ESLP幼猪模型中的左肺原位移植

摘要

该协议描述了设计用于ESLP研究的原位左肺同种异体移植的幼猪模型。重点是麻醉和手术技术，以及关键步骤和故障排除。

摘要

肺移植是终末期肺病的金标准治疗方法，全世界每年进行超过 4,600 例肺移植手术。然而，肺移植受到可用供体器官短缺的限制。因此，候补名单的死亡率很高。在一些中心， 非原位 肺灌注 （ESLP） 使供体肺利用率提高了 15%-20%。ESLP 已被应用为评估和修复边缘供体肺的一种方法，并已证明移植扩展标准供体 （ECD） 肺后可接受的短期和长期结果。需要大型动物（体内）移植模型来验证正在进行的 体外 研究结果。人类和猪之间的解剖学和生理学差异带来了重大的技术和麻醉挑战。易于复制的移植模型将允许对当前的ESLP策略进行体内验证，并对旨在改善供体肺功能的各种干预措施进行临床前评估。该方案描述了原位左肺同种异体移植的猪模型。这包括麻醉和手术技术、定制的手术清单、故障排除、修改以及该方法的优点和局限性。

引言

肺移植是终末期肺病的首要长期治疗方法。全世界每年进行超过 4,600 例肺移植^{手术 1}.然而，肺移植目前有很大的局限性。首先，器官的必要性继续使可用的捐赠者黯然失色。尽管自 2012 年以来，由于更多移植候选者被列入名单、供体数量增加以及恢复器官使用得到改善的综合影响，肺移植率每年都在上升，但移植候补名单的死亡率并未显着下降².器官质量问题是另一个主要限制，据报道器官利用率低至 20%^-30%^3,4,5。最后，肺移植术后结局的趋势不尽如人意，长期移植和患者结局仍落后于其他实体器官移植².

一种新兴技术，即非原位肺灌注（ESLP），有可能减轻这些局限性。ESLP 已越来越多地被用作评估和修复边缘供体肺的方法，并且已证明移植扩展标准供体 （ECD） 肺⁶、⁷、⁸、^9、10 后可接受的短期和长期结果。因此，ESLP 将一些中心的利用率提高了 15%-20%⁶、⁷、⁸、⁹、^10、11。

适当的ESLP研究需要对体外研究结果进行体内验证;然而，关于 ESLP¹²、^13、14、15 的猪肺移植模型的文献有限。此外，现有文献提供的关于约克郡猪肺移植麻醉管理的细节不足，肺移植的血流动力学可能非常不稳定^12,13,14,15。建立一个易于重复的模型将允许对当前的ESLP策略进行体内验证，并对各种干预措施进行临床前评估，以减少肺缺血再灌注损伤。本研究的目的是描述用于 ESLP 的原位左肺同种异体移植的猪模型。该方案包括麻醉剂和手术技术的描述、自定义手术清单以及有关故障排除体验和方案修改的详细信息。本文还讨论了左肺猪移植模型的局限性和益处。本手稿没有概述35-50公斤约克郡猪猪肺的检索过程，也没有涵盖ESLP的建立和终止。该协议专门针对受体移植手术。

研究方案

所有程序均按照加拿大动物护理委员会的指导方针和实验动物的护理和使用指南进行。这些协议得到了阿尔伯塔大学机构动物护理委员会的批准。该方案已应用于35-50公斤的雌性幼年约克郡猪。猪是无病原体的食品级标本。它们是从加拿大艾伯塔省埃德蒙顿的猪研究和技术中心购买的（https://srtc.ualberta.ca）。所有参与ESLP程序的人都接受了适当的生物安全培训。

1.术前准备和麻醉

注意:猪在手术前禁食过夜，最长持续时间为12小时。

1. 肌内注射氯胺酮 （20 mg/kg） 和阿托品 （0.05 mg/kg） 作为手术室受孕猪的术前用药。
2. 将猪仰卧在加热的手术台上以保持体温正常，然后进行面罩诱导。
3. 根据动物体重和麻醉系统滴定氧气流速。
   注意:氧气流量应为 20-40 mL/kg。
4. 以4%-5%施用异氟醚，1-2分钟后降至3%。
5. 评估麻醉深度，确保猪对有害刺激没有戒断反射。每 5 分钟重复一次。
   注意:如果存在疼痛反应，则增加异氟醚给药的百分比，直到达到适当的麻醉深度。有关氯胺酮和氢吗啡酮维持镇痛的更多详细信息，请参阅本节的第 10 步。不使用麻痹剂。这允许评估戒断反射。捏鼻子被用作有害刺激。
6. 一旦确认了正确的麻醉深度，就给猪插管。对于40-50公斤的猪，使用定制的10英寸扁平喉镜和9号或10号气管插管。
7. 将脉搏血氧仪探头放在舌头（首选）或耳朵上，并将血氧饱和度定在 90% 以上。
   注意: 通过鼻探头监测温度。加热垫用于维持正常体温。
8. 为了维持麻醉，调整氧气流量（20-40 mL/kg）和吸入气体速率（1%-3%）。
9. 将呼吸机设置保持在 12-30 次呼吸/分钟、6-10 mL/kg 的 TV、5 cm H₂O 的 PEEP 和 20 cm H₂O 的峰值压力。
   注意: 标准 ICU 型正压呼吸机用于创建用于麻醉和通气的封闭系统。以 15 分钟的间隔连续监测和记录生命体征。每 15-60 分钟抽取一次 ABG，具体取决于动物的稳定性。虽然 TV 的目标值高达 10 mL/kg，但可以达到 6-8 mL/kg。 图 1 提供了实验室中应用的移植方案的负压通气 （NPV）-ESLP 的示意图。
10. 剃须，清洗并使用聚维酮碘无菌制备切口部位。
    注意:在氯胺酮/阿托品镇静后，镇痛方案包括每 1 小时静脉注射 3mg/kg 氯胺酮（范围 1-3 mg/kg，取决于患者参数）和氢吗啡酮 0.05 mg/kg 肌内注射 2 小时通过外周插入的静脉输液管在耳静脉中。两次给药之间任何较长的持续时间都会导致突破性疼痛反应，例如心率加快和呼吸模式/腹部肌肉运动异常。

2. 插入中心静脉和动脉管路

1. 插入中心静脉输液和肝素给药中心线。
   注:总静脉输液计算为 1 mL/kg/h，并给予液体推注 PRN 以维持 MAP >60 mmHg。中心静脉导管也用于使用类固醇、抗生素、血管加压药和正性肌力药物。有关线路定位，请参见 图2A 。
   1. 使用聚维酮碘制备溶液准备皮肤并使其完全干燥。使用电烙术在气管中心做一个 5-8 cm 的中线切口，并从胸骨切迹向颅内延伸。
   2. 使用烧灼法将皮肤和皮下脂肪分开。
   3. 分割束带肌之间的中线平面，然后划分结缔组织层，以识别气管外侧的左侧或右侧颈动脉血管内束。
   4. 使用丝带（2-0 号）作为血管环获得颈静脉的近端和远端控制。
   5. 系好颅骨环绕系带，并在近端系带上向上缩回以控制血流。
   6. 使用 Metzenbaum 剪刀在静脉上做一个小切口（参见 材料表），以容纳双端口、7 Fr 中心线（~血管周长的 ~1/3）。
   7. 同时，释放近端血管环上的张力，插管静脉，然后系紧以将插管固定在静脉中 10 厘米的深度。
   8. 用肝素冲洗管路，连接到0.9%生理盐水的静脉输液管路，如果猪因脱水而血管内耗尽，则给予液体。
      注意:肝素会锁定任何未使用的端口。
   9. 给予 500 mg 甲泼尼松和 1 g 头孢唑林静脉注射。
2. 按照相同的技术，使用 7 Fr 动脉管对颈总动脉进行插管，以实现准确的血压管理。

3.左肺摘取

1. 将猪置于右侧卧位。
2. 进行左前外侧开胸手术（图2）。
   1. 使用聚维酮碘制备溶液准备皮肤并使其完全干燥。使用以下标志标记开胸切口（20 cm）:使用触诊识别左肩胛骨的尖端;同样，通过触诊识别胸骨下方的剑突。如图 2B 所示连接两者。
   2. 将总共 10 mL 的 0.25% 布比卡因注射到切口线和切口上方和下方的两个肋骨空间中。
   3. 使用电烙术解剖皮肤、皮下层和肌肉层。背阔肌必须分开。识别切口正下方的肋骨，并在肋骨顶部烧灼以暴露肋间肌肉，同时避开肋间神经血管束。
   4. 使用蚊子止血器刺穿肋骨正上方的肋间肌肉，然后用手指感觉胸部内部是否有粘连。使用Yankauer抽吸或手指（见 材料表）将肺推开，同时沿肋骨的顶部边缘烧灼以延长开胸手术。
      1. 向前延伸开胸手术，直到距离胸骨 1 英寸。将开胸手术向后延伸至椎旁肌肉。
   5. 插入Cooley胸骨牵开器（参见 材料表）以打开开胸手术（10cm）（图2C）。缩回肺以暴露左半合子静脉（图2D）。
   6. 使用Metzenbaum剪刀和精细的Lauer进行周向解剖左半合子静脉。用丝带缠绕容器，然后将其结扎并横断（图2E）。在近端残端系上一条丝绸领带，以增加控制力。
      注意:劳尔是用于组织解剖的直角夹或乳糜泻夹。
   7. 解剖左肺动脉 （PA） 和左肺静脉 （PV）。用丝带环绕静脉进行控制（图2F）。
      注意:上 PV 非常小，并且根据个体解剖结构在其分支点或共同躯干处缝合结扎。左主支气管深至PA和LA（左心房），因此有时，在动脉和静脉被夹住并横断之前，它不能轻易解剖（图2G）。
   8. 在钳制PA前5分钟施用5000单位肝素IV。
      注意:肝素5000单位IV也在松开PA前5分钟施用。之后每一小时，施用1000单位静脉注射肝素。
   9. 分别夹紧 PA（DeBakey 交叉夹）、左下肺静脉（Satinsky 夹）和左支气管（Spoon Potts 夹）（参见 材料表）。左支气管夹紧后，将潮气量降至 5 mL/kg。
   10. 横切 PA、左下肺静脉和左支气管。留出至少 0.5 厘米的纸巾袖带进行缝制。分割左下肺韧带，切除左肺。
       注意:左肺可以丢弃或保留用于控制组织学。

4.终止ESLP，左肺分裂，用电解质溶液冲洗

1. 在最大吸气时夹紧通气管，终止灌注和通气，并断开肺与 ESLP 装置的连接。
2. 称量肺部以确定水肿形成的量。
   注意:水肿是由于过多液体积聚而导致的组织肿胀。
3. 对副肺叶进行组织活检，将其分成三等份，然后将一块放入以下各一块中:最佳切割温度 （OCT） 凝胶、福尔马林和在液氮中快速冷冻。
   注意:此步骤通常在作者的实验室中执行。然后将样品储存以备将来分析:将OCT和速冻样品保存在-80°C冰箱中，将福尔马林储存的样品置于适当密封的容器中并储存在4°C冰箱中。具体ESLP方案和组织分析详见其他专题¹⁶。
4. 将左供体肺与右肺分开。留下 1 cm 的供体 PA、1 cm 的供体支气管和足够的供体 LA 袖带（周向 ~0.5 cm）缝合到受体 LA（图 2H）。使左侧下部 PV 和左侧上部 PV 与供体 LA 壁保持连续性，以促进以后的吻合。
5. 称量左肺。
6. 使用连接到静脉输液管的滴吸器对供体左侧 PA 进行插管，并通过肺脉管系统冲洗 500 mL 细胞外、低钾、葡聚糖基电解质保存溶液。冲洗过程中用丝带将套管固定在 PA 中，并在冲洗完成后松开。
   注意:上述步骤与用于此工作的特定 ESLP 设备有关，可能不直接适用于其他设备。

5.左肺移植

1. 将供体肺插入受体的胸部，从下叶开始。不要强行将肺固定到位。
   注意:可能需要通过扭转胸骨牵开器来向上抬起下胸腔以容纳供体肺。理想情况下，接受者比供体大几公斤，以促进尺寸匹配。
2. 首先在TF针上使用4-0 prolene进行支气管吻合术（图2I）。
   注意:运行的端到端吻合效果很好。缝纫前修剪两个吻合口端的多余长度，以避免多余组织引起的扭结。
3. 使用运行的端到端吻合术，在 BV-1 针头上用 6-0 prolene 进行 LA 吻合术。再次，修剪多余的组织以避免扭结。
   注意:LA 易碎，受益于小 BV-1 针头。可能需要对供体进行水平咬合，以购买足够的组织并纠正因将供体 IPV 和 SPV 缝合到受体 IPV/LA 开口而导致的大小不匹配。
4. 将供体SPV合并到下PV和LA吻合口中，以允许左上肺叶静脉引流（图2J）。
   注意:分支上肺静脉 （SPV） 直径小于 0.5 厘米。常见的 SPV 躯干长度不一，并且不常规存在，因此供体和受体 SPV 之间的直接吻合是一个糟糕的选择。
5. 使用运行的端到端吻合术，在 BV-1 针头上用 6-0 prolene 完成 PA 吻合术。再次，修剪多余的组织以避免扭结。
6. 取下支气管钳夹并增加 TV，目标值为 10 mL/kg。
7. 确认肝素化，给予钾转移（40 mg 呋塞米、10 单位胰岛素、100 mL 25% 葡萄糖溶液）、部分打开 PA 钳夹、脱气并系扎 PA 缝合线。完全松开 PA clamp 10 分钟后。
8. 同时，对 LA 进行脱气，系好缝合线，然后取下 LA 夹。
9. 从中心静脉输血气，从左中叶再灌注组织活检。
   注意:要进行组织活检，请使用 0 号丝带环绕中叶顶点的 1 厘米部分，系扎以诱捕组织，然后用 Metzenbaum 剪刀剪断隔离部分。将活检分成三等份，并如前所述进行管理。
10. 进行左肺和右肺支气管镜检查，以评估支气管吻合和抽吸分泌物。使用适配器连接将支气管镜插入气管插管。
    1. 将示波器连接到吸力。将支气管镜推进到左支气管中。检查支气管吻合口（图2N）。将内窥镜向下推进细支气管并吸出任何液体。在右侧重复。
       注意: 不要让血氧饱和度低于 90%。如果饱和度低于此水平，请取下内窥镜并让清管器不间断通风几分钟以恢复。
11. 插入20 Fr可延展胸管（图2L），将开胸手术分成三层（图2M），并在动脉血气（ABG）稳定后立即使猪俯卧（图2O）。
12. 在俯卧位监测猪4小时以上。每 30 分钟进行一次 ABG 分析。再灌注后每小时给予 1000 单位肝素。
    1. 每小时取 10 mL 血样进行离心和炎症标志物的酶联免疫吸附测定 （ELISA） 分析¹⁶。
       注意:离心参数将在后面详细介绍。

6. 孤立性左肺评估

1. 将猪仰卧放置，并使用聚维酮碘制备溶液重新制备胸骨。进行中线胸骨切开术以进行最终的离体左肺评估（图2P）。
2. 如前所述，使用Metzenbaum剪刀打开左胸膜，并从左下叶进行组织活检（注意步骤5.9）。
3. 打开副肺叶胸膜，用 Metzenbaum 剪刀解剖总静脉。
   注意:稍后将夹紧。
4. 使用 21 G 针头从 LA 吻合口采集血样。将针头引向左肺静脉，远离左心房或副肺叶干。
5. 打开右胸膜，为右肺门夹腾出空间（参见 材料表）。解剖右下肺韧带直至肺门。确保可以在肺门上部、下部和前部周围放置一个夹子。
   注意:这确保了肺门被闭塞，并且所有氧合都依赖于左肺。此时右肺不会通气，这应该通过呼吸机呼吸缺乏充气/放气来明显。右下叶可以从胸部抬起以完成此操作。
6. 使用DeBakey主动脉交叉钳夹（参见 材料表）夹紧副叶静脉，以阻塞任何进入LA的副叶引流（图2Q）。
7. 夹紧右肺门，并用指向左肺的21G针从左侧PV吻合口处采集以下连续血样:夹紧后0分钟，1分钟，2分钟，5分钟和10分钟。
   注:取五个样品以监测氧分压（PaO₂）的任何趋势（图2R）。PaO₂ 应保持相对稳定，以代表正常的左肺功能。如果任何样品出现凝血问题或动脉血气分析出现问题，五个样品还可以为质量评估提供保险。
8. 横切吻合口，切除左肺。横断 IVC，通过放血加速麻醉下的安乐死。
   注意:受体猪的总麻醉时间为8小时。
9. 称量供体肺以评估水肿的形成，并检查其整体外观。检查 PA、支气管和 LA 袖带，在供体肺和受体纵隔内是否有血栓或其他病变体征。
10. 运行最终的气体分析，离心灌注液样品，并如前所述储存组织活检（步骤4.3的注释）。
    注意:离心设置为:112 x g，9 次加速，9 次减速，4 °C 和 15 分钟持续时间。

结果

所有结果均在 NPV-ESLP^{16 12} 小时后再灌注 4 小时的背景下进行。在肺外植体期间，有几种临床结果需要预期（图3）。通常，猪在左肺移植成功后将保持血流动力学稳定，但由于对手术的血管舒张反应，可能需要低剂量输注去氧肾上腺素（剂量范围:2-10 mg/h）。心率目标应约为 100-120 次/分，SpO 2 > 90% 时呼吸频率 （RR） 为 8-30%，平均动脉压 （MAP） > 60 mmH...

讨论

该协议涉及几个关键的手术步骤，需要进行故障排除以确保移植和肺部评估成功。与成年人的肺相比，幼年猪肺非常脆弱，因此手术外科医生在处理猪肺时必须小心。在进行 12 小时的 ESLP 后尤其如此，因为器官将承担液体量并且容易因过度操作而受伤。任何过大的压力都会导致实验肺不张或创伤，从而影响评估结果。同样，幼猪的血管结构非常脆弱。避免 PA 夹扭转至关重要，因为这会导致组织?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABL 800 FLEX Blood Gas Analyzer	Radiometer	989-963
Adult-Pediatric Electrostatic Filter HME - Small	Covidien	352/5877
Allison Lung Retractor	Pilling	341679
Arterial Filter	SORIN GROUP	01706/03
Backhaus Towel Clamp	Pilling	454300
Bovine Serum Albumin	MP biomedicals	218057791
Biomedicus Pump	Maquet	BPX-80
Bronchoscope
Cable Ties – White 12”	HUASU International	HS4830001
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C69-500G
Cooley Sternal Retractor	Pilling	341162
CUSHING Gutschdressing Forceps	Pilling	466200
Debakey-Metzenbaum Dissecting	Pilling	342202
Scissors	Pilling	342202
DeBakey Peripheral Vascular Clamp	Pilling	353535
Debakey Straight Vascular Tissue Forceps	Pilling	351808
D-glucose	Sigma-Aldrich	G5767-500G
Drop sucker
Endotracheal Tube 9.0mm CUFD	Mallinckrodt	9590E
Flow Transducer	BIO-PROBE	TX 40
Infusion Pump	Baxter	AS50
Inspire 7 M Hollow Fiber Membrane Oxygenator	SORIN GROUP	K190690
Intercept Tubing Connector 3/8" x 1/2"	Medtronic	6013
Intercept Tubing 1/4" x 1/16" x 8'	Medtronic	3108
Intercept Tubing 3/8" x 3/32" x 6'	Medtronic	3506
Laryngoscope	N/A	N/A	Custom-made with 10-inch blade
Metzenbaum Dissecting Scissors	Pilling	460420
Medical Carbon Dioxide Tank	Praxair	5823115
Medical Oxygen Tank	Praxair	2014408
Medical Nitrogen Tank	Praxair	NI M-K
Mosquito Clamp	Pilling	181816
Harken Auricle Clamp
Organ Chamber	Tevosol
PlasmaLyte A	Baxter	TB2544
Poole Suction Tube	Pilling	162212
Potassium Phosphate	Fischer Scientific	P285-500G
PERFADEX Plus	XVIVO	19811
Satinsky Clamp	Pilling	354002
Scale	TANITA	KD4063611
Silicon Support Membrane	Tevosol
Sodium Bicarbonate	Sigma-Aldrich	792519-1KG
Sodium Chloride 0.9%	Baxter	JB1324
Sorin XTRA Cell Saver	SORIN GROUP	75221
Sternal Saw	Stryker	6207
Surgical Electrocautery Device	Kls Martin	ME411
TruWave Pressure Transducer	Edwards	VSYPX272
Two-Lumen Central Venous Catheter 7fr X2	Arrowg+ard	CS-12702-E
Vorse Tubing Clamp	Pilling	351377
Willauer-Deaver Retractor	Pilling	341720
Yankauer Suction Tube	Pilling	162300
0 ETHIBOND Green 1X36" Endo Loop 0	ETHICON	D8573
0 PDS II CP-1 2x27”	ETHICON	Z467H
1 VICRYL MO-4 1x18”	ETHICON	J702D
2-0 SILK Black 12" x 18" Strands	ETHICON	SA77G
4-0 PROLENE Blue TF 1x24”	ETHICON	8204H
6-0 PROLENE Blue BV 2x30”	ETHICON	M8776
21-Gauge Needle