ESLPのブタ幼体モデルにおける左肺同所性移植

要約

このプロトコルはESLPの研究との使用のために設計されている同所性左肺の同種移植の幼体のブタモデルを記述する。麻酔薬と外科的技術、および重要なステップとトラブルシューティングに重点が置かれています。

要約

肺移植は末期肺疾患のゴールドスタンダード治療法であり、世界中で年間4,600件以上の肺移植が行われています。しかし、肺移植は利用可能なドナー臓器の不足によって制限されています。そのため、待機リストの死亡率が高い。上皮内肺灌流(ESLP)は、一部のセンターでドナーの肺利用率を15%〜20%増加させました。ESLPは、辺縁ドナー肺を評価および再調整する方法として適用されており、許容できる短期および長期転帰が実証されています 拡張基準ドナー(ECD)肺の移植後。現在進行中のin vitro研究結果を検証するには、大型動物(in vivo)移植モデルが必要です。ヒトとブタの解剖学的および生理学的違いは、技術的および麻酔上の重大な課題を提起します。容易に再現可能な移植モデルにより、現在のESLP戦略のin vivo検証と、ドナーの肺機能を改善するために設計されたさまざまな介入の前臨床評価が可能になります。このプロトコルは同所性同置の左肺のallotransplantationのブタモデルを記述する。これには、麻酔薬と外科的技術、カスタマイズされた外科的チェックリスト、トラブルシューティング、変更、およびアプローチの利点と制限が含まれます。

概要

肺移植は、末期肺疾患の優れた長期治療です。世界中で年間4,600件以上の肺移植が行われています¹。しかし、現在のところ、肺移植には大きな限界があります。一つには、臓器の必要性が利用可能なドナーを凌駕し続けていることです。2012年以降、肺移植の割合は、移植候補の増加、ドナー数の増加、回復臓器の利用の改善などの複合効果により、毎年増加しているにもかかわらず、移植待機者の死亡率は有意に減少していません²。臓器の質に関する懸念は、20%〜30^%と報告されている臓器利用率^3,4,5という低い報告があり、もう一つの大きな限界を表しています。最後に、肺移植の術後転帰の傾向は満足のいくものではなく、長期移植片と患者の転帰は依然として他の固形臓器移植に遅れをとっています²。

新しい技術である上皮内肺灌流(ESLP)は、これらの制限を軽減する可能性を秘めています。ESLPは、限界ドナーの肺を評価および再調整する方法としてますます適用されており、 拡張基準ドナー(ECD)肺の移植後の許容可能な短期および長期転帰 6,7,8,9,10。その結果、ESLPは一部のセンターの使用率を15%〜20%向上させました6,7,8,9,10,11。

適切なESLP研究には、in vitro所見のin vivo検証が必要です。ただし、ESLP^12、13、^14、15のブタ肺移植モデルに関する文献は限られています。さらに、入手可能な文献では、肺移植のためのヨークシャー豚の麻酔薬管理に関する詳細が不十分であり、血行動態が非常に不安定になる可能性があります12,13,14,15。簡単に再現可能なモデルを確立することで、現在のESLP戦略のin vivo検証と、肺虚血再灌流障害を減らすためのさまざまな介入の前臨床評価が可能になります。本研究の目的は、ESLPで使用するための同所性左肺同種移植のブタモデルを説明することです。プロトコルには、麻酔薬と外科的技術の説明、カスタム外科的チェックリスト、およびトラブルシューティングの経験とプロトコルの変更に関する詳細が含まれています。この研究では、左肺ブタ移植モデルの限界と利点についても議論されています。この原稿は、35〜50kgのヨークシャー豚におけるブタの肺の回収プロセスを概説しておらず、ESLPの確立と終了についても説明していません。このプロトコルは、レシピエント移植手術にのみ対応しています。

プロトコル

すべての手順は、カナダ動物管理評議会のガイドラインおよび実験動物のケアと使用に関するガイドに準拠して行われました。プロトコルは、アルバータ大学の施設動物管理委員会によって承認されました。このプロトコルは、35〜50 kgの雌の若いヨークシャー豚に適用されています。豚は病原体を含まない食品グレードの標本です。それらは、カナダのアルバータ州エドモントンにある豚研究技術センター(https://srtc.ualberta.ca)から購入されます。ESLP手順に関与するすべての個人は、適切なバイオセーフティトレーニングを受けていました。

1.術前の準備と麻酔

注:豚は手術前に最大12時間一晩絶食します。

1. 手術室でレシピエントブタの前投薬として、ケタミン(20 mg / kg)とアトロピン(0.05 mg / kg)の筋肉内注射を投与します。
2. 豚を加熱された手術台に仰臥位に置き、正常温血症を維持し、マスク誘導を進めます。
3. 動物の体重と麻酔システムに応じた滴定酸素流量。
   注:酸素流量は20〜40 mL / kgである必要があります。
4. イソフルランを4%〜5%で投与し、1〜2分後に3%に減らします。.
5. 麻酔の深さを評価し、豚が有害な刺激に反応して離脱反射を持っていないことを確認します。5分ごとに繰り返します。
   注意: 痛みの反応が存在する場合は、適切な麻酔の深さが達成されるまで、イソフルラン投与の割合を増やします。.ケタミンとヒドロモルフォンによる維持鎮痛の詳細については、このセクションのステップ10を参照してください。.麻痺薬は投与されません。これにより、離脱反射の評価が可能になります。鼻つまみは有害な刺激として使用されます。
6. 正しい麻酔深度が確認されたら、豚を挿管します。40〜50kgの豚には、カスタムの10インチのフラットブレード喉頭鏡とサイズ9または10の気管内チューブを使用します。
7. パルスオキシメータプローブを舌(推奨)または耳に置き、酸素飽和度が90%を超えるようにします。
   注:体温は鼻プローブで監視されます。温熱パッドは、正常熱血症を維持するために使用されます。
8. 麻酔を維持するには、酸素流量(20〜40 mL / kg)と吸入ガス量(1%〜3%)を調整します。.
9. 人工呼吸器の設定は、呼吸数12〜30呼吸/分、TVを6〜10 mL / kg、PEEP 5 cm H 2 O、ピーク圧力を20 cm H₂Oに保ちます。
   注:標準的なICUスタイルの陽圧換気装置を使用して、麻酔と換気のための閉鎖システムを作成します。バイタルは継続的に監視され、15分間隔で記録されます。ABGは、動物の安定性に応じて、15〜60分ごとに描画されます。テレビは10 mL / kgまで目標とされていますが、6〜8 mL / kgが達成されます。図1は、ラボで適用された移植プロトコルの陰圧換気(NPV)-ESLPの概略 図 です。
10. ポビドンヨードを使用して切開部位を剃り、洗浄し、無菌的に準備します。
    注:ケタミン/アトロピンによる鎮静後、鎮痛療法には、3mg / kgケタミンIVq1時間(患者のパラメーターに応じて範囲1〜3 mg / kg)とヒドロモルフォン0.05 mg / kg IM q 2時間を、耳静脈に末梢に挿入されたIVラインを介して投与することが含まれます。.投与間隔が長くなると、心拍数の上昇や異常な呼吸パターン/腹筋の動きなど、画期的な痛みの反応が生じます。.

2.中心静脈および動脈ラインの挿入

1. 液体とヘパリン投与のために中心線を挿入します。.
   注: 総 IV 輸液投与は 1 mL/kg/h に計算され、体液ボーラスは MAP >60 mmHg を維持するために PRN を投与されます。セントラルラインは、ステロイド、抗生物質、昇圧剤、強心剤の投与にも使用されます。ラインの位置については 、図2A を参照してください。
   1. ポビドンヨード調製液を使用して皮膚を準備し、完全に乾かします。電気焼灼を使用して、気管を中心として5〜8cmの正中線切開を行い、胸骨切痕から頭側に伸ばします。
   2. 焼灼を使用して皮膚と皮下脂肪を分割します。
   3. ストラップの筋肉間の正中線面を分割し、結合組織層を分割して、気管の外側にある左または右の頸動脈血管内束を特定します。
   4. シルクタイ(サイズ2-0)を血管ループとして使用して、頸静脈の近位および遠位の制御を取得します。
   5. 頭蓋を囲むネクタイを結び、近位ネクタイを上向きに引っ込めて血流をコントロールします。
   6. メッツェンバウムのハサミ( 材料表を参照)を使用して静脈を小さく切開し、2ポート、7Frの中心線(血管の円周の~1/3)を収容します。
   7. 同時に、近位血管ループの張力を解放し、静脈をカニューレ挿入し、次にカニューレを10cmの深さで静脈に固定するように結び付けます。
   8. ラインをヘパリンで洗い流し、0.9%生理食塩水のIVラインに接続し、豚が脱水症状で血管内が枯渇している場合は輸液を投与します。
      メモ: ヘパリンは未使用のポートをロックします。
   9. 500mgのメチルプレドニゾンと1gのセファゾリンIVを投与します。.
2. 正確な血圧管理のために、7 Fr動脈ラインを使用して総頸動脈をカニューレ挿入するのと同じ手法に従います。

3.左肺の調達

1. 豚を右外側褥瘡の位置に置きます。
2. 左前外側開胸術を行います(図2)。
   1. ポビドンヨード調製液を使用して皮膚を準備し、完全に乾かします。開胸切開部(20 cm)に次のランドマークを使用してマークを付けます:触診を使用して左肩甲骨の先端を特定します。同様に、触診で胸骨より劣る剣状突起を特定します。 図 2B に示すように、この 2 つを接続します。
   2. 合計10 mLの0.25%ブピバカインを切開線と切開の上下の2つのリブスペースに注入します。
   3. 電気焼灼を使用して、皮膚、皮下層、筋肉層を解剖します。広背筋は分割する必要があります。切開部のすぐ下の肋骨を特定し、肋骨の上部を焼灼して、肋間神経血管束を避けながら肋間筋を露出させます。
   4. 蚊の止血剤を使用して肋骨のすぐ上の肋間筋に穴を開け、指を使って胸の内側を感じて癒着します。肋骨の上端に沿って焼灼しながら、ヤンカウアー吸引または指( 材料表を参照)を使用して肺を押しのけ、開胸術を延長します。
      1. 胸骨から1インチ離れるまで開胸術を前方に伸ばします。開胸術を傍脊髄筋まで後方に伸ばします。
   5. Cooley胸骨リトラクター( 材料表を参照)を挿入して、開胸術を広く(10 cm)開きます(図2C)。肺を引っ込めて、左半接合静脈を露出させます(図2D)。
   6. メッツェンバウムのハサミと細かいラウアーを使用して、左半接合静脈を円周方向に解剖します。容器を絹のタイで囲み、結紮してトランセクトします(図2E)。コントロールを強化するために、近位の切り株にシルクのネクタイを締めてください。
      注:ラウアーは、組織の解剖に使用される直角クランプまたはセリアッククランプです。
   7. 左肺動脈(PA)と左肺静脈(PV)を解剖します。コントロールのために絹のネクタイで静脈を囲みます(図2F)。
      注:優れたPVは非常に小さく、個々の解剖学的構造に応じて、分岐点または共通の幹で縫合糸結紮されています。左主幹気管支はPAとLA(左心房)の奥深くにあるため、動脈と静脈をクランプして切除するまで簡単に解剖できない場合があります(図2G)。
   8. PAをクランプする5分前に5000ユニットのヘパリンIVを投与します。
      注:ヘパリン5000ユニットIVは、PAをクランプ解除する5分前にも投与されます。その後、1時間ごとに1000単位のヘパリンIVが投与されます。
   9. PA(DeBakeyクロスクランプ)、左下肺静脈(Satinskyクランプ)、および左気管支(スプーンポッツクランプ)を個別にクランプします( 材料表を参照)。左気管支をクランプしたら、一回換気量を5 mL / kgに減らします。.
   10. PA、左下肺静脈、および左気管支を切除します。ティッシュカフを少なくとも0.5cm残して縫います。左下肺靭帯を分割し、左肺を切除します。
       注:左肺は、対照組織型のために廃棄または保持することができます。

4.ESLPの終了、左肺の分裂、および電解液による洗い流し

1. 換気チューブを最大吸気でクランプし、灌流と換気を終了し、肺をESLP装置から切り離します。
2. 肺の重さを量って、浮腫形成の量を決定します。
   注:浮腫は、過剰な体液の蓄積による組織の腫れです。
3. 副葉の組織生検を行い、3等分し、最適切削温度(OCT)ゲル、ホルマリン、液体窒素中での急速凍結のそれぞれに1個ずつ入れます。
   注: この手順は、通常、作成者のラボで行われます。OCTおよび急速凍結サンプルは-80°Cの冷凍庫に保管し、ホルマリンで保存したサンプルは適切に密閉された容器に入れ、4°Cの冷蔵庫に保管します。特定のESLPプロトコルと組織分析の詳細は、他の場所で公開されています¹⁶。
4. 左ドナー肺を右肺から分けます。1cmのドナーPA、1cmのドナー気管支、および適切なドナーLAカフ(円周方向に~0.5cm)を残して、レシピエントLAに縫い付けます(図2H)。左の劣ったPVと残った上質のPVは、後の吻合を容易にするために、ドナーLA壁と連続して残します。
5. 左肺の重さを量ります。
6. IVラインに接続されたドロップ吸盤を使用してドナーの左PAをカニューレ挿入し、500 mLの細胞外、低カリウム、デキストランベースの電解質保存溶液を肺血管系から順行性に洗い流します。フラッシュ中にシルクタイでPAにカニューレを固定し、フラッシュが完了したら解放します。
   メモ:上記の手順は、この作業に使用される特定のESLPデバイスに関連し、他のデバイスに直接適用できない場合があります。

5.左肺移植

1. ドナー肺を下葉から始めてレシピエントの胸に挿入します。肺を無理に押し込まないでください。
   注:胸骨リトラクターを締めてドナーの肺を収容するために、胸郭下部を上向きに持ち上げる必要がある場合があります。理想的には、レシピエントはドナーよりも数キログラム大きいので、サイズが一致しやすくなります。
2. 最初にTF針に4-0プロレンを使用して気管支吻合を行います(図2I)。
   注:実行中のエンドツーエンドの吻合はうまく機能します。縫製する前に、2つの吻合部の端から余分な長さを切り取り、余分な組織によって引き起こされるねじれを防ぎます。
3. 実行中のエンドツーエンドの吻合を使用して、BV-1 針に 6-0 プロレンを使用して LA 吻合を 2 回目に実行します。繰り返しになりますが、ねじれを防ぐために余分な組織を切り取ります。
   注:LAは砕けやすく、小さなBV-1針の恩恵を受けます。ドナーの水平咬傷は、適切な組織を購入し、ドナーのIPVとSPVをレシピエントのIPV / LA開口部に縫い付けることによって引き起こされるサイズの不一致を修正するために必要になる場合があります。
4. ドナーSPVを下PVおよびLA吻合に組み込み、左上肺葉静脈ドレナージを可能にします(図2J)。
   注:枝上肺静脈(SPV)の直径は0.5cm未満です。一般的なSPVトランクは長さが可変であり、日常的に存在するわけではないため、ドナーとレシピエントのSPV間の直接吻合は不十分な選択肢です。
5. 実行中のエンドツーエンドの吻合を使用して、BV-6-0 針の 1-1 プロレンで PA 吻合を完了します。繰り返しになりますが、ねじれを防ぐために余分な組織を切り取ります。
6. 気管支クランプを取り外し、TVを目標に10 mL / kgに増やします。
7. ヘパリン化を確認し、カリウムシフト(フロセミド40mg、インスリン10単位、25%デキストロース溶液100mL)を投与し、PAクランプを部分的に開き、空気を抜き、PA縫合糸を結びます。10分後にPAクランプを完全に解放します。
8. その間、LAの空気を抜き、縫合糸を結び、LAクランプを取り外します。
9. 中心線から再灌流血液ガスを採取し、左中葉から再灌流組織生検を行います。
   注:組織生検を行うには、サイズ0のシルクタイを使用して中葉頂点の1 cmの部分を囲み、タイダウンして組織を捕らえ、分離した部分をメッツェンバウムのハサミで切断します。生検を3等分し、前述のように管理します。
10. 左右の肺気管支鏡検査を実施して、気管支吻合を評価し、分泌物を吸引します。アダプター接続を使用して気管支鏡を気管内チューブに挿入します。
    1. スコープを吸引に接続します。気管支鏡を左気管支に進めます。気管支吻合部を検査します(図2N)。スコープを細気管支に進め、液体を吸引します。右側で繰り返します。
       注意: 酸素飽和度が90%を下回らないようにしてください。飽和度がこのレベルを下回った場合は、スコープを取り外し、ブタが数分間中断のない換気で回復するのを待ちます。
11. 20 Fr の可鍛性胸腔チューブを挿入し (図 2L)、開胸術を 3 層に閉じ (図 2M)、動脈血ガス (ABG) が安定したらすぐに豚をうつ伏せにします (図 2O)。
12. うつ伏せの姿勢で4時間にわたって豚を監視します。30分ごとにABG分析を実行します。再灌流後、毎時1000単位のヘパリンを投与する。
    1. 1時間ごとに10 mLの血液サンプルを採取し、遠心分離および炎症マーカーの酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)分析を行います¹⁶。
       注:遠心分離パラメータについては、後で詳しく説明します。

6.孤立した左肺の評価

1. 豚を仰臥位に置き、ポビドンヨウ素調製液を使用して胸骨を再準備します。最終的な孤立した左肺評価のために正中胸骨切開術を実施します(図2P)。
2. メッツェンバウムのハサミを使用して左胸膜を開き、前述のように左下葉から組織生検を行います(ステップ5.9の注)。
3. 副葉胸膜を開き、メッツェンバウムのハサミを使用して総静脈を解剖します。
   注:これは後でクランプされます。
4. 21Gの針を使用してLA吻合から血液サンプルを採取します。針を左肺静脈に向け、一般的な左心房または副葉幹から遠ざけます。.
5. 右胸膜を開いて、右門部クランプ用のスペースを作ります( 材料表を参照)。右下肺靭帯を門まで解剖します。クランプを門部の周囲に上、下、前方に配置できることを確認してください。
   注:これにより、肺門が閉塞し、すべての酸素化が左肺に依存するようになります。このとき、右肺は換気されませんが、これは人工呼吸器による膨張/収縮の欠如によって明らかになるはずです。右下葉を胸から持ち上げて、これを達成することができます。
6. DeBakey大動脈クロスクランプ( 材料表を参照)を使用して副葉静脈をクランプし、LAへの副葉ドレナージを閉塞します(図2Q)。
7. 右の鼻冠をクランプし、左肺に向けられた 21 G の針を使用して、左 PV 吻合から次の連続血液サンプルを採取します: クランプ後 0 分、1 分、2 分、5 分、および 10 分後。
   注:酸素分圧(PaO₂)の傾向を監視するために、5つのサンプルを採取します(図2R)。PaO₂ は、適切な左肺機能を表すために比較的安定しているはずです。また、5つのサンプルは、サンプルの凝固に問題がある場合や、ABG分析で問題が発生した場合に、品質評価の保証を提供します。
8. 吻合部を切除し、左肺を切除します。IVCをトランセクトして、放血による麻酔下での安楽死を促進します。
   注:レシピエントブタの総麻酔時間は8時間です。
9. ドナー肺の重量を量って浮腫の形成を評価し、全体的な外観を検査します。PA、気管支、およびLAカフを検査して、ドナーの肺とレシピエント縦隔内の血栓またはその他の病状の兆候がないか調べます。
10. 最終ガス分析を実行し、灌流液サンプルを遠心分離し、前述のように組織生検を保存します(ステップ4.3の注記)。
    注:遠心分離の設定は、112 x g、加速度9回、減速9回、4°C、持続時間15分です。

結果

すべての結果は、NPV-ESLP^{16 の 12} 時間後の 4 時間の再灌流のコンテキストにあります。肺外植片では、いくつかの臨床転帰が予想されます(図3)。典型的には、ブタは左肺移植が成功した後も血行動態的に安定しているが、手術に対する血管拡張反応のためにフェニレフリンの低用量注入(用量範囲:2〜10 mg / h)が必要になる場合があります。心拍数は約100〜...

ディスカッション

このプロトコルにはいくつかの重要な外科的ステップが関与しており、移植と肺の評価を確実に成功させるためにトラブルシューティングが必要です。ブタの幼体の肺は、ヒトの成体の肺に比べて非常にデリケートであるため、手術医はブタの肺を扱う際には注意が必要です。これは、ESLPを12時間実行した後、臓器が体液量を帯び、過度の操作による損傷を受けやすくなるため、特に当ては?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABL 800 FLEX Blood Gas Analyzer	Radiometer	989-963
Adult-Pediatric Electrostatic Filter HME - Small	Covidien	352/5877
Allison Lung Retractor	Pilling	341679
Arterial Filter	SORIN GROUP	01706/03
Backhaus Towel Clamp	Pilling	454300
Bovine Serum Albumin	MP biomedicals	218057791
Biomedicus Pump	Maquet	BPX-80
Bronchoscope
Cable Ties – White 12”	HUASU International	HS4830001
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C69-500G
Cooley Sternal Retractor	Pilling	341162
CUSHING Gutschdressing Forceps	Pilling	466200
Debakey-Metzenbaum Dissecting	Pilling	342202
Scissors	Pilling	342202
DeBakey Peripheral Vascular Clamp	Pilling	353535
Debakey Straight Vascular Tissue Forceps	Pilling	351808
D-glucose	Sigma-Aldrich	G5767-500G
Drop sucker
Endotracheal Tube 9.0mm CUFD	Mallinckrodt	9590E
Flow Transducer	BIO-PROBE	TX 40
Infusion Pump	Baxter	AS50
Inspire 7 M Hollow Fiber Membrane Oxygenator	SORIN GROUP	K190690
Intercept Tubing Connector 3/8" x 1/2"	Medtronic	6013
Intercept Tubing 1/4" x 1/16" x 8'	Medtronic	3108
Intercept Tubing 3/8" x 3/32" x 6'	Medtronic	3506
Laryngoscope	N/A	N/A	Custom-made with 10-inch blade
Metzenbaum Dissecting Scissors	Pilling	460420
Medical Carbon Dioxide Tank	Praxair	5823115
Medical Oxygen Tank	Praxair	2014408
Medical Nitrogen Tank	Praxair	NI M-K
Mosquito Clamp	Pilling	181816
Harken Auricle Clamp
Organ Chamber	Tevosol
PlasmaLyte A	Baxter	TB2544
Poole Suction Tube	Pilling	162212
Potassium Phosphate	Fischer Scientific	P285-500G
PERFADEX Plus	XVIVO	19811
Satinsky Clamp	Pilling	354002
Scale	TANITA	KD4063611
Silicon Support Membrane	Tevosol
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519-1KG
Sodium Chloride 0.9%	Baxter	JB1324
Sorin XTRA Cell Saver	SORIN GROUP	75221
Sternal Saw	Stryker	6207
Surgical Electrocautery Device	Kls Martin	ME411
TruWave Pressure Transducer	Edwards	VSYPX272
Two-Lumen Central Venous Catheter 7fr X2	Arrowg+ard	CS-12702-E
Vorse Tubing Clamp	Pilling	351377
Willauer-Deaver Retractor	Pilling	341720
Yankauer Suction Tube	Pilling	162300
0 ETHIBOND Green 1X36" Endo Loop 0	ETHICON	D8573
0 PDS II CP-1 2x27”	ETHICON	Z467H
1 VICRYL MO-4 1x18”	ETHICON	J702D
2-0 SILK Black 12" x 18" Strands	ETHICON	SA77G
4-0 PROLENE Blue TF 1x24”	ETHICON	8204H
6-0 PROLENE Blue BV 2x30”	ETHICON	M8776
21-Gauge Needle