エラスムス梯子を用いたマウスの微細運動学習と連想運動学習のモニタリング

要約

この記事では、エラスムスラダーと呼ばれるデバイスを使用して、微細運動能力の非侵襲的で自動化された評価と、課題に対する適応的および連想的運動学習を可能にするプロトコルを紹介します。タスクの難易度を滴定して、重大な程度から微妙な程度までの運動障害を検出できます。

要約

行動は行動によって形作られ、行動には強さ、協調性、学習などの運動能力が必要です。生命を維持するために不可欠な行動は、ある位置から別の位置に移行する能力なしには不可能です。残念ながら、運動能力はさまざまな病気で損なわれる可能性があります。そのため、運動機能のメカニズムを細胞・分子・回路レベルで調べ、運動障害の症状や原因、進行を理解することは、効果的な治療法の開発に欠かせません。この目的のために、マウスモデルが頻繁に使用されます。

本稿では、エラスムス・ラダーと呼ばれる自動化ツールを用いて、マウスの運動能力と学習のさまざまな側面をモニタリングできるプロトコルについて述べる。このアッセイには、不規則な横木で作られた水平のはしごをマウスが移動するように訓練する初期段階(「微細運動学習」)と、移動する動物の経路に障害物を提示する第2段階の2つの段階があります。摂動は、予期せぬ場合(「運動学習の挑戦」)の場合もあれば、聴覚的な緊張が先行する(「連想運動学習」)場合もあります。このタスクは簡単に実行でき、自動化されたソフトウェアによって完全にサポートされています。

このレポートは、テストからのさまざまな読み取り値を、感度の高い統計的手法で分析した場合に、マウスの小さなコホートを使用してマウスの運動能力を詳細に監視できることを示しています。本手法は、運動機能が損なわれた変異マウスにおいて、環境変化による運動適応や初期段階の微妙な運動障害を高感度に評価することを提案します。

概要

マウスの運動表現型を評価するために、さまざまなテストが開発されています。各テストは、運動行動の特定の側面に関する情報を提供します¹.たとえば、オープンフィールドテストは、一般的な移動運動と不安状態について通知します。ロータロッドとウォーキングビームは、協調性とバランスに関するテストを行います。フットプリント分析は歩行に関するものです。強制的または自発的な身体運動中のトレッドミルまたはランニングホイール。そして、複雑なホイールは運動能力の学習に関するものです。マウスの運動表現型を分析するには、研究者はこれらのテストを順番に実行する必要があり、これには多くの時間と労力がかかり、多くの場合、複数の動物コホートが含まれます。細胞レベルまたは回路レベルで情報がある場合、調査員は通常、関連する側面を監視し、そこから追跡するテストを選択します。しかし、運動行動のさまざまな側面を自動化された方法で識別するパラダイムが不足しています。

本稿では、マウスの様々な運動学習機能を包括的に評価できるシステムであるエラスムス・ラ^ダー2,3を使用するためのプロトコルについて述べる。主な利点は、この方法の再現性と感度、および運動障害を滴定し、運動能力の障害を連想運動学習の障害から分離する能力です。主なコンポーネントは、はしご上のマウスの位置を検出するタッチセンサーを備えた高段(H)と低段(L)が交互に並ぶ水平のはしごで構成されています。はしごは2 x 37段(L、6 mm;H、12 mm)を互いに15 mm間隔で配置し、30 mmの間隔を空けて左右に交互に配置します(図1A)。横木を個別に動かして、さまざまなレベルの難易度を生成する、つまり障害物を作成できます (高い横木を 18 mm 上げます)。エラスムスラダーは、自動記録システムとラングパターンの変更を感覚刺激と関連付けることで、環境上の課題(障害物をシミュレートするためのより高いラングの出現、無条件刺激[US])または感覚刺激との関連(トーン、条件刺激[CS])に応答して、微細な運動学習と運動能力の適応をテストします。試験には2つの異なる段階があり、それぞれが4日間の運動能力の改善を評価し、その間、マウスは1日あたり42回の連続した試験を受けます。初期段階では、マウスはしごをナビゲートして「細かい」または「熟練した」運動学習を評価するように訓練されます。第2段階は、移動する動物の進路により高い段の形の障害物が提示されるインターリーブ試験で構成されています。摂動は、「障害のある」運動学習を評価するために予期せぬものであったり(米国のみの試験)、または「連想的」運動学習を評価するために聴覚音によって発表されたり(対応のある試験)である。

エラスムスの梯子は^{比較的最近開発された2,3}。プロトコルの設定と最適化には集中的な努力が必要であり、他の運動障害を明らかにする可能性を詳細に調査することなく、小脳依存の連想学習を評価するように特別に設計されているため、広くは使用されていませんでした。現在までに、マウス3,4,5,6,7,8の小脳機能障害に関連する微妙な運動障害を明らかにする能力が検証されています。例えば、コネキシン36(Cx36)ノックアウトマウスでは、卵巣ニューロンのギャップ結合が損なわれており、電卓結合の欠如により発火障害が見られますが、運動の表現型を特定するのは困難でした。エラスムス梯子を用いた実験では、小脳の運動学習課題における下卵巣ニューロンの役割は、刺激の正確な時間的符号化を符号化し、予期せぬ出来事に対する学習依存的な反応を促進することであることが示唆された^3,4。脆弱Xメッセンジャーリボ核タンパク質1(Fmr1)ノックアウトマウスは、脆弱X症候群(FXS)のモデルであり、手続き記憶形成の軽度の欠陥とともに、よく知られた認知障害を示します。Fmr1ノックアウトは、エラスムスラダーでのセッションと比較して、歩行時間、試行ごとのミスステップ、または運動能力の改善に有意差を示さなかったが、野生型(WT)の同腹仔と比較して、突然現れる障害物に歩行パターンを調整できず、特定の手続き的および連想的記憶の欠損が確認された^3,5.さらに、プルキンエ細胞の産出、増強、分子層介在ニューロンまたは顆粒細胞の産出障害など、小脳機能に欠陥がある細胞特異的なマウス変異株は、効率的なステップパターンの獲得の変化による運動協調と、梯子を横断するためのステップ数に問題^{を示した6。}新生児脳損傷は、小脳の学習障害とプルキンエ細胞の機能障害を引き起こしますが、エラスムスラ^ダー7,8でも検出できます。

このビデオでは、行動室のセットアップ、行動テストプロトコル、およびその後のデータ分析について詳しく説明した包括的なステップバイステップガイドを紹介します。このレポートは、アクセスしやすくユーザーフレンドリーに作成されており、新規参入者を支援するために特別に設計されています。このプロトコルは、マウスが採用する運動訓練のさまざまな段階と予想される運動パターンに関する洞察を提供します。最後に、本稿では、強力な非線形回帰アプローチを使用したデータ分析のための体系的なワークフローを提案し、他の研究状況にプロトコルを適応させ、適用するための貴重な推奨事項と提案を完備しています。

プロトコル

今回の研究では、成体(生後2〜3ヶ月)のC57BL/6Jマウスを用いた。動物はケージごとに2〜5匹収容され、観察中の動物ユニット内の餌と水に 自由にアクセスでき 、温度制御された環境で12時間の暗/明サイクルで維持されました。すべての手続きは、ヨーロッパおよびスペインの規制(2010/63 / UE;RD 53/2013)であり、バレンシアナ州議会の倫理委員会とミゲル・エルナンデス大学の動物福祉委員会によって承認されました。

1.行動室のセットアップ

1. 行動実験室を毎日同じ時間に予約し、使用するマウスのリストと順序、およびそれらのホストの手配を確立します。
2. 実験用マウスを試験室の外に置いて、試験していないときに空気圧縮機の音やエラスムスラダーの音が聞こえないようにします。
3. エラスムスラダーシステムのすべてのコンポーネント(ネットワークルーター、ソフトウェアがインストールされたコンピューター( 材料表を参照)、エアコンプレッサー、2つのゴールボックス、ラングが適切に配置されたはしごなど、すべてのコンポーネントが整っていて、すぐに使用できる状態になっていることを確認します。
4. ゴールボックス、はしご、横木は、各動物の後に水で、各トレーニング日の終わりに水と70%エタノールで広範囲に清掃します。

2. 行動テストプロトコル

1. 実験を作成し、プロトコルをソフトウェアに入力します(補足図S1)。
   1. ソフトウェアの電源を入れます。
   2. 実験を作成するには、[ ファイル] |新しい実験 |[新規] または [セットアップ] |実験プロトコル。
      注:この調査で使用されているデフォルトのプロトコルはEMCという名前で、ロッテルダムのエラスムス大学医療センターで設計されました。
   3. 実験に名前を付けて、[ OK] をクリックします。
   4. 選択したデフォルトの EMC プロトコルが、4 日間の妨害のないセッション(1 日あたり 42 回の妨害のない試行)と 4 日間のチャレンジ セッション(42 回の毎日の混合試験:妨害なし、CS のみ (トーン)、US のみ (障害物)、ペア (障害物がトーンでアナウンスされる) で構成されていることを確認します(図 1B を参照)。右側のパネルで、マウスがはしごを越えるように促すために使用されるライトキュー(最大持続時間3秒)、エアキュー(最大持続時間45秒)、追い風(すべてのトライアルタイプでYes)、およびトーン(250ms、CSのみおよびペアトライアルでのみYes)も確認します。
   5. 別のプロトコルを作成するには、[ Set up (設定)] |実験計画書 |新規 |最初から 、または EMCプロトコルからコピー して、 セッション数(実験日数) と 1日あたりの試行回数と種類に関連する表の行を編集して、変更するだけです。
      注:休息時間、キューの種類と活性化、持続時間、強度、間隔も、実験の質問に応じて調整できます。
   6. セッションリストを開き、サブジェクトに名前を付けるには、[ 設定 |セッションリスト。
   7. 「 サブジェクトと変数の追加」をクリックします。
   8. マウスの順序付きリストに従って 、特定のマウス識別子、生年月日、性別、遺伝子型、および関連するカテゴリをそれぞれ入力します。
2. セッションを開始します(補足図S2)。
   1. 開始する前に、ソフトウェアが開いていることを確認してから、はしごの電源を入れます。
   2. エアコンプレッサーが接続され、スイッチが入っていることを確認してください。
   3. [取得]ウィンドウを開くには、作成した実験を開きます。
   4. [取得] |[取得] を開きます。
   5. ソフトウェアが示す識別子を持つマウスを、開始ゴールボックス(はしごの右側)に配置します。
   6. 最初のセッションで取得する マウス識別子 を選択します。
   7. [ Start Acquisition] をクリックします。
   8. 赤いはしごメニューノブを3回押します。セッションが開始され、セッションの最後の試行が終了するまでマウスの動きが自動的に制御および記録されることを確認します。
3. セッションを終了します。
   1. 42^回目の 試行の最後に、ディスプレイに 「データ送信 」と 「取得済み」のメッセージが表示されていることを確認します。
   2. マウスをホームケージに戻します。
   3. はしごとゴールボックスを掃除します。
   4. 次のマウスを置き、手順2.2.6以降を繰り返します。
4. 選択したタイプのセッションを、プロトコルが終了するまで毎日実行します。選択したプロトコルに従って、手順2.2と2.3を毎日繰り返します。
5. データをエクスポートします(補足図S2)。
   1. 記録されたデータを視覚化するには、「 分析 」メニューの「 試行統計量」、「 セッション統計量」および 「グループ統計とグラフ」から選択します。
      注:データは、個々の試験のデータと、セッション内の同じ試験タイプの平均を含むスプレッドシートとしてダウンロードできます。セッションは、特定の分析用に選択された変数でフィルタリングすることもできます。
   2. 右上隅にある[ エクスポート ]ボタンをクリックして、ファイル形式(スプレッドシート)とフォルダの場所を選択します。
   3. 自動生成されたチャートを右クリックし、[ファイルに保存].jpgを選択します。

3. データ分析

注意: パラメータのリストは、タッチセンサーのアクティビティの瞬時記録に基づいて、エラスムスラダーによって自動的に測定されます。分析では、ユーザーが選択した出力パラメータがスプレッドシートで整理され、処理されます。ソフトウェアで生成されたグラフに加えて、ユーザーは選択したグラフ作成ソフトウェアを使用してグラフを生成し、セッション中のさまざまなパラメータの特定の変化を視覚化できます。

1. 最初の 4 日間の基礎的な動機付けまたは不安状態、感覚反応、運動能力、および微細運動学習を分析するための特定のパラメーターを選択します。
   1. 光と空気の合図に反応して、ゴールボックス内の静止時間や休息期間後にゴールボックスを出る時間などの制御パラメータを選択してプロットします(図2A)。
      注:休息時間または合図への反応は、WTマウスでは比較的一定です。出口の頻度のような他の変数はWTマウスでは基本的に無視できる-動物はめったに合図なしで休憩箱を離れないし、梯子で一度戻って来ることはめったになく、その結果、出口の頻度は試行ごとに1に等しくなる。キューが適用される前に動物が外に出ると、気流が活性化され、マウスはゴールボックスに戻ります。これは、ソフトウェアによる試用としてカウントされません。
   2. マウスがゴールボックスを離れてからラダーを渡るのに費やした時間として測定された、手がかりの後のラダー上の時間を選択してプロットします(図2B)。
      注: べき乗非線形回帰は、学習を評価するためのロバストな方法です。ピアソン係数またはスピアマン係数(R)は、データフィッティングが良好かどうかの尺度を提供します(動物がセッションで学習/改善した場合のR値は1に近い。R 値が 0 に近い場合は、データが一定であり、マウスは学習しないことを意味します)。
   3. ステップに失敗した試行の割合などのステップパターンパラメータを敏感な学習パラメータとして選択してプロットします(図2C)。
      1. ステップの長さに関係なく、高いラングから別の高いラング (H-H) へのステップとして正しいステップを定義します。低い段を含むステップタイプをミスステップとして考えます。
      2. 正しいステップとミスステップを、押された横木間のステップの長さと方向性に応じて、短いステップと長いステップ、バックステップ、ジャンプに分けます( 図1Aを参照)。
2. 特定のパラメーターを選択してプロットし、過去 4 日間のチャレンジドな運動学習 (米国のみの試行) と連想学習 (対応のある試行) を評価します。
   1. 手がかりの後のラダーに時間を選択してプロットします(図3)。
   2. ミスステップのある試行の割合を選択してプロットします(図4A)。
   3. 梯子の同じ側にある障害物の直前(制御ステップ)と後(適応ステップ)の横線活性化のms精度差として定義される摂動 前後 の ステップ時間を選択してプロットします(図4B)。
      注: 摂動前と摂動後のステップ時間解析は、各タイプのセッション内のデータを比較するために実行する必要があります。このパラメータは、連想学習中に障害を予測して克服するマウスの能力を測定します。
3. 専用の統計ソフトウェア(SigmaPlotなど)でデータを解析します。セッション間で同じ試行タイプから収集されたデータの検出力非線形回帰分析を実行して、学習プロセスをより効率的に記述し、二元配置反復測定(RM)分散分析を使用して試行タイプ間を比較します。

結果

エラスムス・ラダーのデバイス、セットアップ、および適用されたプロトコルを 図1に示します。プロトコルは、4 つの邪魔されないセッションと 4 つのチャレンジ セッション (それぞれ 42 の試行) で構成されています。各トライアルは、開始ゴールボックスと終了ゴールボックスの間のはしごを1回実行します。セッションの開始時に、開始ボックスの 1 つにマウスが?...

ディスカッション

エラスムスラダーは、現在のアプローチを超える運動表現型評価に大きな利点をもたらします。試験は実施が容易で、自動化され、再現性があり、研究者は単一のマウスコホートを使用して運動行動のさまざまな側面を個別に評価できます。本研究では、再現性により、デバイスの特性、実験計画、および解析方法を利用して、少数のWTマウスでロバストなデータを生成することができまし?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder device	Noldus, Wageningen, Netherlands
Erasmus Ladder 2.0 software	Noldus, Wageningen, Netherlands
Excel software	Microsoft
Sigmaplot software	Systat Software, Inc.