisherbrand accuSpin Micro 17 Microcentrifuge	live	13-100-675
HERACELL VIOS 160i CO2 Incubator	Thermo Scientific	50144906
Inverted Fluorescence Motorized Microscope	Olympus	Olympus IX83
Laurell Spin Coaters	Laurell Technologies	WS-650MZ-23NPPB
Live/Dead mammalian staining kit	Fisher	L3224
Magic tape	Staples	483535
Micro Medical Tubing (0.015" I.D. x 0.043" O.D.)	Scientific Commodities, Inc	BB31695-PE/2
Micro stir bar	Daigger Scientific	EF3288E
MilliporeSigma Filter Forceps	Fisher scientific	XX6200006P
Mineral oil	Sigma	M8410-1L
mTeSR 1 Basal Medium	STEMCELL TECHNOLOGY	85850
Needles-Stainless Steel  14 Gauge	CML supply	901-14-025
Needles-Stainless Steel  15 Gauge	CML supply	901-15-050
OptiPrep	STEMCELL TECHNOLOGY	7820
Oven	Thermo Scientific	HERA THERM Oven
Penicillin:Streptomycin (10,000 U/mL Penicillin G, 10mg/mL Streptomycin)	Gemini	400-109
Petri Dish 150X20 Sterile Vent	Sarstedt, Inc.	82.1184.500
Plasma Cleaning System	Yield Engineering System, Inc.	YES-G500
Pluronic F-127	Sigma	P2443-250G
Poly(ethylene glycol) 35kDa	Sigma	94646-250G-F
PrecisionGlide Needle 27G	BD	305109
Rock inhibitor Y-27632 dihydrocloride	SELLECK CHEM	S1049-10mg
Silicon wafer 100mm	University Wafer	452
Slide glass (75mm ´ 25mm)	CardinalHealth	M6146
Span 80	Sigma	S6760-250ML
SpeedMixer	Thinky	ARE-310
Spin-X Centrifuge Tube Filter (0.22 µm)	Costar	8160
SU-8 2025	Kayaku Advanced Materials	Y111069 0500L1GL
SU-8 developer	Kayaku Advanced Materials	Y020100 4000L1PE
Surgical Design Royaltek Stainless Steel Surgical Scalpel Blades	fisher scientific	22-079-684
SYLGARD TM 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow Corning	2065622
Syringe pump	New Era Pump System, Inc	NE-4000
Triethanolamine	Sigma-aldrich	T58300-25G
TrypLE Express	Gibco	12604-013
Tygon Tubing (0.02" I.D. x 0.06" O.D.)	Cole-Parmer	06419-01
Tygon Tubing (0.04" I.D. x 0.07" O.D.)	Cole-Parmer	06419-04
Ultrasonic cleaner FS20D	Fisher Scientific	CPN-962-152R
Vacuum desiccator	Bel-Art	F42025-0000
Zeiss Stemi DV4 Stereo Microscope 8x-32x	ZEISS	435421-0000-000
μPG 101 laser writer	Heidelberg Instruments	HI 1128