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要約

ここでは、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS-MS)を使用して、水耕条件下で小麦中のイミダクロプリドの吸収、転座、および分布を決定するためのプロトコルを示します。その結果、イミダクロプリドはコムギに吸収され、コムギの根と葉の両方でイミダクロプリドが検出された。

要約

殺虫剤の一種であるネオニコチノイドは、その新しい作用機序、高い殺虫活性、および強力な根の取り込みのために広く使用されています。世界で最も広く使用されている殺虫剤であるイミダクロプリドは、代表的な第一世代のネオニコチノイドであり、作物、野菜、果樹の害虫駆除に使用されています。イミダクロプリドのこのような幅広い用途により、作物中のその残留物はますます精査されています。本研究では,15本のコムギ苗を0.5 mg/Lまたは5 mg/Lのイミダクロプリドを含む培地に入れ,水耕栽培を行った。コムギの根および葉におけるイミダクロプリドの含有量は、コムギ中のイミダクロプリドの移動および分布を探索するために、1日、2日、および3日間の水耕後に決定された。その結果,コムギの根と葉の両方でイミダクロプリドが検出され,根のイミダクロプリドの含有量は葉よりも高かった。さらに、コムギ中のイミダクロプリド濃度は、曝露時間の増加とともに増加した。3日間の曝露後、0.5 mg/L処理群のコムギの根および葉は、それぞれ4.55 mg/kg±1.45 mg/kgおよび1.30 mg/kg±0.08 mg/kgイミダクロプリドを含み、5 mg/L処理群の根および葉は0.62 mg/kgおよび8.71 mg/kg±0.14 mg/kgイミダクロプリド±42mg/kgおよび8.71mg/kgを含み、 それぞれ。本研究の結果は、作物中の残留農薬のより良い理解を可能にし、農薬の環境リスク評価のためのデータ参照を提供します。

概要

今日の農学では、農薬の使用は作物の収量を増やすために不可欠です。ネオニコチノイド系殺虫剤は、昆虫神経系のニコチン性アセチルコリン受容体を制御することによって膜電位バランスを変化させ、それによって昆虫の中枢神経系の正常な伝導を阻害し、昆虫の麻痺および死をもたらす1。従来の殺虫剤と比較して、ネオニコチノイドには、新しい作用機序、高い殺虫活性、強力な根の吸収などの利点があり、農薬市場で非常に成功しています2,3。ネオニコチノイドの販売量は、2014年に世界の農薬市場の27%を占めると報告されました。ネオニコチノイドの平均年間成長率は2005年から2010年まで11.4%で、そのうち約7%が中国で登録されました4,5,6。2016年末から2017年前半にかけて、中国での農薬の売上高は下落した後、回復し始め、農薬の価格は上昇し続け、その中でネオニコチノイド系殺虫剤は大幅な価格上昇を示しました7。これまでに、3世代のネオニコチノイド殺虫剤が開発されており、それぞれニコチンの塩化ピリジン、チアゾリル、およびテトラヒドロフラン基を含有する8。

イミダクロプリドは、分子式がC9H10ClN5O2である第一世代のネオニコチノイド殺虫剤を表し、無色の結晶である。イミダクロプリドは、主にアブラムシ、ウンカ、ミールワーム、アザミウマなどの害虫を防除するために使用され9 、米、小麦、トウモロコシ、綿花などの作物、ジャガイモなどの野菜、果樹に適用できます。農薬の長期的、実質的、継続的な施用により、益虫と害虫の天敵の両方が急速に減少し、一部の農業害虫は農薬に耐性を持つようになり、農薬の継続的かつ増加量という悪循環が生じています10。さらに、農薬の広範な施用は、土壌の質の悪化、農産物中の残留農薬の残留、およびその他の生態学的問題を引き起こし、農業生態環境に重大な損害を与えるだけでなく11 、人間の健康に深刻な脅威をもたらします12。農薬散布は、土壌微生物と土壌動物の成長と質に深刻な影響を及ぼします13。農薬の不当または過度の使用は、土壌および水環境、動植物、さらには人命に重大なセキュリティリスクを引き起こしました14。近年、農薬の広範な施用に伴い、作物中の過剰な残留農薬の問題がより深刻になっています。イミダクロプリドを使用して野菜収量を増加させると、野菜中のイミダクロプリドの吸収率は、イミダクロプリドの量と残留物の増加とともに増加しました15。主要な食用作物として、小麦の生産と安全性の両方が重要です。したがって、小麦に使用される農薬の残留と流通政策を明確にする必要があります。

近年、水、土壌、植物からイミダクロプリド残留物を抽出するための多くの方法が開発されています。QuEChERS法(迅速、簡単、安価、効果的、堅牢、安全)は、固相マイクロ抽出技術と分散固相抽出技術を組み合わせた新しい方法であり、抽出溶媒としてアセトニトリルを使用し、それぞれNaClと無水MgSO4を使用してサンプル中の混合不純物と水を除去します16。.QuEChERS法は、最小限のガラス製品を必要とし、簡単な実験ステップを備えているため、最も人気のある農薬抽出方法の1つとなっています17。イミダクロプリドの検出では、液体クロマトグラフィー(LC)で1 × 10-9 g18という低い検出限界を達成し、ガスクロマトグラフィー(GC)で1 × 10-11 g 19を達成しました。それらの高い分解能と感度のために、LC-MSおよびGC-MSは、1 × 10-13から1 × 10-14 g20,21のさらに低いイミダクロプリド検出限界を示しています。したがって、これらの技術は、微量イミダクロプリド残基の分析に適しています。

本研究では、小麦中のイミダクロプリド残留物の分布を研究するために、イミダクロプリドを標的汚染物質として選択し、小麦を試験作物として選択しました。このプロトコルは、水耕栽培条件下で栽培された小麦植物のさまざまな部分におけるイミダクロプリドの吸収と貯蔵を探索することにより、小麦中の農薬イミダクロプリドの濃縮と移動の包括的な分析の方法を詳述しています。本研究は、小麦中の残留農薬のリスク評価の理論的基礎を提供し、残留農薬を減らすための農業生産活動における農薬の合理的な適用を導き、作物生産の安全性を向上させることを目的としています。

プロトコル

1.小麦種子の発芽

  1. 完全な顆粒、無傷の胚、均一なサイズ(長さ:6 mm±0.5 mm)の小麦種子(ジマイ20)を1,000個選択します。
  2. 333.3mLの30%H2O2溶液を1Lメスフラスコに移し、イオン交換水で希釈して1Lの10%H2O2溶液を調製した。小麦種子を10%H 2 O2溶液に15分間浸して、種子表面を消毒します(図1)。
  3. 小麦の種子を毎回10秒間、滅菌水で5回すすぎます。
  4. 湿った滅菌濾紙が入ったガラスのペトリ皿に胚を上に向けて小麦の種子を均等に広げます(図2)。ペトリ皿を30°C、相対湿度80%の人工気候インキュベーターに入れます。小麦の種子が発芽して根付くまで、暗所で3日間培養します。

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図1:小麦種子の消毒。コムギ種子を10%H2O2溶液(ビーカー中)に15分間浸し、種子表面を消毒した。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

figure-protocol-990
図2:小麦種子の発芽。 小麦種子を、湿った滅菌濾紙を含むガラスシャーレに均等に広げた。ペトリ皿を人工気候インキュベーターに入れて小麦種子を発芽させた。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

2.小麦苗の栽培

  1. 551 mgのホーグランド基礎塩混合物を1 Lの脱イオン水に溶解し、1/2ホーグランド栄養溶液(0.75 mmol/L K 2 SO 4、0.1 mmol/L KCl、0.6 mmol/L MgSO 4、4.0 × 10-2 mmol/L FeEDTA、1.0 ×10−3 mmol/L H 3 BO3、1.0 × 10−3 mmol/L MnSO 4を含む)を調製する。 1.0 × 10−3ミリモル/L ZnSO 4、1.0 × 10−4ミリモル/L CuSO 4、および5.0 × 10−6ミリモル/L Na2 MoO 4)。
  2. 小麦の種子(ステップ1.4)が発芽した後、水耕栽培用の1/2ホーグランド栄養溶液100mLを含む水耕栽培装置( 材料表を参照)に15本の小麦苗を置きます(図3)。水耕栽培装置全体を人工気候インキュベーター( 材料の表を参照)に入れ、25°C、相対湿度80%で7日間、16時間の明/8時間の暗明周期でインキュベートします。

figure-protocol-2141
図3:コムギ苗の水耕栽培。 コムギ苗を100mLの1/2ホーグランド養液中で0日、3日、7日間水耕栽培した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

3. コムギ植物をイミダクロプリド溶液に曝露する実験

  1. 7日間の水耕栽培期間の後、小麦植物を0.5 mg / Lまたは5 mg / Lのイミダクロプリドを含む1/2ホーグランド栄養溶液に移植して、イミダクロプリド曝露実験を実施します。各水耕栽培装置で15本の小麦植物を育てます。イミダクロプリド濃度グループごとに15個の水耕栽培装置を設置して、サンプリング中に適切なサンプルが採取されるようにします。
  2. 水耕栽培装置全体を人工気候インキュベーターに3日間置き、25°C、相対湿度80%、明長16時間/暗明周期8時間。
  3. 暴露期間中、小麦の根(小麦植物あたり0.2 g)と葉(小麦植物あたり0.5 g)を毎日収集します。5つおきの水耕栽培装置からの小麦サンプルを並列グループとして統合し、サンプルのイミダクロプリド含有量を決定します。

4.小麦からイミダクロプリドを抽出する手順

  1. コムギ根からのイミダクロプリドの抽出
    1. 実験誤差を避けるために、小麦の根を毎回10秒間流す滅菌水で4回洗浄し、根の表面に吸着したイミダクロプリドを取り除きます。
    2. 小麦の根をハサミで約1cmに細断します(図4)。細かく刻んだ小麦の根10.00 gの重さを量り、50 mLの遠沈管に入れます。
    3. 10 mLのアセトニトリルを遠沈管に加え、チューブをボルテクサー上で1分間ボルテックスします。次に、4 gの無水MgSO4 と1.5 gのNaClを遠沈管に加え、すぐにチューブを30秒間ボルテックスします。チューブを6,000 x gで5分間遠心分離します。
    4. 使い捨てシリンジで上清を吸引し、シリンジフィルター(孔径0.22μm)に通してサンプルを採取します。
  2. コムギ葉からのイミダクロプリドの抽出(図5)
    1. 新鮮な小麦の葉をハサミで約1cmに細切りにします(図4)。細かく刻んだ小麦の葉10.00 gを量り、50 mLの遠沈管に入れます。
    2. 10 mLのアセトニトリルを遠沈管に加え、チューブをボルテクサー上で1分間ボルテックスします。
    3. 4 gの無水MgSO4 と1.5 gのNaClを遠心管に加え、すぐにチューブを30秒間ボルテックスします。
    4. チューブを6,000 x gで5分間遠心分離します。
    5. 遠心分離後、黒鉛化カーボンブラック(GCB)50 mgと無水MgSO4 150 mgを入れた5 mL遠沈管に上清2 mLを加え(サンプルから色素と水分を除去するため)、遠沈管を30秒間ボルテックスします(図6)。チューブを6,000 x gで5分間遠心分離します。
    6. 使い捨てシリンジで上清を吸引し、シリンジフィルター(孔径0.22μm)に通してサンプルを採取します。

figure-protocol-4094
図4:細かく刻んだ小麦の根と葉。 新鮮な小麦の根と葉をハサミで約1cmに細断した。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図5:コムギ葉中のイミダクロプリドの抽出。 サンプル中のイミダクロプリドをQuEChERS法を用いて抽出した(プロトコルのステップ4.2.1〜4.2.4)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

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図6:コムギ葉中のイミダクロプリドの精製。 除染剤は50 mg GCB + 150 mg MgSO4でした。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

5.イミダクロプリドの定量

  1. 0.2〜250 μg/Lのイミダクロプリド濃度から得られた標準曲線(y = 696.61x + 56.411、R = 1)に基づいて、液体クロマトグラフィー-タンデム質量分析(LC-MS-MS)を使用してサンプル中のイミダクロプリドを定量します。(図7)。質量分析計には、C18 カラム(100 mm x 2.1 mm、3 μm)とエレクトロスプレーイオン化源(ESI+)が装備されていました。溶出プログラムとイオン源パラメータを 表1に示します。

figure-protocol-5649
図7:コムギ葉中のイミダクロプリドのクロマトグラムおよび質量分析。 上のパネルは、イミダクロプリドのクロマトグラムを示す(保持時間= 0.93分)。下のパネルは、0.93分でのイミダクロプリドの質量分析を示し、イミダクロプリドの生産の応答強度(m / z = 208.8)を示しています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

カラム温度40 °C
溶剤A99.9%水/0.1%ギ酸(V / V)
溶剤Bアセトニ トリル
溶出プログラム0–0.5分, A = 20%
0.5〜2分、A = 20%〜50%
2–3 分, A = 50%
3〜3.1分、A = 50%〜20%
3.1〜5分、A = 20%
流量(ミリリットル/分)0.3
注入量(μL)5
キャピラリー温度(°C)330
気化器温度(°C)350
シースガス流量(Arb)40
補助ガス流量(Arb)20
スプレー電圧(V)3900
衝突ガス圧(mTorr)1.5
プリカーサーイオン256.1
プロダクトイオン/衝突エネルギー(eV)208.8/16

表1:液体クロマトグラフィー-質量分析法の溶出プログラムとイオン源パラメータ。

結果

イミダクロプリドの検出限界(LOD)は5.76 × 10-14 gであり、小麦の根または葉におけるイミダクロプリドのLODは0.01 μg/kgでした。マトリックス効果は観察されなかった。コムギ中のイミダクロプリドの回収収率を 表2に示す。イミダクロプリド濃度0.5 mg/Lおよび5 mg/Lに曝露されたコムギ根からのイミダクロプリドの回収収率は,それぞれ94.0%-97.6%および98.8%-99.2%であった。変動係?...

ディスカッション

近年、農薬イミダクロプリドの前処理及び残留の検出のための方法が頻繁に報告されている。Badawyら23は、温室条件下で栽培されたトマト果実中のイミダクロプリドの含有量を決定するために高速液体クロマトグラフィーを使用し、0.0125〜0.15μg/ mLの範囲のイミダクロプリドの良好な直線性を報告しました。Zhaiら24は、LC-MS-MSを用いて、チャイナのイミダク?...

開示事項

著者は、利益相反がないことを宣言します。すべての著者が原稿を読み、承認しました。この研究は以前に発表されておらず、他の査読付きジャーナルでも検討されていません。

謝辞

この研究は、中国国家自然科学基金会(第42277039号)の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AcetonitrileSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd.01-06-1995Suitable for HPLC, gradient grade, >99.9%
Analytical balanceSartorius Lab Instruments Co.Ltd.GL124-1SCN
Artificial climate incubator  Shanghai Badian Instrument Equipment Co. Ltd.HK320
CentrifugeEppendorf China Co. Ltd.Centrifuge5804
Disposable syringeSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd.Z116866Capacity 5 mL, graduated 0.2 mL, non-sterile
Formic acidSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd.Y0001970European pharmacopoeia reference standard
Graphitized carbon black (GCB)Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd.V90005845 μm
H2O2Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.3164230% (w/w)
Hoagland’s Basal Salt MixtureShanghai Yu Bo Biotech Co. Ltd.NS1011Anhydrous, reagent grade
Hydroponic equipmentJiangsu Rongcheng Agricultural Science and Technology Development Co.Ltd.SDZ04BD
Hypersil BDS C18 columnThermo Fisher Scientific (China) Co. Ltd.28103-102130
ImidaclopridSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd.Y0002028European pharmacopoeia reference standard
MgSO4Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co. Ltd.208094Anhydrous, reagent grade, >97%
NaClSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.S9888Reagent grade, 99%
pH meterShanghai Thunder Magnetic Instrument FactoryPHSJ-3F
Phytotron boxHarbin Donglian Electronic Technology Co. Ltd.HPG-280B
PipettesEppendorf China Co. Ltd.Research plus
Syringe filterSigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co.Ltd.SLGV033NNylon, 0.22 µm pore size, 33 mm, non-sterile
Ultra performance liquid chromatography tandem triple quadrupole mass spectrometryThermo Fisher Scientific (China) Co. Ltd.UltiMate 3000
TSQ Quantum Access MAX
Vortex mixerShanghai Yetuo Technology Co. Ltd.Vortex-2
Wheat seedLuKe seed industryJimai 20

参考文献

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