Orthotope Transplantation der linken Lunge in einem juvenilen Schweinemodell für ESLP

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt ein juveniles Schweinemodell der orthotopen Allotransplantation der linken Lunge, das für die ESLP-Forschung entwickelt wurde. Der Fokus liegt auf Anästhesie- und Operationstechniken sowie kritischen Schritten und der Fehlerbehebung.

Zusammenfassung

Die Lungentransplantation ist der Goldstandard bei der Behandlung von Lungenerkrankungen im Endstadium, wobei jährlich weltweit über 4.600 Lungentransplantationen durchgeführt werden. Die Lungentransplantation wird jedoch durch einen Mangel an verfügbaren Spenderorganen eingeschränkt. Daher gibt es eine hohe Sterblichkeit auf der Warteliste. Die Ex-situ-Lungenperfusion (ESLP) hat die Auslastung der Spenderlunge in einigen Zentren um 15 % bis 20 % erhöht. Die ESLP wurde als Methode zur Beurteilung und Rekonditionierung von marginalen Spenderlungen eingesetzt und hat akzeptable kurz- und langfristige Ergebnisse nach der Transplantation von Extended-Criteria-Spenderlungen (ECD) gezeigt. Großtiertransplantationsmodelle (in vivo) sind erforderlich, um laufende In-vitro-Forschungsergebnisse zu validieren. Anatomische und physiologische Unterschiede zwischen Mensch und Schwein stellen erhebliche technische und anästhetische Herausforderungen dar. Ein leicht reproduzierbares Transplantationsmodell würde die In-vivo-Validierung aktueller ESLP-Strategien und die präklinische Bewertung verschiedener Interventionen zur Verbesserung der Spenderlungenfunktion ermöglichen. Dieses Protokoll beschreibt ein porcines Modell der orthotopen Allotransplantation der linken Lunge. Dazu gehören Anästhesie- und Operationstechniken, eine maßgeschneiderte chirurgische Checkliste, Fehlerbehebung, Modifikationen sowie die Vorteile und Grenzen des Ansatzes.

Einleitung

Die Lungentransplantation ist die wichtigste Langzeitbehandlung für Lungenerkrankungen im Endstadium. Weltweit werden jährlich über 4.600 Lungentransplantationen^{durchgeführt1.} Allerdings ist die Lungentransplantation derzeit mit erheblichen Einschränkungen verbunden. Zum einen stellt der Bedarf an Organen die verfügbaren Spender immer mehr in den Schatten. Obwohl die Raten von Lungentransplantationen seit 2012 jedes Jahr gestiegen sind, was auf die kombinierten Auswirkungen von mehr Kandidaten für eine Transplantation, einer Zunahme der Anzahl von Spendern und einer verbesserten Verwendung von geborgenen Organen zurückzuführen ist, ist die Sterblichkeit auf der Transplantationswarteliste nicht signifikant gesunken². Bedenken hinsichtlich der Organqualität stellen eine weitere große Einschränkung dar, wobei die berichteten Organauslastungsraten bei nur 20 % bis 30 % ^liegen3,4,5. Schließlich sind die Trends bei den postoperativen Ergebnissen der Lungentransplantation weniger als zufriedenstellend, wobei die langfristigen Transplantat- und Patientenergebnisse immer noch hinter denen anderer solider Organtransplantationen zurückbleiben².

Eine neue Technologie, die Ex-situ-Lungenperfusion (ESLP), hat das Potenzial, diese Einschränkungen abzumildern. Die ESLP wird zunehmend als Methode zur Beurteilung und Rekonditionierung von marginalen Spenderlungen eingesetzt und hat akzeptable kurz- und langfristige Ergebnisse nach der Transplantation von Extended-Criteria-Spenderlungen (ECD) gezeigt 6,7,8,9,10. Infolgedessen hat ESLP die Auslastung in einigen Zentren um 15 % bis 20 % erhöht6,7,8,9,10,11.

Eine ordnungsgemäße ESLP-Forschung erfordert die In-vivo-Validierung von In-vitro-Befunden; Es gibt jedoch nur begrenzte Literatur zu Lungentransplantationsmodellen für ESLP^12,13,14,15. Darüber hinaus enthält die verfügbare Literatur nur unzureichende Details zum Anästhesiemanagement von Yorkshire-Schweinen für Lungentransplantationen, die hämodynamisch sehr instabil sein können^12,13,14,15. Die Etablierung eines leicht reproduzierbaren Modells würde die In-vivo-Validierung aktueller ESLP-Strategien und die präklinische Bewertung verschiedener Interventionen zur Verringerung von Lungenischämie-Reperfusionsschäden ermöglichen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist es, ein porcines Modell der orthotopen Allotransplantation der linken Lunge für den Einsatz bei ESLP zu beschreiben. Das Protokoll enthält Beschreibungen der Anästhesie- und Operationstechniken, eine benutzerdefinierte chirurgische Checkliste sowie Details zur Fehlerbehebung und zu Protokolländerungen. Die Grenzen und Vorteile des Modells der Transplantation von Schweinen in der linken Lunge wurden ebenfalls in dieser Arbeit diskutiert. Dieses Manuskript beschreibt weder den Entnahmeprozess von Schweinelungen bei 35-50 kg schweren Yorkshire-Schweinen, noch behandelt es die Etablierung und Beendigung von ESLP. Dieses Protokoll bezieht sich ausschließlich auf die Transplantation des Empfängers.

Protokoll

Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Canadian Council on Animal Care und dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt. Die Protokolle wurden vom Institutional Animal Care Committee der University of Alberta genehmigt. Dieses Protokoll wurde bei weiblichen jungen Yorkshire-Schweinen zwischen 35 und 50 kg angewendet. Schweine sind keimfreie, lebensmitteltaugliche Exemplare. Sie werden vom Swine Research and Technology Centre in Edmonton, AB, Kanada (https://srtc.ualberta.ca) bezogen. Alle Personen, die an ESLP-Verfahren beteiligt waren, hatten eine angemessene Schulung zur biologischen Sicherheit erhalten.

1. Präoperative Vorbereitungen und Anästhesie

HINWEIS: Schweine werden vor der Operation über Nacht für eine maximale Dauer von 12 Stunden nüchtern gemacht.

1. Verabreichen Sie intramuskuläre Injektionen von Ketamin (20 mg/kg) und Atropin (0,05 mg/kg) als Prämedikation für das Empfängerschwein im Operationssaal.
2. Legen Sie das Schwein in Rückenlage auf einen beheizten Operationstisch, um die Norrhythmie aufrechtzuerhalten, und fahren Sie mit der Maskeninduktion fort.
3. Titrieren Sie die Sauerstoffdurchflussrate entsprechend dem Gewicht des Tieres und dem Anästhesiesystem.
   HINWEIS: Der Sauerstofffluss sollte 20-40 ml/kg betragen.
4. Isofluran mit 4%-5% verabreichen und nach 1-2 min auf 3% reduzieren.
5. Bewerten Sie die Tiefe der Anästhesie und stellen Sie sicher, dass das Schwein keinen Rückzugsreflex als Reaktion auf einen schädlichen Reiz hat. Wiederholen Sie dies alle 5 Minuten.
   HINWEIS: Wenn eine Schmerzreaktion vorhanden ist, erhöhen Sie den Prozentsatz der Isofluran-Verabreichung, bis die angemessene Anästhesietiefe erreicht ist. In Schritt 10 dieses Abschnitts finden Sie weitere Details zur Erhaltungsanalgesie mit Ketamin und Hydromorphon. Es werden keine Lähmungsmittel verabreicht. Dies ermöglicht die Beurteilung eines Rückzugsreflexes. Ein Nasenkneifen wird als schädlicher Reiz verwendet.
6. Intubieren Sie das Schwein, sobald die richtige Narkosetiefe bestätigt ist. Verwenden Sie ein spezielles 10-Zoll-Laryngoskop mit flacher Klinge und Endotrachealtuben der Größe 9 oder 10 für Schweine mit einem Gewicht von 40-50 kg.
7. Platzieren Sie eine Pulsoximetersonde auf der Zunge (bevorzugt) oder am Ohr und streben Sie eine Sauerstoffsättigung von über 90 % an.
   HINWEIS: Die Temperatur wird über eine Nasensonde überwacht. Ein Heizkissen wird verwendet, um die Normothermie aufrechtzuerhalten.
8. Um die Anästhesie aufrechtzuerhalten, passen Sie den Sauerstofffluss (20-40 ml/kg) und die Inhalationsgasrate (1%-3%) an.
9. Halten Sie die Einstellungen des Beatmungsgeräts bei einer Atemfrequenz von 12-30 Atemzügen/min, TV bei 6-10 ml/kg, PEEP bei 5 cm H2 O und Spitzendruck bei 20 cm H₂O.
   HINWEIS: Ein Standard-Überdruckbeatmungsgerät für die Intensivstation wird verwendet, um ein geschlossenes System für Anästhesie und Beatmung zu schaffen. Die Vitalwerte werden kontinuierlich überwacht und in 15-Minuten-Intervallen aufgezeichnet. ABGs werden alle 15-60 Minuten gezogen, abhängig von der Stabilität des Tieres. Obwohl Fernseher bis zu 10 ml/kg anvisiert werden, werden 6-8 ml/kg erreicht. Abbildung 1 zeigt eine schematische Übersicht über die Unterdruckbeatmung (NPV)-ESLP für das im Labor angewandte Transplantationsprotokoll.
10. Rasieren, waschen und aseptisch die Inzisionsstelle mit Povidon-Jod vorbereiten.
    HINWEIS: Nach der Sedierung mit Ketamin/Atropin umfasst das analgetische Regime die Verabreichung von 3 mg/kg Ketamin i.v. alle 1 h (Bereich 1-3 mg/kg je nach Patientenparametern) und Hydromorphon 0,05 mg/kg i.m. alle 2 h über einen peripher eingeführten IV-Zugang in einer Ohrvene. Jede längere Dauer zwischen den Dosen führt zu einer bahnbrechenden Schmerzreaktion, wie z. B. erhöhter Herzfrequenz und abnormalen Atemmustern / Bauchmuskelbewegungen.

2. Einlegen zentralvenöser und arterieller Zugänge

1. Legen Sie eine zentrale Leitung für die Verabreichung von Flüssigkeit und Heparin ein.
   HINWEIS: Die gesamte intravenöse Flüssigkeitsgabe wird auf 1 ml/kg/h berechnet, und Flüssigkeitsboli werden PRN verabreicht, um einen MAP-Wert von >60 mmHg aufrechtzuerhalten. Die zentrale Linie wird auch zur Verabreichung von Steroiden, Antibiotika, Vasopressoren und Inotropika verwendet. Siehe Abbildung 2A für die Linienpositionierung.
   1. Bereiten Sie die Haut mit einer Povidon-Jod-Vorbereitungslösung vor und lassen Sie sie vollständig trocknen. Verwenden Sie Elektrokauter, um einen 5-8 cm langen Mittellinienschnitt mittig über der Luftröhre zu machen und sich kranial von der Sternumkerbe aus zu erstrecken.
   2. Trennen Sie die Haut und das Unterhautfett mit Kauter.
   3. Teilen Sie die Mittellinienebene zwischen den Bandmuskeln und teilen Sie dann die Bindegewebsschichten, um das linke oder rechte intravaskuläre Bündel der Halsschlagader lateral der Luftröhre zu identifizieren.
   4. Erhalten Sie eine proximale und distale Kontrolle der Halsvene mit Seidenbändern (Größe 2-0) als Gefäßschlingen.
   5. Binden Sie die kraniale umschließende Bindung und ziehen Sie die proximale Bindung nach oben zurück, um den Blutfluss zu kontrollieren.
   6. Machen Sie einen kleinen Schnitt in der Vene mit einer Metzenbaum-Schere (siehe Materialtabelle), um eine zentrale Leitung mit zwei Anschlüssen und 7 Fr (~1/3 des Umfangs des Gefäßes) aufzunehmen.
   7. Lösen Sie gleichzeitig die Spannung an der proximalen Gefäßschlinge, kanülieren Sie die Vene und binden Sie sie dann fest, um die Kanüle in einer Tiefe von 10 cm in der Vene zu sichern.
   8. Spülen Sie den Zugang mit Heparin, schließen Sie ihn an einen IV-Zugang mit 0,9 % normaler Kochsalzlösung an und verabreichen Sie Flüssigkeit, wenn das Schwein durch Dehydrierung intravaskulär erschöpft ist.
      HINWEIS: Heparin sperrt alle nicht verwendeten Ports.
   9. Verabreichen Sie 500 mg Methylprednison und 1 g Cefazolin i.v.
2. Befolgen Sie die gleichen Techniken, um die Arteria carotis communis mit einem arteriellen 7-Fr-Zugang für ein genaues Blutdruckmanagement zu kanülieren.

3. Beschaffung der linken Lunge

1. Positionieren Sie das Schwein in einer rechten seitlichen Dekubitusposition.
2. Führen Sie eine linksanterolaterale Thorakotomie durch (Abbildung 2).
   1. Bereiten Sie die Haut mit einer Povidon-Jod-Vorbereitungslösung vor und lassen Sie sie vollständig trocknen. Markieren Sie den Thorakotomie-Schnitt (20 cm) mit den folgenden Orientierungspunkten: Verwenden Sie Palpation, um die Spitze des linken Schulterblatts zu identifizieren; Identifizieren Sie auch den Processus xiphoideus unterhalb des Brustbeins durch Palpation. Verbinden Sie die beiden wie in Abbildung 2B dargestellt.
   2. Injizieren Sie insgesamt 10 ml 0,25%iges Bupivacain in die Inzisionslinie und zwei Rippenräume oberhalb und unterhalb der Inzision.
   3. Verwenden Sie Elektrokauter, um die Haut, die subkutanen Schichten und die Muskelschichten zu präparieren. Der Latissimus dorsi muss geteilt werden. Identifizieren Sie die Rippe direkt unter dem Einschnitt und kauterisieren Sie auf der Oberseite der Rippe, um die Zwischenrippenmuskeln freizulegen und gleichzeitig das neurovaskuläre Zwischenrippenbündel zu vermeiden.
   4. Verwenden Sie ein Mückenhämostat, um die Zwischenrippenmuskeln direkt über der Rippe zu punktieren, und tasten Sie dann mit einem Finger in der Brust nach Verwachsungen. Schieben Sie die Lunge mit einem Yankauer-Sauger oder Finger weg (siehe Materialtabelle), während Sie entlang der Oberkante der Rippe kauterisieren, um die Thorakotomie zu verlängern.
      1. Verlängern Sie die Thorakotomie nach vorne, bis sie 1 Zoll vom Brustbein entfernt ist. Verlängern Sie die Thorakotomie posterior auf die paraspinalen Muskeln.
   5. Setzen Sie einen Cooley-Sternumretraktor ein (siehe Materialtabelle), um die Thorakotomie weit (10 cm) zu öffnen (Abbildung 2C). Ziehen Sie die Lunge zurück, um die linke hemi-azygote Vene freizulegen (Abbildung 2D).
   6. Die linke Hemiazygosvene wird mit einer Metzenbaum-Schere und einer feinen Lauer-Vene zirkumferentiell präpariert. Umschließen Sie das Gefäß mit Seidenbändern, ligieren und transzieren Sie es dann (Abbildung 2E). Halten Sie eine Seidenkrawatte am proximalen Stumpf für zusätzliche Kontrolle.
      HINWEIS: Lauer ist eine rechtwinklige Klemme oder eine Zöliakieklemme, die für die Gewebedissektion verwendet wird.
   7. Sezieren Sie die linke Lungenarterie (PA) und die linken Lungenvenen (PV). Umschließen Sie die Venen zur Kontrolle mit Seidenkrawatten (Abbildung 2F).
      HINWEIS: Die oberen PVs sind sehr klein und werden je nach individueller Anatomie an ihren Verzweigungspunkten oder am gemeinsamen Stamm genäht. Der linke Hauptstammbronchus liegt tief im PA und LA (linker Vorhof), so dass er gelegentlich nicht leicht präpariert werden kann, bis die Arterie und die Venen abgeklemmt und durchtrennt wurden (Abbildung 2G).
   8. Verabreichen Sie 5000 Einheiten Heparin IV 5 Minuten vor dem Einklemmen der PA.
      HINWEIS: Heparin 5000 Einheiten i.v. wird ebenfalls 5 Minuten vor dem Lösen der PA verabreicht. Für jede weitere Stunde werden 1000 Einheiten IV-Heparin verabreicht.
   9. Klemmen Sie die PA (DeBakey-Kreuzklemme), die linke untere Pulmonalvene (Satinsky-Klemme) und den linken Bronchus (Spoon-Potts-Klemme) einzeln ab (siehe Materialtabelle). Verringern Sie das Tidalvolumen auf 5 ml/kg, sobald der linke Bronchus abgeklemmt ist.
   10. Durchtrennen Sie die PA, die linke Vena pulmonalis inferior und den linken Bronchus. Lassen Sie mindestens 0,5 cm Taschentuchmanschette zum Nähen bereit. Durchtrennen Sie das linke untere Lungenband und entfernen Sie den linken Lungenflügel.
       HINWEIS: Die linke Lunge kann verworfen oder für die Kontrollhistologie aufbewahrt werden.

4. Beendigung des ESLP, Teilung der linken Lunge und Spülung mit Elektrolytlösung

1. Klemmen Sie den Beatmungsschlauch bei maximaler Inspiration ein, beenden Sie Perfusion und Beatmung und trennen Sie die Lunge vom ESLP-Gerät.
2. Wiegen Sie die Lunge, um das Ausmaß der Ödembildung zu bestimmen.
   HINWEIS: Ödeme sind Gewebeschwellungen aufgrund der Ansammlung überschüssiger Flüssigkeit.
3. Entnehmen Sie eine Gewebebiopsie des akzessorischen Lappens, teilen Sie ihn in drei gleiche Stücke und legen Sie jeweils ein Stück in das Gel: Gel mit optimaler Schnitttemperatur (OCT), Formalin und Schockfrost in flüssigem Stickstoff.
   HINWEIS: Dieser Schritt wird in der Regel im Labor des Autors ausgeführt. Die Proben werden dann für zukünftige Analysen aufbewahrt: OCT- und schockgefrorene Proben werden in einem Gefrierschrank von -80 °C aufbewahrt, und Formalinproben werden in einem ordnungsgemäß verschlossenen Behälter aufbewahrt und in 4 °C-Kühlschränken gelagert. Einzelheiten zum spezifischen ESLP-Protokoll und zur Gewebeanalyse werden an anderer Stelle veröffentlicht¹⁶.
4. Trennen Sie die linke Spenderlunge von der rechten Lunge. Lassen Sie 1 cm Spender-PA, 1 cm Spenderbronchus und eine geeignete Spender-LA-Manschette (~0,5 cm im Umfang) an den Empfänger-LA nähen (Abbildung 2H). Lassen Sie den linken inferioren PV und die linken oberen PVs in Kontinuität mit der Spender-LA-Wand, um spätere Anastomosen zu erleichtern.
5. Wiegen Sie den linken Lungenflügel.
6. Kanülieren Sie die linke PA des Spenders mit einem Tropfensauger, der an eine Infusionsleitung angeschlossen ist, und spülen Sie 500 ml extrazelluläre, kaliumarme Elektrolytkonservierungslösung auf Dextranbasis durch das Lungengefäßsystem. Befestigen Sie die Kanüle während der Spülung mit einem Seidenband in der PA und lassen Sie sie los, wenn die Spülung abgeschlossen ist.
   HINWEIS: Die genannten Schritte beziehen sich auf das spezifische ESLP-Gerät, das für diese Arbeit verwendet wird, und sind möglicherweise nicht direkt auf andere Geräte anwendbar.

5. Transplantation der linken Lunge

1. Führen Sie die Spenderlunge in die Brust des Empfängers ein, beginnend mit dem unteren Lappen. Zwingen Sie die Lunge nicht in Position.
   HINWEIS: Der untere Brustkorb muss möglicherweise nach oben angehoben werden, um die Spenderlunge aufzunehmen, indem der Brustbein-Retraktor angezogen wird. Im Idealfall ist der Empfänger ein paar Kilogramm größer als der Spender, um eine Größenanpassung zu ermöglichen.
2. Die Bronchialanastomose wird zunächst mit 4-0 Prolen auf einer TF-Nadel durchgeführt (Abbildung 2I).
   HINWEIS: Eine laufende End-to-End-Anastomose funktioniert gut. Schneiden Sie vor dem Nähen überschüssige Länge von den beiden Anastomosenenden ab, um ein Abknicken durch überflüssiges Gewebe zu vermeiden.
3. Führen Sie die LA-Anastomose als zweite mit 6-0 Prolen auf BV-1-Nadeln mit einer laufenden End-to-End-Anastomose durch. Schneiden Sie auch hier überschüssiges Gewebe ab, um ein Abknicken zu vermeiden.
   HINWEIS: Der LA ist brüchig und profitiert von der kleinen BV-1-Nadel. Horizontale Bisse am Spender können erforderlich sein, um ausreichendes Gewebe zu erwerben und die Größenabweichung zu korrigieren, die durch das Nähen des Spender-IPV und SPV an der IPV/LA-Öffnung des Empfängers verursacht wird.
4. Die Spender-SPVs werden in die inferiore PV- und LA-Anastomose integriert, um eine venöse Drainage des linken oberen Lungenlappens zu ermöglichen (Abbildung 2J).
   HINWEIS: Die verzweigten oberen Pulmonalvenen (SPVs) haben einen Durchmesser von weniger als 0,5 cm. Der gemeinsame SPV-Trunk ist unterschiedlich lang und nicht routinemäßig vorhanden, was eine direkte Anastomose zwischen Spender- und Empfänger-SPVs zu einer schlechten Option macht.
5. Beenden Sie die PA-Anastomose mit 6-0 Prolen auf BV-1-Nadeln mit einer laufenden End-to-End-Anastomose. Schneiden Sie auch hier überschüssiges Gewebe ab, um ein Abknicken zu vermeiden.
6. Entfernen Sie die Bronchialklemme und erhöhen Sie die TVs auf 10 ml/kg.
7. Bestätigen Sie die Heparinisierung, verabreichen Sie eine Kaliumverschiebung (40 mg Furosemid, 10 Einheiten Insulin, 100 ml 25%ige Dextroselösung), öffnen Sie die PA-Klemme teilweise, entlüften Sie und binden Sie die PA-Naht ab. Lösen Sie die PA-Klemme nach 10 min vollständig.
8. In der Zwischenzeit entlüften Sie das LA, binden die Nähte ab und entfernen die LA-Klemme.
9. Entnehmen Sie eine Reperfusionsblutgasentnahme aus der Mittellinie und eine Reperfusionsgewebebiopsie aus dem linken Mittellappen.
   HINWEIS: Um eine Gewebebiopsie zu entnehmen, verwenden Sie eine Seidenkrawatte der Größe 0, um einen 1 cm großen Teil der Mittellappenspitze zu umschließen, binden Sie ihn fest, um das Gewebe zu umgarnen, und schneiden Sie dann den isolierten Teil mit einer Metzenbaum-Schere ab. Teilen Sie die Biopsie in drei gleiche Teile auf und gehen Sie wie zuvor beschrieben vor.
10. Führen Sie eine Bronchoskopie der linken und rechten Lunge durch, um die Bronchialanastomose zu beurteilen und Sekret abzusaugen. Führen Sie ein Bronchoskop mit einem Adapteranschluss in den Endotrachealtubus ein.
    1. Schließen Sie das Oszilloskop an die Absaugung an. Schieben Sie das Bronchoskop in den linken Bronchus vor. Untersuchen Sie die Bronchialanastomose (Abbildung 2N). Schieben Sie das Endoskop an den Bronchiolen entlang und saugen Sie die Flüssigkeit ab. Wiederholen Sie den Vorgang auf der rechten Seite.
       HINWEIS: Achten Sie darauf, dass die Sauerstoffsättigung nicht unter 90 % fällt. Wenn die Sättigung unter diesen Wert fällt, entfernen Sie das Oszilloskop und lassen Sie den Schweine einige Minuten ununterbrochen lüften, um sich zu erholen.
11. Legen Sie einen formbaren Thoraxschlauch mit 20 Fr ein (Abbildung 2L), schließen Sie die Thorakotomie in drei Schichten (Abbildung 2M) und legen Sie das Schwein in Bauchlage, sobald die arteriellen Blutgase (ABGs) stabil sind (Abbildung 2O).
12. Überwachen Sie das Schwein über 4 h in Bauchlage. Führen Sie alle 30 Minuten eine ABG-Analyse durch. Verabreichen Sie stündlich 1000 Einheiten Heparin nach der Reperfusion.
    1. Entnehmen Sie stündlich eine 10-ml-Blutprobe für die Zentrifugation und die ELISA-Analyse (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) von Entzündungsmarkern¹⁶.
       HINWEIS: Die Zentrifugationsparameter werden später näher erläutert.

6. Beurteilung der isolierten linken Lunge

1. Positionieren Sie das Schwein in Rückenlage und bereiten Sie das Brustbein mit Povidon-Jod-Vorbereitungslösung erneut vor. Führen Sie eine Mittellinien-Sternotomie zur abschließenden Beurteilung der isolierten linken Lunge durch (Abbildung 2P).
2. Öffnen Sie das linke Pleura mit einer Metzenbaum-Schere und entnehmen Sie eine Gewebebiopsie aus dem linken Unterlappen, wie zuvor beschrieben (HINWEIS zu Schritt 5.9).
3. Öffnen Sie das akzessorische Pleura und präparieren Sie die Vena communis mit einer Metzenbaum-Schere.
   HINWEIS: Diese wird später geklemmt.
4. Entnehmen Sie eine Blutprobe aus der LA-Anastomose mit einer 21-G-Nadel. Richten Sie die Nadel in Richtung der linken Lungenvenen und weg vom gemeinsamen linken Vorhof oder akzessorischen Lappenstamm.
5. Öffnen Sie das rechte Pleura, um Platz für die rechten Hilarklemmen zu schaffen (siehe Materialtabelle). Präparieren Sie das rechte untere Lungenband bis zum Hilum. Stellen Sie sicher, dass eine Klemme um das Hilum nach oben, unten und anterior gelegt werden kann.
   HINWEIS: Dadurch wird sichergestellt, dass das Hilum verschlossen ist und die gesamte Sauerstoffversorgung vom linken Lungenflügel abhängt. Die rechte Lunge wird zu diesem Zeitpunkt nicht beatmet, was sich durch ein fehlendes Aufblasen/Entleeren bei Beatmungsatmung bemerkbar machen sollte. Dazu kann der rechte Unterlappen aus der Brust gehoben werden.
6. Klemmen Sie die akzessorische Lappenvene mit einer DeBakey-Aortenkreuzklemme (siehe Materialtabelle), um eine akzessorische Lappendrainage in den LA zu verschließen (Abbildung 2Q).
7. Klemmen Sie das rechte Hilium und entnehmen Sie die folgenden Blutproben aus der linken PV-Anastomose mit einer 21-G-Nadel, die auf die linke Lunge gerichtet ist: 0 min, 1 min, 2 min, 5 min und 10 min nach dem Abklemmen.
   HINWEIS: Es werden fünf Proben entnommen, um einen Trend des Sauerstoffpartialdrucks (PaO₂) zu überwachen (Abbildung 2R). Der PaO₂ sollte relativ stabil bleiben, um eine ordnungsgemäße Funktion der linken Lunge darzustellen. Fünf Proben bieten auch die Gewähr für eine Qualitätsbewertung, wenn es ein Problem mit der Gerinnung von Proben oder ein Problem mit der ABG-Analyse gibt.
8. Durchtrennen Sie die Anastomosen und entfernen Sie den linken Lungenflügel. Durchqueren Sie die IVC, um die Euthanasie unter Narkose durch Ausblutung zu beschleunigen.
   HINWEIS: Die Gesamtanästhesiezeit für das Empfängerschwein beträgt 8 Stunden.
9. Wiegen Sie die Spenderlunge, um die Bildung von Ödemen zu beurteilen, und untersuchen Sie sie auf das Gesamterscheinungsbild. Untersuchen Sie die PA, die Bronchus und die LA-Manschette auf Anzeichen von Blutgerinnseln oder anderen Pathologien in der Spenderlunge und dem Mediastinum des Empfängers.
10. Führen Sie die abschließenden Gasanalysen durch, zentrifugieren Sie die Perfusatproben und lagern Sie die Gewebebiopsien wie zuvor beschrieben (ANMERKUNG zu Schritt 4.3).
    HINWEIS: Die Zentrifugationseinstellungen sind: 112 x g, 9 Beschleunigung, 9 Verzögerung, 4 °C und 15 Minuten Dauer.

Ergebnisse

Alle Ergebnisse beziehen sich auf eine 4-stündige Reperfusion nach 12 stündiger NPV-ESLP¹⁶. Während der Lungenexplantation sind mehrere klinische Ergebnisse zu erwarten (Abbildung 3). In der Regel bleibt das Schwein nach einer erfolgreichen Explantation der linken Lunge hämodynamisch stabil, kann aber aufgrund einer gefäßerweiternden Reaktion auf die Operation eine niedrig dosierte Infusion von Phenylephrin (Dosisbereich: 2-10 mg/h) benötigen. Die Herzfrequenz ...

Diskussion

Dieses Protokoll umfasst mehrere kritische chirurgische Schritte, und eine Fehlerbehebung ist erforderlich, um eine erfolgreiche Transplantation und Lungenbeurteilung zu gewährleisten. Juvenile Schweinelungen sind im Vergleich zu erwachsenen menschlichen Lungen unglaublich empfindlich, so dass der operierende Chirurg beim Umgang mit Schweinelungen vorsichtig sein muss. Dies gilt insbesondere nach einem 12-stündigen ESLP-Lauf, da das Organ Flüssigkeitsvolumen angenommen hat und anfällig für Verletzungen durch überm?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABL 800 FLEX Blood Gas Analyzer	Radiometer	989-963
Adult-Pediatric Electrostatic Filter HME - Small	Covidien	352/5877
Allison Lung Retractor	Pilling	341679
Arterial Filter	SORIN GROUP	01706/03
Backhaus Towel Clamp	Pilling	454300
Bovine Serum Albumin	MP biomedicals	218057791
Biomedicus Pump	Maquet	BPX-80
Bronchoscope
Cable Ties – White 12”	HUASU International	HS4830001
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C69-500G
Cooley Sternal Retractor	Pilling	341162
CUSHING Gutschdressing Forceps	Pilling	466200
Debakey-Metzenbaum Dissecting	Pilling	342202
Scissors	Pilling	342202
DeBakey Peripheral Vascular Clamp	Pilling	353535
Debakey Straight Vascular Tissue Forceps	Pilling	351808
D-glucose	Sigma-Aldrich	G5767-500G
Drop sucker
Endotracheal Tube 9.0mm CUFD	Mallinckrodt	9590E
Flow Transducer	BIO-PROBE	TX 40
Infusion Pump	Baxter	AS50
Inspire 7 M Hollow Fiber Membrane Oxygenator	SORIN GROUP	K190690
Intercept Tubing Connector 3/8" x 1/2"	Medtronic	6013
Intercept Tubing 1/4" x 1/16" x 8'	Medtronic	3108
Intercept Tubing 3/8" x 3/32" x 6'	Medtronic	3506
Laryngoscope	N/A	N/A	Custom-made with 10-inch blade
Metzenbaum Dissecting Scissors	Pilling	460420
Medical Carbon Dioxide Tank	Praxair	5823115
Medical Oxygen Tank	Praxair	2014408
Medical Nitrogen Tank	Praxair	NI M-K
Mosquito Clamp	Pilling	181816
Harken Auricle Clamp
Organ Chamber	Tevosol
PlasmaLyte A	Baxter	TB2544
Poole Suction Tube	Pilling	162212
Potassium Phosphate	Fischer Scientific	P285-500G
PERFADEX Plus	XVIVO	19811
Satinsky Clamp	Pilling	354002
Scale	TANITA	KD4063611
Silicon Support Membrane	Tevosol
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519-1KG
Sodium Chloride 0.9%	Baxter	JB1324
Sorin XTRA Cell Saver	SORIN GROUP	75221
Sternal Saw	Stryker	6207
Surgical Electrocautery Device	Kls Martin	ME411
TruWave Pressure Transducer	Edwards	VSYPX272
Two-Lumen Central Venous Catheter 7fr X2	Arrowg+ard	CS-12702-E
Vorse Tubing Clamp	Pilling	351377
Willauer-Deaver Retractor	Pilling	341720
Yankauer Suction Tube	Pilling	162300
0 ETHIBOND Green 1X36" Endo Loop 0	ETHICON	D8573
0 PDS II CP-1 2x27”	ETHICON	Z467H
1 VICRYL MO-4 1x18”	ETHICON	J702D
2-0 SILK Black 12" x 18" Strands	ETHICON	SA77G
4-0 PROLENE Blue TF 1x24”	ETHICON	8204H
6-0 PROLENE Blue BV 2x30”	ETHICON	M8776
21-Gauge Needle