Murin Beyaz Adipositlerinin Transkriptom ve Epigenom Analizleri için İzolasyonu ve İşlenmesi

Özet

Mevcut protokol, aşağı akış toplam RNA dizilimi, SONication ile Çekirdek Ekstraksiyonu (NEXSON) ve ChIP-seq için optimize edilmiş murin beyaz adipositlerinin izole edilmesi, saflaştırılması ve yukarı akış işlenmesi için evrensel bir yöntemi özetlemektedir.

Özet

Obezite genetik, epigenetik, çevre ve bunların etkileşimlerinden etkilenen karmaşık bir hastalıktır. Olgun adipositler, beyaz yağ dokusundaki ana hücre tipini temsil eder. Adipositlerin nasıl işlev gördüğünü ve (epi) genetik ve çevresel sinyallere nasıl yanıt verdiğini anlamak, obezitenin neden(ler)ini belirlemek için çok önemlidir. RNA ve kromatin daha önce enzimatik sindirim kullanılarak adipositlerden izole edilmiştir. Ek olarak, adiposit spesifik transgenik raportörlerin floresanla aktive edilen hücre sınıflandırması (FACS) ile saflaştırmanın sağlandığı nükleer izolasyon için protokoller geliştirilmiştir. Bu tür protokoller sırasında yüksek verim ve kalite elde etmenin önündeki en büyük zorluklardan biri, yağ dokusunda bulunan önemli miktarda lipittir. Mevcut protokol, lipitleri ilgilenilen hedeflerden (RNA/kromatin) ayırmak için heptan yararlanan olgun adipositleri izole etmek için optimize edilmiş bir prosedürü tanımlar. Elde edilen RNA, yüksek bütünlüğe sahiptir ve yüksek kaliteli RNA-seq sonuçları üretir. Benzer şekilde, prosedür çekirdek verim oranını iyileştirir ve numuneler arasında tekrarlanabilir ChIP-seq sonuçları üretir. Bu nedenle, mevcut çalışma, tüm genom transkriptom ve epigenom çalışmaları için uygun, güvenilir ve evrensel bir murin adiposit izolasyon protokolü sunmaktadır.

Giriş

Obezite tipik olarak, tip 2 diyabet, kardiyometabolik hastalık ve çeşitli kanser türleri riskinin artmasına katkıda bulunan aşırı yağ birikimi hastalığı olarak anlaşılır ^1,2,3. Mevcut obezite anlayışı büyük ölçüde genetiğe dayansa da (hem insan hem de kemirgen çalışmalarından), metabolik hastalık yatkınlığının yaklaşık %30-70'i köken olarak genetik değildir ^4,5,6,7,8 ve yanlış tanımlanmıştır.

Yağ dokusu obezite ve diğer metabolik hastalıklarda kritik bir rol oynar ^9,10. Yağ dokusu, olgun adipositleri ve preadipositler, endotel hücreleri ve bağışıklık hücreleri dahil olmak üzere stromal vasküler fraksiyonu içerir. Her hücre tipinin obeziteye nasıl katkıda bulunduğu ve adiposit düzensizliğinin obeziteye nasıl katkıda bulunduğu hala belirsizdir. Olgun adiposit epigenom çalışmaları için tekrarlanabilir ve etkili izolasyon ve saflaştırma protokolleri alanın ilgi alanına girmektedir.

Olgun adipositler, gen ekspresyon analizleri¹¹ ve epigenom çalışmaları^12,13 için uzun süredir izole edilmiştir. Adipositleri izole etmek için iki ana strateji vardır. Birincisi, olgun adipositleri stromal vasküler fraksiyondaki^(11,14) diğer hücre tiplerinden ayırmak için enzimatik sindirim kullanmaktır. İkincisi, sağlam çekirdekleri serbest bırakmak için yağ dokusunu ikiye katlamak ve daha sonra floresanla aktive edilen hücre sıralama (FACS)^12,13 ile bir floresan raportöre dayalı olarak çekirdekleri geri kazanmaktır, bu da özel transgenik raportör modelleri gerektirir. Her iki durumdaki teknik zorluk, olgun adipositlerin yüksek konsantrasyonlarda lipit içermesidir (Şekil 1), bu da toplam RNA^15,16 ve çekirdek^17'nin kalitesini ve/veya verimini azaltır. Burada, olgun adipositleri izole etmek için optimize edilmiş bir enzimatik sindirim prosedürü tarif edilmiştir, burada heptanın avantajı, RNA ekstraksiyonundan önce lipitleri¹⁸ veya SONication ile Çekirdek Ekstraksiyonu (NEXSON)¹⁹ ile çekirdek izolasyon adımlarını hızlı ve verimli bir şekilde çözmek ve uzaklaştırmaktır. Protokol, genom çapında çalışmalar için toplam RNA'nın mükemmel bir şekilde geri kazanılmasını ve kalitesini sağlar ve tekrarlanabilir ChIP-seq için bozulmamış çekirdeklerin verimini önemli ölçüde artırır.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), protokol numarası: 18-10-028 tarafından onaylanmıştır. 12 haftalık erkek C57BL / 6J farelerine CO₂ ile ötenazi yapıldı ve epididimal beyaz yağ dokusundan (eWAT) yağ yastıkçıklarını toplamak için diseke edildi.

1. Adiposit izolasyonu

1. Sindirim tamponunu hazırlayın (Tablo 1) ve bir su banyosunda 37 °C'ye ısıtın.
2. Epididimal beyaz yağ dokusundan (eWAT) yağ pedini bir petri kabına koyun. 5 mL DMEM'de forseps ve neşter kullanarak dokuyu küçük parçalar halinde (5 mm x 5 mm) kesin.
   NOT: Hücre yapışma kaplaması içermeyen bir Petri kabı tercih edilir. Hücrelere zarar vermemek için yağ pedini nazikçe tutmak da önemlidir. Yağ dokusu ne kadar çok işlenirse, verim o kadar fazla tehlikeye girer. Adipositlere zarar verebileceği için yağ yastıkçıklarını tek başına makas veya forseps ile kesmek yerine neşter/forseps yöntemi tercih edilir.
3. Doku kalıntılarını rahatsız etmeden fazla DMEM'i boşaltın.
   NOT: Petri kabının yüzeyindeki doku kalıntılarını toplamayın.
4. Petri kabına 5 mL sindirim tamponu ekleyin, tabaktan doku parçalarını serbest bırakmak için döndürün ve tüm içeriği 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne dökün. Tüm doku parçaları santrifüj tüpüne aktarılana kadar işlemi tekrarlayın.
5. Kalan sindirim tamponunu, nihai hacim ~ 20 mL olacak şekilde santrifüj tüpüne ekleyin.
6. Doku parçalarını 37 ° C'lik bir çalkalama su banyosunda 100 rpm'de 20-30 dakika boyunca veya doku parçaları 1 mm x 1 mm'den küçük olana kadar inkübe edin.
7. Santrifüj tüpüne 0,4 mL 0,5 M EDTA ve 0,2 mL 0,5 M EGTA ekleyin ve 37 °C'de 10 dakika çalkalamaya devam edin.
8. Sindirilmemiş dokuyu çıkarmak için hücre süspansiyonunu 10 mL'lik bir pipetle ince matrisli bir filtreden (420 μm, Malzeme Tablosuna bakınız) başka bir 50 mL santrifüj tüpünün üzerine aktarın.
9. Saf adipositleri (üstte yüzen) stromal vasküler fraksiyondan (altta pelet) ayırmak için 50 mL'lik santrifüj tüpünü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin (Şekil 2A).
10. Yüzen adiposit tabakasını 50 mL'lik yeni bir tüpe dökün ve peleti bozmamaya dikkat edin.
    NOT: Yüzen adipositleri aktarmak için pipet uçlarını kullanmaktan kaçının çünkü bunlar pipet ucu duvarına yapışabilir (dolayısıyla verimi azaltır). Bir miktar sindirim tamponu yeni tüpe taşınacaktır; Adiposit tabakasının altından kalan sindirim tamponunu çıkarmak için bir şırınga ve iğne kullanın.
11. Saflaştırılmış adipositleri toplam RNA ekstraksiyonu (adım 2.) ve/veya ChIP-seq (adım 3. ve adım 4.) için hemen kullanın.
    NOT: Kullanıcı, 2. adım için tüm adiposit ekstraktını kullanmaya karar verebilir. veya araştırma amacına bağlı olarak adım 3.. Kullanıcı ayrıca tüm adiposit ekstraktını iki parçaya bölebilir ve 2. adıma devam edebilir. ve adım 3. biyolojik olarak özdeş numunelerden analiz sonuçları elde etmek için paralel olarak.

2. Toplam RNA ekstraksiyonu

NOT: Bu adımı bir kimyasal başlıkta gerçekleştirin.

1. 50 mL santrifüj tüpündeki saflaştırılmış adipositlere RNA izolasyon reaktifi (1 mL) (Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin (adım 1.11.).
2. RNA izolasyon reaktifindeki adipositleri iyice çözmek için 1 mL'lik bir pipet ucu kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyin ve 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
3. Tüpü oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
4. Santrifüj tüpüne 0,5 mL heptan ekleyin ve 30 saniye boyunca tam hızda girdaplayın.
   NOT: Lipitler heptan içinde çözünecektir (Şekil 2B).
5. Tüpü 1,000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
6. Bir şırınga ve 30 G iğne ile RNA izolasyon reaktifinin alt tabakasını alın ve yeni bir 1.5 mL tüpe aktarın.
7. RNA izolasyon reaktifi ekstraktına 0.1 mL 1bromo-3kloropropan ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve 30 saniye boyunca tam hızda girdaplayın. Tüpü oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.
8. Tüpü 12.000 x g'da 4 ° C'de 15 dakika santrifüjleyin. Üst sulu fazı toplamak ve yeni bir tüpe aktarmak için bir pipet kullanın.
9. 0,5 mL izopropanol ekleyin ve 4 °C'de 10 dakika inkübe edin. Tüpü 12.000 x g'da 4 ° C'de 10 dakika santrifüjleyin.
   NOT: RNA, tüpün dibinde bir pelet olarak çökeltilecektir.
10. Süpernatanı çıkarmak için bir pipet kullanın, pelete dokunmamaya dikkat edin.
11. 1 mL %75 EtOH ekleyin ve kısa bir süre tam hızda girdaplayın.
12. Tüpü 7.500 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı bir pipet ucuyla dikkatlice çıkarın. Peletleri rahatsız etmeyin.
13. Peletleri oda sıcaklığında 10 dakika veya pelet berrak/şeffaf hale gelene kadar havayla kurutun.
14. Peletleri 50 μL nükleaz içermeyen suda çözün.

3. ChIP-seq için adiposit fiksasyonu

NOT: 3. adımı gerçekleştirin. kimyasal bir başlıkta.

1. İzole adipositler içeren 50 mL tüpe 0.3 mL 0.5 M EDTA, 0.2 mL 0.5 M EGTA, 14.8 mL DMEM ve 10 mL heptan ekleyin (adım 1.11.).
2. 0,7 mL %16 formaldehit (son %0,7) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 10 rpm'de bir tüp döndürücü ( Malzeme Tablosuna bakınız) üzerinde döndürün.
   NOT: Bir zamanlayıcı ayarlayın ve 5 dakika sayın. Birden fazla numune işleniyorsa, tüm numunelerde kesin ve karşılaştırılabilir fiksasyon zamanlaması sağlamak için formaldehiti 30 sn aralıklarla sırayla ekleyin.
3. 1.78 mL 1.25 M glisin (son 0.125 M) ekleyin ve oda sıcaklığında 5 dakikadan fazla olmamak üzere 10 rpm'de döndürücü üzerinde karıştırın.
   NOT: Formaldehit, glisin eklendikten sonra bile aktif kalır. Bu nedenle, 5 dakikalık inkübasyon adımından hemen sonra katmanları santrifüjleme (adım 3.4.) ile ayırmak önemlidir. Birden fazla numune varsa, reaksiyonu 30 saniyelik zaman aralıklarında sırayla durdurmak için her numuneye glisin ekleyin.
4. Daha sonra, oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 200 x g'da santrifüjleyin.
   NOT: Üç belirgin ve ayrık sıvı tabakası olmalıdır (Şekil 2C). Ortadaki beyaz tabaka sabit adipositleri içerir.
5. Adiposit (beyaz) tabakayı 15 mL'lik yeni bir santrifüj tüpüne aktarmak için 1 mL'lik bir pipet ucu kullanın, böylece yeni tüpe taşınan fiksatif ve heptan miktarını en aza indirin.
6. Tüpü, proteaz inhibitörü kokteyli (PIC, Malzeme Tablosuna bakınız) tableti ile desteklenmiş 10 mL (oda sıcaklığında) DMEM ile doldurun. Ters çevirerek iyice karıştırın.
7. Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca ≤200 x g'da santrifüjleyin. Hücre patlamasını en aza indirmek için santrifüjleme kuvvetini 100 x g'da tutun.
8. 3.5.-3.7 adımlarını tekrarlayın. Adım 3.9'a geçmeden önce 1x.
9. Adiposit (beyaz) tabakayı 1,5 mL veya 2 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için 1 mL'lik bir pipet ucu kullanın.
10. Tüpü oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 100-200 x g'da santrifüjleyin ve heptanı (üst katman) ve DMEM'i (alt katman) çıkarmak için 1 ml'lik bir pipet ucu kullanın.
11. Sabit adipositleri kullanana kadar −80 ° C'de 6 aya kadar saklayın.

4. Çekirdek ekstraksiyonu ve kromatin kesme

NOT: Bu prosedür Arrigoni ve ^ark.19'dan uyarlanmıştır.

1. Sonikatörü açın ( Malzeme Tablosuna bakın) ve su banyosu soğutucusu 20 °C'ye ayarlandığında tepe gücünü 75 W'a, görev faktörünü %2'ye ve 200 döngü/patlamaya ayarlayın.
2. Farnham laboratuvar tamponuna ve kesme tamponuna proteaz inhibitör kokteyli (PIC) ekleyin (Tablo 1).
   NOT: Lütfen Arrigoni ve ^ark.19'da önerilen birkaç sonikatör ve parametreye göz atın.
3. 1 mL sonikasyon tüpünde 750-800 μL buz gibi Farnham laboratuvar tamponu ile sabit adipositleri (adım 3'ten itibaren) yeniden süspanse edin (Malzeme Tablosuna bakınız).
   NOT: Tüpün tam kapasitesine kadar doldurulmaması tavsiye edilir. Aksi takdirde, adipositler tüpün en üst kısmına yüzer ve bu da sonikasyon verimliliğini azaltır.
4. Numuneyi 2,5 dakika boyunca sonikleştirin.
   NOT: Daha fazla sonikasyon gerekip gerekmediğini belirlemek için bir faz kontrast mikroskobunda çekirdek ekstraksiyonunu kontrol edin. Çekirdekler, Şekil 2D'de gösterildiği gibi yuvarlak ve sağlam olmalıdır.
5. Daha fazla ilerlemeden önce, su banyosu soğutucusu 4 °C'ye ayarlanmış durumdayken, sonikatör tepe gücünü 140 W'a, görev faktörünü %5'e ve 200 döngü/patlamaya ayarlayın.
6. Süpernatanı 1.5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarmak için bir pipet kullanın. Tüpü 1.000 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin.
7. Süpernatanı peletten (çekirdeklerden) dikkatlice çıkarın ve peleti saklayın.
8. Peletleri 1 mL Farnham laboratuvar tamponu ile buz üzerinde yıkayın.
9. Tüpü 4 ° C'de 5 dakika boyunca 1.000 x g'da santrifüjleyin, süpernatantı çıkarmak için bir pipet kullanın ve peleti tutun.
10. 4.8.-4.9 adımlarını tekrarlayın. Adım 4.11'e geçmeden önce 1x.
    NOT: İzole edilmiş ve yıkanmış çekirdekler, daha fazla kullanıma kadar 3 ay boyunca -80 °C'de saklanabilir.
11. İzole edilmiş çekirdekleri 1 mL kesme tamponunda yeniden süspanse edin ve bunları yeni bir 1 mL sonikasyon tüpüne aktarın. Tüpte kabarcık olmadığından emin olun.
12. Kromatini 4 ° C'de kesmek için 140 W'lık bir tepe gücü,% 5'lik bir görev faktörü ve 12 dakika boyunca 200 döngü / patlama ile sonikatör içindeki çekirdekleri sonikleştirin.
13. Lizatı 1.5 mL'lik bir mikrofüj tüpüne aktarın.
    NOT: Kesilen kromatin çekirdekten salınır ve tamponda (lizat) bulunur.
14. Çözünmeyen kalıntıları peletlemek için tüpü 10.000 x g'da 4 ° C'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı (kromatin) yeni bir 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın.
15. Kesilmiş kromatin, 4 ° C'de 10 gün boyunca veya -80 ° C'de 3 ay boyunca daha fazla kullanıma kadar saklanabilir.
    NOT: Ek kalite kontrolü: Daha önce yayınlanan raporu¹⁹ takiben RNA'yı DNaz içermeyen bir RNaz ile çapraz bağlamak ve çıkarmak için kesilmiş kromatinin 25 μL'sini alikotlayın. Bu çalışma için, elde edilen DNA, üreticinin talimatlarına göre bir DNA saflaştırma kiti ile saflaştırıldı, DNA, DNA miktar belirleme cihazı üzerinde bir DNA miktar belirleme kiti ile ölçüldü ve parça boyutu otomatik elektroforez cihazı ile değerlendirildi (bkz. Kesilen kromatin boyutu 100-800 bp aralığında olmalıdır. Kesme kromatininin geri kalanı, aşağı akış ChIP-Seq uygulaması için devam edebilir.

Sonuçlar

Adipositler altı yağ pedinden izole edildi, heptan bazlı RNA ekstraksiyonu yapıldı (aşama 2.) ve elde edilen RNA otomatik elektroforez cihazında analiz edildi. Tüm numuneler için hesaplanan RNA bütünlük numarası (RIN) >8 idi (Şekil 3A), bu da yüksek kaliteli ve tekrarlanabilir bir RNA preparatını gösteriyordu. Toplam RNA hazırlık kiti daha sonra RNA kütüphanelerini hazırlamak için kullanıldı ve her örnek, ≥40 milyon okuma derinliğine ulaşmak için yeni nesil dizileyicide dizilendi. Tüm örnekler (Şekil 3B) ve dizi başına (Şekil 3C) Phred skoru ≥30 idi, bu da yüksek kaliteli DNA dizilerinin²⁰ göstergesiydi. Böylece heptan uzaklaştırma, RNA dizilimine uygun yüksek verimli, yüksek kaliteli RNA'nın izolasyonunu destekler.

Formaldehit fiksasyon adımında, üç heptan içeren nükleer izolasyon preparatı ve heptan içermeyen bir kontrol preparatı da gerçekleştirildi. Kesilen kromatin daha sonra otomatik elektroforez cihazında analiz edildi. Her iki durumda da, kromatin, aşağı akış ChIP-seq prosedürleri¹⁹ için ideal olan 100-800 bp boyut aralığına (Şekil 4A) kesildi. Daha da önemlisi, heptan ile muamele edilmiş numunelerden (11.5 ng/μL, 9.42 ng/μL ve 9.6 ng/μL) işlenmemiş numunelere (2.2 ng/μL) göre ~ 5 kat daha fazla kromatin elde edildi. H3K4me3 ve H3K27me3 ChIP-seq Arrigoni ve ^ark.19 tarafından gerçekleştirildi. Şekil 4B'de gösterildiği gibi, üç bağımsız heptan ile muamele edilmiş numuneden alınan sinyal izleri, her iki histon işareti için heptan ile muamele edilmemiş numunenin izi ile karşılaştırılabilirdi. Heptan muamelesi, ChIP-seq'in kalitesine müdahale etmez, ancak çekirdek (ve kesilmiş kromatin) verimini önemli ölçüde artırır.

Şekil 1: İzole edilmiş adipositler. İzole edilen adipositler, çekirdeği boyamak için DAPI (mavi) ve lipitler için BODIPY (yeşil) ile boyandı. Sitozolik lipid damlacıkları, adipositlerin hacminin %95'ini oluşturur ve RNA ve kromatin ekstraksiyonları sırasında yüksek verim elde etmek için teknik bir zorluk teşkil eder. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Transkriptom ve epigenom analizi için adiposit izolasyonunun şematik akışı. Adiposit izolasyonundan transkriptom veya epigenom uygulamasına kadar tüm iş akışı tasvir edilmiştir. Anahtar adımlar ve temsili sonuçlar gösterilir. (A) İzole edilmiş adipositler, tüpün dibinde bir pelet olarak stromal vasküler fraksiyondan ayrılarak üst tabaka üzerinde yüzer. (B) RNA izolasyon reaktifi ile RNA ekstraksiyonundan önce lipitleri uzaklaştırmak için heptan kullanımı. (C) Adiposit fiksasyonu sırasında lipitleri uzaklaştırmak için heptan kullanımı. (D) İzole edilmiş adiposit çekirdeklerinin temsili görüntüsü sağlam ve yuvarlak olmalıdır. Ölçek çubuğu = 20 μm. Şema BioRender.com ile oluşturuldu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: RNA diziliminden sonra RNA bütünlüğü ve kalite skorlarının temsili elektroferogramı. (A) Örnekler 1-6, heptan ile muamele edilmiş adipositlerin altı kopyasını temsil eder ve RNA bütünlük analizleri, otomatik elektroforez cihazında çalıştırılmıştır. RNA bütünlük numarası (RIN), 18S ve 28S ribozomal RNA oranlarına dayanmaktadır ve RNA kalitesini temsil eder. 1'den (çok bozulmuş) 10'a (en az bozulmuş) kadar ölçeklendirin. (B,C) Sıralama okuma kalitesi puanı, bazlardaki ortalama kalite puanı (C) ve dizi başına kalite puanı için çoklu kalite analizi (B) ile belirlendi. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: ChIP-seq.'den kesilmiş kromatin ve zenginleştirme piklerinin temsili elektroferogramı. (A) Kontrolün kromatin boyutu dağılımlarını (numune 1, sol üst) ve heptan ile muamele edilmiş adiposit kromatin preparatlarını (numune 2, 5 ve 8, sağ üst ve alt iki) gösteren otomatik elektroforez cihazından alınan temsili profiller. Son preparatlardaki kromatin konsantrasyonları her görüntünün sol üst köşesinde belirtilmiştir. (B) Integrative Genomics Viewer (IGV) kullanılarak yapılan genom tarayıcısı ekran görüntüsü. Grafiğin üst kısmı, üç (kırmızı) heptan ile muamele edilmiş numune ve bir (mavi) kontrol için H3K4me3 ChIP-seq profillerini göstermektedir. Alt panel, H3K27me3'ün ChIP-seq'i için aynı şeyi gösterir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Arabellek	Kompozisyon
Sindirim tamponu (3000 mg veya daha az yağ yastığı / 20 mL için)	20 mL Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM)
	0,3 g yağ asidi içermeyen BSA
	0.1 g kollajenaz tip 2
Farnham laboratuvar tamponu	5 mM BORULAR (pH 8)
	85 mM KCl
	% 0.5 IGEPAL
Kesme tamponu	10 mM Tris-HCl pH 8
	% 0.1 SDS
	1 mM EDTA

Tablo 1: Bu çalışmada kullanılan farklı tamponların bileşimi.

Tartışmalar

Burada sunulan adiposit izolasyon protokolü, olgun adipositleri (yüzer) beyaz yağ dokusunun kalan stromal vasküler fraksiyonundan ayırmak için iyi kabul görmüş enzimatik sindirim yöntemlerine^11,14 dayanmaktadır. Herhangi bir fare modelinde olgun adipositleri saflaştırmak için basit ve evrensel bir yaklaşım sağlar. Yukarıda gösterildiği gibi, protokol tüm transkriptom ve ChIP-seq analizleri için aşağı akış kullanımı için uygundur. Aynı bireysel yağ pedinden birden fazla epigenomik profil (örneğin, birkaç histon modifikasyonu artı RNA-dizilimi) oluşturmak için yeterli verim sağlar.

Bu tür eşleşen epigenom verilerinin hazırlanmasını sağlayan yüksek verimleri sağlamak için, kritik bir adım, lipitleri sağlam adipositlerden ve işlem sırasında parçalanan adipositlerden çözmek için heptan kullanmaktır. Deneyimlerimize göre, bu adım, RNA ve çekirdeklerin lipit tabakasına kaybolmasını önleyerek tekrarlanabilirliği ve verimi önemli ölçüde artırır. Fiksasyon geçiren adiposit içeren tüplerin sürekli rotasyonu, lipitlerin adipositlerden uzaklaştırıldığı homojenliği arttırdığı için eşit derecede önemlidir. ChIP-seq literatürünün^{çoğunda bildirilen %}1 formaldehit fiksatif tamponu ^21,22 yerine, aşırı fiksasyonu önlemek için konsantrasyonun %0.7 formaldehite düşürülmesinin gerekli olduğu bulunmuştur. Kromatin kesme süresi de ChIP-seq için optimum bir kromatin boyutu aralığı (100-800 bp) elde etmek için 12 dakikaya optimize edildi.

Protokol, toplu transkriptom ve epigenom çalışmaları için optimize edilmiştir. Mevcut protokolün tek hücreli transkriptom ve epigenom uygulamaları için hala kendi sınırlamaları vardır. Adipozite alanı ^23,24'te bildirilen hücre heterojenliği göz önüne alındığında, bu izolasyon yöntemi, tek hücreli deneyler için uyarlanmak üzere daha da geliştirilebilir. Bu tür bağlamlarda, bor-dipirrometen (BODIPY)²⁵ ve perilipin-1 (PLIN1)²⁶, ASC-1²⁷ veya adiposit spesifik çekirdek belirteçleri gibi adiposit kısıtlı belirteçler, ek, işlevsel, ilgili hücresel parametrelerin²⁸ kantitasyonunu sağlamada değerli olabilir. Genomik çalışmalara uygulamanın yanı sıra, bu protokol, adipositlerdeki yüksek lipid içeriği nedeniyle ekstra bir engele sahip olan adiposit proteomik çalışmalarını da iyileştirebilir²⁹.

Bu protokol aynı zamanda insan adiposit çekirdeklerini (veriler gösterilmemiştir) başarılı bir şekilde çıkarmak için de kullanılabilir ve uygulamasını insan obezitesi araştırmalarına genişletir.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
16% Formaldehyde Solution (w/v). Methanol-free	ThermoFisher SCIENTIFIC	28908
1-bromo-3-chloropropane	SIGMA	B9673
5 M NaCl	invitrogen	AM9759
Automated electrophoresis instrument (2100 Bioanalyzer Instrument)	Agilent Technologies	G2939BA
BODIPY	ThermoFisher SCIENTIFIC	D3922
Collagenase Type 2	Worthington Biochemical Corp.	43D14184B
Complete, EDTA-free, Protease inhibitor cocktail (PIC)	Roche	4693159001	EDTA free
DAPI	ThermoFisher SCIENTIFIC	D1306
DMEM (+ GlutaMAX)	life technologies	61965-026
DNA purification kit (PCR purification kit)	Qiagen	28104
DNA quantification instrument (Qubit 4 Fluorometer)	Fisher SCIENTIFIC	Q33238
DNA quantification kit (DNA high sensitivity assay)	Agilent Technologies	5067-4626
EDTA	Fisher chimical	E478-500
EGTA	Fisher chimical	O2783-100
EtOH	PHARMCO	111000200
Fatty acid-free BSA	SERVA	11932.01	bovine albumin fraction V, fatty acid-free lyophilized
Glycine	SIGMA	G7126-100G
Heptane	SIGMA	H2198-1L
High Sensitivity RNA Analysis	Agilent Technologies	5067-1513
Igepal	SIGMA	18896-50ML
KCl	SIGMA	P3911-25G
Matrix filter (420um)	Tisch Scientific	ME17238
Next-Generation Sequencer (HiSeq 3000 Sequencer)	Illumina
Nuclease-free water	Invitrogen	4387936
PIPES	ACROS organics	5625-37-6
Proteinase K	ThermoFisher SCIENTIFIC	EO0491
RNA isolation reagent (Trizol)	ThermoFisher SCIENTIFIC	15596026
RNase A, DNase-free	ThermoFisher SCIENTIFIC	EN0531
Rotator (Thermo Scientific Tube Revolver Rotator)	ThermoFisher SCIENTIFIC	88881001
SDS, Sodium dodecyl sulfate	SIGMA	8170341000
Sonication tube (1 mL milliTUBE with AFA Fiber)	Covaris	520135
Sonicator (Evolution Focused-ultra-sonicator (S220 or E220))	Covaris	500217 or 500239
Total RNA Prep kit ( Illumina Stranded Total RNA Prep kit)	Illumina	20040525
Tris-HCl	Fisher bioreagents	BP153-500