Method Article
本プロトコールは、ダウンストリームの全RNAシーケンシング、SONicationによるNuclei Extraction (NEXSON)、およびChIP-seqに最適化されたマウス白色脂肪細胞の単離、精製、およびアップストリームプロセッシングのための普遍的な方法をまとめたものです。
肥満は、遺伝学、エピジェネティクス、環境、およびそれらの相互作用の影響を受ける複雑な病気です。成熟脂肪細胞は、白色脂肪組織の主要な細胞型です。脂肪細胞がどのように機能し、(エピ)遺伝的および環境的シグナルに反応するかを理解することは、肥満の原因を特定するために不可欠です。RNAとクロマチンは、これまで酵素消化法を用いて脂肪細胞から単離されてきました。さらに、核単離のためのプロトコルが開発されており、脂肪細胞特異的トランスジェニックレポーターの蛍光活性化細胞選別(FACS)によって精製が達成されます。このようなプロトコールで高収率と高品質を達成するための最大の課題の1つは、脂肪組織に含まれる大量の脂質です。本プロトコールは、ヘプタンを活用して目的の標的(RNA/クロマチン)から脂質を分離する成熟脂肪細胞を単離するための最適化された手順を説明しています。得られたRNAは高い完全性を持ち、高品質なRNA-seq結果が得られます。同様に、この手順により核の収量が向上し、サンプル間で再現性のあるChIP-seq結果が得られます。したがって、現在の研究は、全ゲノムトランスクリプトームおよびエピゲノム研究に適した信頼性の高い普遍的なマウス脂肪細胞単離プロトコルを提供します。
肥満は、通常、2型糖尿病、心血管代謝疾患、およびいくつかの形態の癌1,2,3のリスクを高める一因となる過剰な脂肪蓄積の病気として理解されています。肥満の現在の理解は遺伝学(ヒトとげっ歯類の両方の研究から)に大きく根ざしていますが、代謝性疾患の素因の約30%〜70%は非遺伝的起源であり、4,5,6,7,8は不明のままです。
脂肪組織は、肥満やその他の代謝性疾患において重要な役割を果たしています9,10。脂肪組織は、成熟脂肪細胞と、前駆脂肪細胞、内皮細胞、免疫細胞などの間質血管画分で構成されています。各細胞型がどのように肥満に寄与し、脂肪細胞の調節不全がどのように肥満に寄与するかは、まだ不明です。成熟脂肪細胞エピゲノム研究のための再現性のある効果的な単離および精製プロトコルは、この分野にとって興味深いものです。
成熟脂肪細胞は、遺伝子発現解析11およびエピゲノム研究12,13のために長い間単離されてきました。脂肪細胞を単離するための2つの主要な戦略があります。1つ目は、酵素消化を使用して、間質血管画分11,14の成熟脂肪細胞を残りの細胞型から分離することです。第2は、脂肪組織を腫瘤化して無傷の核を放出し、次いで蛍光活性化細胞選別(FACS)12,13による蛍光レポーターに基づいて核を回復させることであり、これには特殊なトランスジェニックレポーターモデルが必要である。いずれの場合も技術的な課題は、成熟脂肪細胞が高濃度の脂質を含んでおり(図1)、それが全RNA15,16および核17の品質および/または収量を低下させることです。ここでは、成熟脂肪細胞を単離するための最適化された酵素消化手順が記載されており、ヘプタンの利点は、RNA抽出またはSONication(NEXSON)19による核抽出19による核分離ステップに先立って、脂質18を迅速かつ効率的に溶解および除去することである。このプロトコールは、ゲノムワイド研究のためのトータルRNAの優れた回収率と品質を保証し、再現性のあるChIP-seqのためのインタクト核の収量を大幅に改善します。
すべての動物実験は、施設動物管理および使用委員会(IACUC、プロトコル番号:18-10-028)によって承認されました。12週齢の雄C57BL/6JマウスをCO2 で安楽死させ、精巣上体白脂肪組織(eWAT)から脂肪パッドを採取するために解剖した。
1.脂肪細胞の分離
2. 全RNA抽出
注意: この手順は、化学薬品フードで実行します。
3. ChIP-seqのための脂肪細胞固定
メモ: 手順 3 を実行します。ケミカルフードで。
4. 核抽出とクロマチン剪断
注:この手順は、Arrigoni et al.19から採用されています。
脂肪細胞を6つの脂肪パッドから単離し、ヘプタンベースのRNA抽出を行い(ステップ2)、得られたRNAを自動電気泳動装置で分析しました。すべてのサンプルについて計算されたRNAインテグリティナンバー(RIN)は>8(図3A)であり、高品質で再現性の高いRNA調製物であることを示しています。次に、Total RNA Prep Kitを使用してRNAライブラリを調製し、各サンプルを次世代シーケンサーでシーケンシングして、≥4,000万リードのリード深度に到達しました。すべてのサンプル(図3B)および配列ごと(図3C)のPhredスコアは≥30であり、高品質のDNA配列20を示している。このように、ヘプタン除去は、RNAシーケンシングに適した高収量で高品質なRNAの単離をサポートします。
ホルムアルデヒド固定ステップでは、ヘプタン含有核分離調製物3種とヘプタンを含まないコントロール調製物1種も行いました。次に、せん断されたクロマチンを自動電気泳動装置で分析しました。いずれの場合も、クロマチンは100-800 bpのサイズ範囲まで剪断され(図4A)、下流のChIP-seq手順に理想的でした19。重要なことに、ヘプタン処理したサンプル(11.5 ng/μL、9.42 ng/μL、9.6 ng/μL)は、未処理のサンプル(2.2 ng/μL)と比較して、~5倍多くのクロマチンが得られました。H3K4me3およびH3K27me3 ChIP-seqは、Arrigoni et al.19に従って実施しました。 図4Bに示すように、3つの独立したヘプタン処理サンプルからのシグナルトラックは、両方のヒストンマークについて、ヘプタン未処理サンプルのトラックと同等でした。ヘプタン処理はChIP-seqの品質を妨げませんが、核(およびせん断クロマチン)の収量を大幅に改善します。
図1:単離された脂肪細胞。 単離した脂肪細胞をDAPI(青)で染色して核を染色し、BODIPY(緑)で脂質を染色しました。細胞質脂質液滴は、脂肪細胞の体積の最大95%を占めており、RNAおよびクロマチン抽出中に高い収量を達成するための技術的な課題を提起しています。スケールバー = 100 μm. この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:トランスクリプトームおよびエピゲノム解析のための脂肪細胞単離の概略フロー。 脂肪細胞の単離からトランスクリプトームまたはエピゲノムの適用まで、ワークフロー全体が描かれています。主要な手順と代表的な結果を示します。(A)単離された脂肪細胞は最上層に浮かび、チューブの底でペレットとして間質血管画分から分離します。(B)RNA単離試薬によるRNA抽出前の脂質除去にヘプタンを使用する。(C)脂肪細胞固定中に脂質を除去するためのヘプタンの使用。(D)単離された脂肪細胞核の代表的な画像は、無傷で丸いものでなければなりません。スケールバー = 20 μm。このスキームは BioRender.com で作成されました。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:RNAシーケンス後のRNA完全性と品質スコアの代表的なエレクトロフェログラム (A) サンプル1-6はヘプタン処理脂肪細胞の6回の複製を表し、それらのRNA完全性分析は自動電気泳動装置で実行されました。RNAインテグリティナンバー(RIN)は、18Sおよび28SリボソームRNA比に基づいており、RNAの品質を表しています。1 (大幅に低下している) から 10 (最も劣化が少ない) までスケーリングします。(B,C)シーケンシングリードの品質スコアは、塩基上の平均品質スコア(C)およびシーケンスごとの品質スコアについて、multiQC解析(B)によって決定されました。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:ChIP-seq.のせん断されたクロマチンと濃縮ピークの代表的なエレクトロフェログラム (A) コントロール(サンプル1、左上)とヘプタン処理した脂肪細胞クロマチン調製物(サンプル2、5、8、右上と下2)のクロマチンサイズ分布を示す自動電気泳動装置の代表的なプロファイル。最終調製物中のクロマチン濃度は、各画像の左上に示されています。(B)Integrative Genomics Viewer(IGV)を使用して作成したゲノムブラウザのスクリーンショット。プロットの上部は、ヘプタン処理された3つのサンプル(赤)と1つのコントロール(青)のH3K4me3 ChIP-seqプロファイルを示しています。下のパネルは、H3K27me3のChIP-seqについても同じことを示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
バッファ | 組成 |
消化緩衝液(脂肪パッド3000mg以下/ 20mL用) | 20 mL の Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) |
0.3gの脂肪酸を含まないBSA | |
コラゲナーゼ2型0.1 g | |
ファーナムラボバッファー | 5 mMパイプ(pH 8) |
85 mM KCl | |
0.5%のIGEPAL | |
せん断バッファー | 10 mM Tris-HCl pH 8 |
0.1%のSDS | |
1 mM EDTAの |
表1:本研究で使用したさまざまなバッファーの組成。
ここで提示する脂肪細胞単離プロトコルは、白色脂肪組織の残りの間質血管画分から成熟脂肪細胞(浮遊)を分離するための、広く受け入れられている酵素消化法11,14に基づいている。これは、あらゆるマウスモデルで成熟脂肪細胞を精製するための簡単で普遍的なアプローチを提供します。上述の通り、このプロトコールは、全トランスクリプトームおよびChIP-seq解析のためのダウンストリームでの使用に適しています。これは、同じ個々の脂肪パッドから複数のエピゲノムプロファイル(例えば、いくつかのヒストン修飾とRNA-seq)を生成するのに十分な収量を提供します。
このような一致したエピゲノムデータの調製を可能にする高収率を確保するためには、ヘプタンを使用して、無傷の脂肪細胞やプロセス中に溶解する脂肪細胞から脂質を溶解することが重要です。私たちの経験では、このステップにより、RNAと核が脂質層に失われるのを防ぐことにより、再現性と収量が大幅に向上します。固定中の脂肪細胞を含むチューブの連続回転は、脂肪細胞から脂質が除去される均質性を高めるため、同様に重要です。ChIP-seqの文献の多くで報告されている1%ホルムアルデヒド固定緩衝液の代わりに21,22、過剰固定を避けるためには、濃度を0.7%ホルムアルデヒドに下げる必要があることがわかりました。また、クロマチンの剪断時間も12分に最適化し、ChIP-seqの最適なクロマチンサイズ範囲(100-800 bp)を実現しました。
このプロトコールは、バルクトランスクリプトームおよびエピゲノム研究に最適化されています。現在のプロトコルには、シングルセルトランスクリプトームおよびエピゲノムアプリケーションに対してまだ独自の制限があります。脂肪分野23,24で報告された細胞の不均一性を考慮すると、この単離法は、シングルセルアッセイに適応するためにさらに開発することができる。このような状況では、ホウ素-ジピロメテン(BODIPY)25やペリリピン-1(PLIN1)26、ASC-127、または脂肪細胞特異的核マーカーなどの脂肪細胞制限マーカーは、追加の機能的で関連性のある細胞パラメータの定量を可能にする上で価値がある可能性がある28。ゲノム研究への応用とは別に、このプロトコルは、脂肪細胞の脂質含有量が高いために追加のハードルがある脂肪細胞プロテオミクス研究も改善する可能性があります29。
このプロトコルは、ヒト脂肪細胞の核(データは示されていません)の抽出にも使用でき、その適用をヒト肥満の研究に拡張します。
著者は何も開示していません。
MPI-IEの光学イメージング、シーケンシング、バイオインフォマティクスコア、そして人員の方々にお世話になっています。この研究は、MPG、Van Andel Research Institute、欧州連合のHorizon 2020研究、NIH(R01HG012444およびR21HG011964)、Marie Skłodowska-Curie助成金契約番号675610、およびプロジェクト番号01KU1216(Deutsches Epigenom Programm、DEEP)に基づく連邦教育研究省からの資金提供によって支援されました。
Name | Company | Catalog Number | Comments |
16% Formaldehyde Solution (w/v). Methanol-free | ThermoFisher SCIENTIFIC | 28908 | |
1-bromo-3-chloropropane | SIGMA | B9673 | |
5 M NaCl | invitrogen | AM9759 | |
Automated electrophoresis instrument (2100 Bioanalyzer Instrument) | Agilent Technologies | G2939BA | |
BODIPY | ThermoFisher SCIENTIFIC | D3922 | |
Collagenase Type 2 | Worthington Biochemical Corp. | 43D14184B | |
Complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail (PIC) | Roche | 4693159001 | EDTA free |
DAPI | ThermoFisher SCIENTIFIC | D1306 | |
DMEM (+ GlutaMAX) | life technologies | 61965-026 | |
DNA purification kit (PCR purification kit) | Qiagen | 28104 | |
DNA quantification instrument (Qubit 4 Fluorometer) | Fisher SCIENTIFIC | Q33238 | |
DNA quantification kit (DNA high sensitivity assay) | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
EDTA | Fisher chimical | E478-500 | |
EGTA | Fisher chimical | O2783-100 | |
EtOH | PHARMCO | 111000200 | |
Fatty acid-free BSA | SERVA | 11932.01 | bovine albumin fraction V, fatty acid-free lyophilized |
Glycine | SIGMA | G7126-100G | |
Heptane | SIGMA | H2198-1L | |
High Sensitivity RNA Analysis | Agilent Technologies | 5067-1513 | |
Igepal | SIGMA | 18896-50ML | |
KCl | SIGMA | P3911-25G | |
Matrix filter (420um) | Tisch Scientific | ME17238 | |
Next-Generation Sequencer (HiSeq 3000 Sequencer) | Illumina | ||
Nuclease-free water | Invitrogen | 4387936 | |
PIPES | ACROS organics | 5625-37-6 | |
Proteinase K | ThermoFisher SCIENTIFIC | EO0491 | |
RNA isolation reagent (Trizol) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 15596026 | |
RNase A, DNase-free | ThermoFisher SCIENTIFIC | EN0531 | |
Rotator (Thermo Scientific Tube Revolver Rotator) | ThermoFisher SCIENTIFIC | 88881001 | |
SDS, Sodium dodecyl sulfate | SIGMA | 8170341000 | |
Sonication tube (1 mL milliTUBE with AFA Fiber) | Covaris | 520135 | |
Sonicator (Evolution Focused-ultra-sonicator (S220 or E220)) | Covaris | 500217 or 500239 | |
Total RNA Prep kit ( Illumina Stranded Total RNA Prep kit) | Illumina | 20040525 | |
Tris-HCl | Fisher bioreagents | BP153-500 |
このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します
許可を申請This article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved