Monitoraggio dell'apprendimento motorio fine e associativo nei topi utilizzando la scala Erasmus

Riepilogo

Questo articolo presenta un protocollo che consente una valutazione non invasiva e automatizzata delle prestazioni motorie, nonché l'apprendimento motorio adattivo e associativo su sfide, utilizzando un dispositivo chiamato Erasmus Ladder. La difficoltà del compito può essere titolata per rilevare una compromissione motoria che va da gradi maggiori a lievi.

Abstract

Il comportamento è modellato dalle azioni e le azioni richiedono abilità motorie come la forza, la coordinazione e l'apprendimento. Nessuno dei comportamenti essenziali per sostenere la vita sarebbe possibile senza la capacità di passare da una posizione all'altra. Sfortunatamente, le capacità motorie possono essere compromesse in una vasta gamma di malattie. Pertanto, lo studio dei meccanismi delle funzioni motorie a livello cellulare, molecolare e circuitale, nonché la comprensione dei sintomi, delle cause e della progressione dei disturbi motori, è fondamentale per lo sviluppo di trattamenti efficaci. I modelli murini sono spesso impiegati per questo scopo.

Questo articolo descrive un protocollo che consente il monitoraggio di vari aspetti delle prestazioni motorie e dell'apprendimento nei topi utilizzando uno strumento automatizzato chiamato Erasmus Ladder. Il test prevede due fasi: una fase iniziale in cui i topi vengono addestrati a navigare su una scala orizzontale costruita con pioli irregolari ("apprendimento motorio fine") e una seconda fase in cui viene presentato un ostacolo nel percorso dell'animale in movimento. La perturbazione può essere inaspettata ("apprendimento motorio sfidato") o preceduta da un tono uditivo ("apprendimento motorio associativo"). L'attività è facile da svolgere ed è completamente supportata da un software automatizzato.

Questo rapporto mostra come le diverse letture del test, se analizzate con metodi statistici sensibili, consentono un monitoraggio fine delle capacità motorie del topo utilizzando una piccola coorte di topi. Proponiamo che il metodo sia altamente sensibile per valutare gli adattamenti motori guidati da modifiche ambientali e i sottili deficit motori in fase iniziale in topi mutanti con funzioni motorie compromesse.

Introduzione

Sono stati sviluppati diversi test per valutare i fenotipi motori nei topi. Ogni test fornisce informazioni su un aspetto specifico del comportamento motorio¹. Ad esempio, il test in campo aperto informa sulla locomozione generale e sullo stato d'ansia; i test di rotarod e walking beam sulla coordinazione e sull'equilibrio; L'analisi dell'impronta riguarda l'andatura; il tapis roulant o la ruota da corsa durante l'esercizio fisico forzato o volontario; E la ruota complessa riguarda l'apprendimento delle abilità motorie. Per analizzare i fenotipi motori del topo, i ricercatori devono eseguire questi test in sequenza, il che comporta molto tempo e sforzi e spesso diverse coorti di animali. Se ci sono informazioni a livello cellulare o circuitale, lo sperimentatore normalmente opta per un test che monitora un aspetto correlato e segue da lì. Tuttavia, mancano paradigmi che discriminino in modo automatizzato i diversi aspetti del comportamento motorio.

Questo articolo descrive un protocollo per utilizzare l'Erasmus Ladder ^2,3, un sistema che consente una valutazione completa di una varietà di caratteristiche di apprendimento motorio nei topi. I principali vantaggi sono la riproducibilità e la sensibilità del metodo, insieme alla capacità di titolare la difficoltà motoria e di separare i deficit nelle prestazioni motorie dalla compromissione dell'apprendimento motorio associativo. Il componente principale è costituito da una scala orizzontale con pioli alti (H) e bassi (L) alternati dotati di sensori sensibili al tocco che rilevano la posizione del mouse sulla scala. La scala è composta da 2 x 37 pioli (L, 6 mm; H, 12 mm) distanziati di 15 mm l'uno dall'altro e posizionati in uno schema alternato sinistra-destra con spazi di 30 mm (Figura 1A). I pioli possono essere spostati singolarmente per generare vari livelli di difficoltà, ovvero creare un ostacolo (alzando i pioli alti di 18 mm). Accoppiato con un sistema di registrazione automatizzato e associando le modifiche del modello di pioli con stimoli sensoriali, la scala Erasmus verifica l'apprendimento della motricità fine e l'adattamento delle prestazioni motorie in risposta a sfide ambientali (comparsa di un gradino più alto per simulare un ostacolo, uno stimolo incondizionato [US]) o l'associazione con stimoli sensoriali (un tono, uno stimolo condizionato [CS]). Il test prevede due fasi distinte, ciascuna delle quali valuta il miglioramento delle prestazioni motorie nell'arco di 4 giorni, durante le quali i topi vengono sottoposti a una sessione di 42 prove consecutive al giorno. Nella fase iniziale, i topi vengono addestrati a navigare nella scala per valutare l'apprendimento motorio "fine" o "abile". La seconda fase consiste in prove interlacciate in cui un ostacolo sotto forma di un piolo superiore viene presentato sul percorso dell'animale in movimento. La perturbazione può essere inaspettata per valutare l'apprendimento motorio "sfidato" (studi solo negli Stati Uniti) o annunciata da un tono uditivo per valutare l'apprendimento motorio "associativo" (studi appaiati).

La scala Erasmus è stata sviluppata in tempi relativamente recenti ^2,3. Non è stato ampiamente utilizzato perché l'impostazione e l'ottimizzazione del protocollo richiedeva uno sforzo mirato ed è stato specificamente progettato per valutare l'apprendimento associativo cerebellare-dipendente senza esplorare in dettaglio il suo potenziale di rivelare altri deficit motori. Ad oggi, è stato convalidato per la sua capacità di svelare sottili disturbi motori legati alla disfunzione cerebellare nei topi 3,4,5,6,7,8. Ad esempio, i topi knockout per la connessina36 (Cx36), in cui le giunzioni gap sono compromesse nei neuroni olivari, mostrano deficit di attivazione a causa della mancanza di accoppiamento elettrotonico, ma il fenotipo motorio era difficile da individuare. I test effettuati utilizzando la scala Erasmus hanno suggerito che il ruolo dei neuroni olivari inferiori in un compito di apprendimento motorio cerebellare è quello di codificare con precisione la codifica temporale degli stimoli e facilitare le risposte dipendenti dall'apprendimento a eventi inaspettati ^3,4. Il topo knockout per la ribonucleoproteina 1 messaggera X fragile (Fmr1), un modello per la sindrome dell'X fragile (FXS), mostra un deterioramento cognitivo ben noto insieme a difetti più lievi nella formazione della memoria procedurale. I knockout Fmr1 non hanno mostrato differenze significative nei tempi di passo, nei passi falsi per prova o nel miglioramento delle prestazioni motorie durante le sessioni nella scala Erasmus, ma non sono riusciti ad adattare il loro modello di deambulazione all'ostacolo che appare improvvisamente rispetto ai loro compagni di cucciolata wild-type (WT), confermando specifici deficit di memoria procedurale e associativa ^3,5. Inoltre, linee mutanti di topo cellulo-specifiche con difetti nella funzione cerebellare, tra cui la compromissione della produzione di cellule di Purkinje, il potenziamento e l'uscita di cellule interneuronali o granulari dello strato molecolare, hanno mostrato problemi nella coordinazione motoria con acquisizione alterata di schemi di passi efficienti e nel numero di passi compiuti per attraversare la scala⁶. Le lesioni cerebrali neonatali causano deficit di apprendimento cerebellare e disfunzione delle cellule di Purkinje che potrebbero essere rilevate anche con la scala Erasmus ^7,8.

In questo video, presentiamo una guida completa passo passo, che descrive in dettaglio la configurazione della stanza comportamentale, il protocollo di test comportamentale e la successiva analisi dei dati. Questo rapporto è stato creato per essere accessibile e facile da usare ed è progettato specificamente per aiutare i nuovi arrivati. Questo protocollo fornisce informazioni sulle diverse fasi dell'allenamento motorio e sui modelli motori attesi che i topi adottano. Infine, l'articolo propone un flusso di lavoro sistematico per l'analisi dei dati utilizzando un potente approccio di regressione non lineare, completo di preziose raccomandazioni e suggerimenti per adattare e applicare il protocollo in altri contesti di ricerca.

Protocollo

Nel presente studio sono stati utilizzati topi adulti (2-3 mesi) C57BL/6J di entrambi i sessi. Gli animali sono stati alloggiati da due a cinque per gabbia con accesso ad libitum a cibo e acqua in un'unità animale sotto osservazione e mantenuti in un ambiente a temperatura controllata con un ciclo di 12 ore buio/luce. Tutte le procedure sono state condotte in conformità con le normative europee e spagnole (2010/63/UE; RD 53/2013) e sono stati approvati dal Comitato Etico della Generalitat Valenciana e dal Comitato per il Benessere degli Animali dell'Universidad Miguel Hernández.

1. Allestimento comportamentale della stanza

1. Prenotate la sala per i test comportamentali ogni giorno alla stessa ora e stabilite l'elenco e l'ordine dei topi da utilizzare, nonché le disposizioni per il loro hosting.
2. Tenere i topi sperimentali fuori dalla sala di prova in modo che non sentano i suoni del compressore d'aria e i toni della scala Erasmus quando non vengono testati.
3. Verificare che tutti i componenti del sistema Erasmus Ladder siano in ordine e pronti all'uso: il router di rete, il computer con il software (vedi Tabella dei materiali), il compressore d'aria, due porte e la scala con i pioli correttamente posizionati.
4. Pulisci accuratamente le scatole delle porte, la scala e i pioli con acqua dopo ogni animale e con acqua ed etanolo al 70% alla fine di ogni giornata di allenamento.

2. Protocollo di test comportamentale

1. Creare un esperimento e inserire il protocollo nel software (Figura supplementare S1).
   1. Accendi il software.
   2. Per creare un esperimento, scegli File | Nuovo esperimento | Nuovo o configurato | Protocollo dell'esperimento.
      NOTA: Il protocollo predefinito, utilizzato in questo studio, è denominato EMC ed è stato progettato presso l'Erasmus University Medical Center di Rotterdam.
   3. Assegna un nome all'esperimento e fai clic su OK.
   4. Verificare che il protocollo EMC predefinito selezionato consista in 4 giorni di sessioni indisturbate (42 prove indisturbate al giorno) e 4 giorni di sessioni di verifica (42 prove miste giornaliere: indisturbato, solo CS (tono), solo US (ostacolo), Accoppiato (ostacolo annunciato dal tono) (vedere la Figura 1B). Nel pannello laterale destro, controlla anche il segnale luminoso (durata massima di 3 s), il segnale aereo (durata massima di 45 s) e il vento in coda (Sì in tutti i tipi di prova), utilizzati per incoraggiare il mouse ad attraversare la scala, e il tono (250 ms, Sì solo nelle prove solo CS e in coppia).
   5. Per creare un protocollo diverso, scegliere Configura | Protocollo dell'esperimento | Nuovo | Da zero o Copia dal protocollo EMC e modificalo semplicemente, modificando le righe della tabella relative al numero di sessioni (giorni di esperimento) e al numero e tipo di prove al giorno.
      NOTA: Anche il tempo di riposo, il tipo e l'attivazione dei segnali, la durata, l'intensità e l'intervallo possono essere adattati in base alle domande sperimentali.
   6. Per aprire l'elenco delle sessioni e assegnare un nome agli argomenti, scegliere Imposta | Elenco sessioni.
   7. Fare clic su Aggiungi soggetti e variabili.
   8. Immettere ogni specifico identificatore di topo, data di nascita, sesso, genotipo e categorie pertinenti, seguendo l'elenco ordinato dei topi.
2. Avviare la sessione (Figura supplementare S2).
   1. Prima di iniziare, verificare che il software sia aperto, quindi accendere la scala.
   2. Verificare che il compressore d'aria sia collegato e acceso.
   3. Per aprire la finestra Acquisizione, apri l'esperimento creato.
   4. Scegli Acquisizione | Aprire Acquisizione.
   5. Posiziona il mouse con l'identificatore indicato dal software nella casella dell'obiettivo di partenza (lato destro della scala).
   6. Selezionare l'identificatore del mouse da acquisire nella prima sessione.
   7. Fare clic su Avvia acquisizione.
   8. Premere 3 volte la manopola rossa del menu della scaletta . Verificare che la sessione si avvii e controlli e registri automaticamente i movimenti del mouse fino alla fine dell'ultima prova della sessione.
3. Termina la sessione.
   1. Verificare che al termine della 42^° prova, il display visualizzi i messaggi Invio Dati e Acquisiti.
   2. Riporta il mouse nella gabbia di casa.
   3. Pulisci la scala e le scatole delle porte.
   4. Posizionare il mouse successivo e ripetere dal passaggio 2.2.6 in poi.
4. Eseguire il tipo di sessione selezionato ogni giorno fino alla fine del protocollo. Ripetere i passaggi 2.2 e 2.3 ogni giorno in base al protocollo selezionato.
5. Esportare i dati (Figura supplementare S2).
   1. Per visualizzare i dati registrati, scegliere dal menu Analisi , Statistiche di prova, Statistiche di sessione e Statistiche e grafici di gruppo.
      NOTA: I dati possono essere scaricati come foglio di calcolo con i dati per le singole prove e le medie degli stessi tipi di prova all'interno di una sessione. Le sessioni possono anche essere filtrate in base a variabili scelte per analisi specifiche.
   2. Fai clic sul pulsante Esporta nell'angolo in alto a destra scegliendo il formato del file (foglio di calcolo) e la posizione della cartella.
   3. Fare clic con il pulsante destro del mouse sui grafici generati automaticamente e selezionare Salva su file come *.jpg.

3. Analisi dei dati

NOTA: Un elenco di parametri viene misurato automaticamente dall'Erasmus Ladder in base alla registrazione istantanea delle attività dei sensori sensibili al tocco. Per l'analisi, i parametri di output selezionati dall'utente vengono organizzati ed elaborati nei fogli di calcolo. Insieme ai grafici generati dal software, gli utenti possono generare grafici utilizzando il software di grafica preferito per visualizzare cambiamenti specifici in diversi parametri nel corso delle sessioni.

1. Scegli parametri specifici per analizzare la motivazione basale o gli stati d'ansia, le risposte sensoriali, le prestazioni motorie e l'apprendimento motorio fine nei primi 4 giorni.
   1. Selezionare e tracciare i parametri di controllo, tra cui il tempo di riposo nella casella dell'obiettivo e il tempo di uscita dall'area dell'obiettivo dopo il periodo di riposo in risposta ai segnali luminosi e aerei (Figura 2A).
      NOTA: I tempi di riposo o la risposta ai segnali sono relativamente costanti nei topi WT. Altri parametri, come la frequenza delle uscite, sono fondamentalmente trascurabili nei topi WT: gli animali raramente lasciano la scatola di riposo senza i segnali o tornano una volta nella scala, con conseguenti frequenze di uscita pari a 1 per prova. Se un animale esce prima che vengano applicati i segnali, si attiva un flusso d'aria che costringe il mouse a tornare alla casella della porta; Questa non viene conteggiata come una versione di prova dal software.
   2. Selezionare e tracciare il tempo sulla scala dopo i segnali, misurato come il tempo trascorso ad attraversare la scala una volta che il mouse ha lasciato la casella dell'obiettivo (Figura 2B).
      NOTA: una regressione non lineare di potenza è un metodo affidabile per valutare l'apprendimento. I coefficienti di Pearson o Spearman (R) forniranno una misura del fatto che l'adattamento dei dati sia buono (valori R vicini a uno quando gli animali imparano/migliorano nel corso delle sessioni; Valori R vicini a 0 implicano che i dati sono costanti e i topi non imparano).
   3. Selezionare e tracciare i parametri del modello di passo, ad esempio la percentuale di prove con passi falsi, come parametro di apprendimento sensibile (Figura 2C).
      1. Definire un passo corretto come un passo da un gradino alto a un altro gradino alto (H-H), indipendentemente dalla lunghezza del passo. Considera i tipi di passo che coinvolgono un gradino inferiore come passi falsi.
      2. Suddividere i passi corretti e i passi falsi in passi brevi e lunghi, passi all'indietro e salti a seconda della lunghezza e della direzionalità del passo tra i pioli premuti (vedere la Figura 1A).
2. Selezionare e tracciare parametri specifici per valutare l'apprendimento motorio sfidato (studi solo negli Stati Uniti) e l'apprendimento associativo (studi a coppia) negli ultimi 4 giorni.
   1. Selezionare e tracciare il tempo sulla ladder dopo i segnali (Figura 3).
   2. Selezionare e tracciare la percentuale di prove con passi falsi (Figura 4A).
   3. Selezionare e tracciare i tempi di passo pre e post perturbazione, definiti come una differenza di precisione in ms tra l'attivazione del piolo appena prima (passo di controllo) e dopo l'ostacolo (passo adattato) sullo stesso lato della scala (Figura 4B).
      NOTA: L'analisi dei tempi di passo pre e post-perturbazione deve essere eseguita per confrontare i dati all'interno di ciascun tipo di sessione. Il parametro misura la capacità dei topi di prevedere e superare gli ostacoli durante l'apprendimento associativo.
3. Analizza i dati con software statistici dedicati (es. SigmaPlot). Esegui un'analisi di regressione non lineare dei dati raccolti dallo stesso tipo di studio in tutte le sessioni per descrivere il processo di apprendimento in modo più efficiente e utilizza l'ANOVA a misure ripetute a due vie (RM) per confrontare i tipi di studio.

Risultati

Il dispositivo, la configurazione e il protocollo Erasmus Ladder applicati sono presentati nella Figura 1. Il protocollo consiste in quattro sessioni indisturbate e quattro sessioni di sfida (42 prove ciascuna). Ogni prova è una corsa sulla scala tra le caselle di partenza e di arrivo. All'inizio della sessione, un mouse viene posizionato in una delle caselle di partenza. Dopo un tempo impostato di 15 ± 5 s (stato di "riposo"), la luce si accende (cue 1, per un massimo di 3 s). Viene quind...

Discussione

La scala Erasmus presenta importanti vantaggi per la valutazione del fenotipo motorio rispetto agli approcci attuali. Il test è facile da condurre, automatizzato, riproducibile e consente ai ricercatori di valutare separatamente vari aspetti del comportamento motorio utilizzando una singola coorte di topi. Nel presente studio, la riproducibilità ha permesso la generazione di dati robusti con un piccolo numero di topi WT sfruttando le caratteristiche del dispositivo, il disegno sperimentale e i metodi di analisi. Ad ese...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder device	Noldus, Wageningen, Netherlands
Erasmus Ladder 2.0 software	Noldus, Wageningen, Netherlands
Excel software	Microsoft
Sigmaplot software	Systat Software, Inc.