Monitorização da aprendizagem motora fina e associativa em ratinhos utilizando a escada Erasmus

Resumo

Este artigo apresenta um protocolo que permite uma avaliação não invasiva e automatizada do desempenho motor fino, bem como da aprendizagem motora adaptativa e associativa frente a desafios, utilizando um aparelho denominado Escada Erasmus. A dificuldade da tarefa pode ser titulada para detectar comprometimento motor que varia de graus maiores a sutis.

Resumo

O comportamento é moldado por ações, e as ações requerem habilidades motoras, como força, coordenação e aprendizagem. Nenhum dos comportamentos essenciais para sustentar a vida seria possível sem a capacidade de transição de uma posição para outra. Infelizmente, as habilidades motoras podem ser comprometidas em uma ampla gama de doenças. Portanto, investigar os mecanismos das funções motoras nos níveis celular, molecular e circuital, bem como compreender os sintomas, as causas e a progressão dos distúrbios motores, é crucial para o desenvolvimento de tratamentos eficazes. Modelos de camundongos são frequentemente empregados para esse fim.

Este artigo descreve um protocolo que permite o monitoramento de vários aspectos do desempenho motor e aprendizagem em camundongos usando uma ferramenta automatizada chamada Erasmus Ladder. O ensaio envolve duas fases: uma fase inicial onde os ratos são treinados para navegar em uma escada horizontal construída de degraus irregulares ("aprendizagem motora fina"), e uma segunda fase onde um obstáculo é apresentado no caminho do animal em movimento. A perturbação pode ser inesperada ("aprendizagem motora desafiada") ou precedida por um tom auditivo ("aprendizagem motora associativa"). A tarefa é fácil de realizar e é totalmente suportada por software automatizado.

Este relatório mostra como leituras diferentes do teste, quando analisadas com métodos estatísticos sensíveis, permitem o monitoramento fino das habilidades motoras de camundongos usando uma pequena coorte de camundongos. Propomos que o método será altamente sensível para avaliar adaptações motoras impulsionadas por modificações ambientais, bem como déficits motores sutis em estágio inicial em camundongos mutantes com funções motoras comprometidas.

Introdução

Uma variedade de testes tem sido desenvolvida para avaliar fenótipos motores em camundongos. Cada teste fornece informações sobre um aspecto específico do comportamento motor¹. Por exemplo, o teste de campo aberto informa sobre locomoção geral e estado de ansiedade; os testes de rotarod e walking beam sobre coordenação e equilíbrio; a análise das pegadas das pegadas diz respeito à marcha; esteira ou roda de corrida em exercício físico forçado ou voluntário; e a roda complexa é sobre aprendizagem de habilidades motoras. Para analisar os fenótipos motores de camundongos, os pesquisadores devem realizar esses testes sequencialmente, o que envolve muito tempo e esforço e, muitas vezes, várias coortes de animais. Se houver informação a nível celular ou de circuito, o investigador normalmente opta por um teste que monitora um aspecto relacionado e segue a partir daí. No entanto, faltam paradigmas que discriminem diferentes aspectos do comportamento motor de forma automatizada.

Este artigo descreve um protocolo para o uso da Escada Erasmus ^2,3, um sistema que permite uma avaliação abrangente de uma variedade de características de aprendizagem motora em camundongos. As principais vantagens são a reprodutibilidade e a sensibilidade do método, juntamente com a capacidade de titular a dificuldade motora e separar déficits no desempenho motor de aprendizagem motora associativa prejudicada. O componente principal consiste em uma escada horizontal com degraus alternados altos (H) e baixos (L) equipados com sensores sensíveis ao toque que detectam a posição do mouse na escada. A escada é feita de 2 x 37 degraus (L, 6 mm; H, 12 mm) espaçados 15 mm entre si e posicionados em um padrão alternado esquerda-direita com intervalos de 30 mm (Figura 1A). Os degraus podem ser movidos individualmente para gerar vários níveis de dificuldade, ou seja, criar um obstáculo (elevar os degraus altos em 18 mm). Juntamente com um sistema de registro automatizado e associando modificações do padrão do degrau com estímulos sensoriais, a escada Erasmus testa a aprendizagem motora fina e a adaptação do desempenho motor em resposta a desafios ambientais (aparecimento de um degrau mais alto para simular um obstáculo, um estímulo incondicionado [US]) ou associação com estímulos sensoriais (um tom, um estímulo condicionado [CS]). Os testes envolvem duas fases distintas, cada uma avaliando a melhora no desempenho motor ao longo de 4 dias, durante os quais os camundongos passam por uma sessão de 42 testes consecutivos por dia. Na fase inicial, os ratos são treinados para navegar na escada para avaliar o aprendizado motor "fino" ou "habilidoso". A segunda fase consiste em ensaios intercalados onde um obstáculo na forma de um degrau mais alto é apresentado no caminho do animal em movimento. A perturbação pode ser inesperada para avaliar a aprendizagem motora "desafiada" (ensaios somente nos EUA) ou anunciada por um tom auditivo para avaliar a aprendizagem motora "associativa" (ensaios pareados).

A escada Erasmus foi desenvolvida há relativamente pouco tempo ^2,3. Não tem sido extensivamente utilizado porque a configuração e otimização do protocolo requer esforço concentrado e foi projetado especificamente para avaliar a aprendizagem associativa dependente de cerebelo, sem explorar em detalhes seu potencial para revelar outros déficits motores. Até o momento, foi validado por sua capacidade de desvendar sutis comprometimentos motores ligados à disfunção cerebelar em camundongos3,4,5,6,7,8. Por exemplo, camundongos knockout de conexina36 (Cx36), onde as junções comunicantes estão prejudicadas em neurônios olivares, exibem déficits de disparo devido à falta de acoplamento eletrotônico, mas o fenótipo motor tem sido difícil de identificar. Testes com a escada de Erasmus sugeriram que o papel dos neurônios olivares inferiores em uma tarefa de aprendizagem motora cerebelar é codificar a codificação temporal precisa dos estímulos e facilitar respostas dependentes da aprendizagem a eventos inesperados ^3,4. O camundongo knockout Ribonucleoprotein 1 (Fmr1) do Fragile X Messenger Ribonucleoprotein 1, um modelo para a Síndrome do X Frágil (SXF), exibe um comprometimento cognitivo bem conhecido, juntamente com defeitos mais leves na formação da memória de procedimento. Os nocautes Fmr1 não mostraram diferenças significativas nos tempos de passo, erros por tentativa ou melhora do desempenho motor ao longo das sessões na Escada Erasmus, mas falharam em ajustar seu padrão de caminhada ao obstáculo que aparece repentinamente em comparação com seus companheiros de ninhada do tipo selvagem (WT), confirmando déficits específicos de memória de procedimento e associativa ^3,5. Além disso, linhagens mutantes de camundongos específicas para células com defeitos na função cerebelar, incluindo produção de células de Purkinje prejudicada, potencialização e saída de interneurônios ou células de grânulos da camada molecular, exibiram problemas na coordenação motora com aquisição alterada de padrões eficientes de degraus e no número de passos dados para cruzar a escada⁶. A lesão cerebral neonatal causa déficits de aprendizado cerebelar e disfunção das células de Purkinje, que também podem ser detectados com a Escada de Erasmus ^7,8.

Neste vídeo, apresentamos um guia passo a passo abrangente, que detalha a configuração da sala comportamental, o protocolo de teste comportamental e a análise de dados subsequente. Este relatório foi concebido para ser acessível e de fácil utilização e foi concebido especificamente para ajudar os recém-chegados. Este protocolo fornece informações sobre as diferentes fases do treinamento motor e os padrões motores esperados que os camundongos adotam. Finalmente, o artigo propõe um fluxo de trabalho sistemático para a análise dos dados usando uma poderosa abordagem de regressão não-linear, completa com recomendações e sugestões valiosas para adaptar e aplicar o protocolo em outros contextos de pesquisa.

Protocolo

No presente estudo, camundongos adultos (2-3 meses de idade) C57BL/6J de ambos os sexos foram utilizados. Os animais foram alojados de dois a cinco por gaiola com acesso ad libitum a ração e água em uma unidade animal sob observação e mantidos em ambiente com temperatura controlada em um ciclo escuro/claro de 12 h. Todos os procedimentos foram conduzidos de acordo com as regulamentações europeias e espanholas (2010/63/UE; RD 53/2013) e foram aprovados pelo Comitê de Ética da Generalitat Valenciana e pelo comitê de bem-estar animal da Universidade Miguel Hernández.

1. Configuração comportamental da sala

1. Reserve a sala de testes comportamentais todos os dias no mesmo horário e estabeleça a lista e a ordem dos camundongos a serem usados, bem como os arranjos para sua hospedagem.
2. Mantenha os ratos experimentais fora da sala de testes para que não ouçam os sons do compressor de ar e dos tons Erasmus Ladder quando não estiverem sendo testados.
3. Verifique se todos os componentes do sistema Erasmus Ladder estão em ordem e prontos para uso: o roteador de rede, o computador com o software (consulte a Tabela de Materiais), o compressor de ar, duas caixas de meta e a escada com os degraus devidamente posicionados.
4. Limpe extensivamente as caixas de meta, escada e degraus com água após cada animal e com água e etanol 70% no final de cada dia de treinamento.

2. Protocolo do teste comportamental

1. Crie um experimento e insira o protocolo no software (Figura Suplementar S1).
   1. Ligue o software.
   2. Para criar um experimento, escolha Arquivo | Novo experimento | Novo ou configurado | Protocolo experimental.
      NOTA: O protocolo padrão, usado neste estudo, é denominado EMC e foi projetado no Erasmus University Medical Center, Rotterdam.
   3. Dê um nome ao experimento e clique em OK.
   4. Verifique se o protocolo padrão da EMC selecionado consiste em 4 dias de sessões não perturbadas (42 tentativas não perturbadas por dia) e 4 dias de sessões de desafio (42 tentativas mistas diárias: sem perturbação, somente CS (tom), somente nos EUA (obstáculo), emparelhado (obstáculo anunciado pelo tom) (consulte a Figura 1B). No painel do lado direito, verifique também a pista de luz (duração máxima de 3 s), a pista de ar (duração máxima de 45 s) e o vento de cauda (Sim em todos os tipos de teste), usados para incentivar o mouse a cruzar a escada, e o tom (250 ms, Sim apenas em testes somente CS e emparelhados).
   5. Para criar um protocolo diferente, escolha Configurar | Protocolo de experimentação | Novo | Do zero ou Copiar do protocolo EMC e simplesmente modificá-lo, editando as linhas da tabela relacionadas ao número de sessões (dias de experimento) e número e tipo de testes por dia.
      OBS: O tempo de repouso, o tipo e a ativação das pistas, a duração, a intensidade e o intervalo também podem ser adaptados de acordo com as questões experimentais.
   6. Para abrir a lista de sessões e nomear os assuntos, escolha Configuração | Lista de sessões.
   7. Clique em Adicionar assuntos e variáveis.
   8. Insira cada Identificador de Mouse, Data de Nascimento, Sexo, Genótipo e categorias relevantes, seguindo a lista ordenada de camundongos.
2. Inicie a sessão (Figura Suplementar S2).
   1. Antes de começar, verifique se o software está aberto e, em seguida, ligue a Escada.
   2. Verifique se o compressor de ar está conectado e ligado.
   3. Para abrir a janela Aquisição, abra o Experimento criado.
   4. Escolha a Aquisição | Aquisição aberta.
   5. Coloque o mouse com o identificador indicado pelo software na caixa do gol inicial (lado direito da escada).
   6. Selecione o identificador do mouse a ser adquirido na primeira sessão.
   7. Clique em Iniciar Aquisição.
   8. Pressione o botão vermelho do menu da escada 3x. Verifique se a sessão é iniciada e controla e grava automaticamente os movimentos do mouse até o final da última tentativa da sessão.
3. Encerre a sessão.
   1. Verifique se ao final da^42ª tentativa, a tela mostra as mensagens Envio de Dados e Adquirido.
   2. Volte o mouse para a gaiola inicial.
   3. Limpe a escada e as caixas de gol.
   4. Coloque o próximo mouse e repita a partir da etapa 2.2.6.
4. Realizar o tipo de sessão selecionado todos os dias até o final do protocolo. Repetir os passos 2.2 e 2.3 todos os dias de acordo com o protocolo selecionado.
5. Exporte os dados (Figura Suplementar S2).
   1. Para visualizar os dados gravados, escolha no menu Análise , Estatísticas de avaliação, Estatísticas de sessão e Gráficos de & de estatísticas de grupo.
      NOTA: Os dados podem ser baixados como uma planilha com dados para testes individuais e os meios dos mesmos tipos de avaliação dentro de uma sessão. As sessões também podem ser filtradas por variáveis escolhidas para análise específica.
   2. Clique no botão Exportar no canto superior direito escolhendo o formato do arquivo (planilha) e o local da pasta.
   3. Clique com o botão direito do mouse nos gráficos gerados automaticamente e selecione Salvar em arquivo como *.jpg.

3. Análise dos dados

NOTA: Uma lista de parâmetros é medida automaticamente pela Escada Erasmus com base no registo instantâneo das atividades dos sensores sensíveis ao toque. Para análise, os parâmetros de saída selecionados pelo usuário são organizados e processados nas planilhas. Juntamente com os gráficos gerados pelo software, os usuários podem gerar gráficos usando o software gráfico de escolha para visualizar mudanças específicas em diferentes parâmetros ao longo das sessões.

1. Escolha parâmetros específicos para analisar a motivação basal ou estados de ansiedade, respostas sensoriais, desempenho motor e aprendizagem motora fina nos primeiros 4 dias.
   1. Selecione e plote os parâmetros de controle, incluindo o tempo de repouso na caixa de meta e o tempo para sair da caixa de meta após o período de descanso em resposta a sinais de luz e ar (Figura 2A).
      NOTA: Os tempos de repouso ou a resposta a pistas são relativamente constantes em ratos WT. Outros parâmetros, como a frequência de saídas, são basicamente desprezíveis em camundongos WT - os animais raramente saem da caixa de descanso sem as pistas ou voltam uma vez na escada, resultando em frequências de saída iguais a 1 por tentativa. Se um animal sai antes que as pistas sejam aplicadas, um fluxo de ar é ativado forçando o mouse a retornar à caixa de meta; Isso não é contado como uma avaliação pelo software.
   2. Selecione e plote o tempo na escada após as pistas, medido como o tempo gasto cruzando a escada quando o mouse sai da caixa de meta (Figura 2B).
      NOTA: Uma regressão não-linear de potência é um método robusto para avaliar a aprendizagem. Os coeficientes de Pearson ou Spearman (R) fornecerão uma medida de se o ajuste dos dados é bom (valores de R próximos a um quando os animais aprendem/melhoram ao longo das sessões; Valores de R próximos a 0 implicam que os dados são constantes e os ratos não aprendem).
   3. Selecione e plote parâmetros de padrão de passo , como a porcentagem de tentativas com passos errados como um parâmetro de aprendizado sensível (Figura 2C).
      1. Defina um passo correto como um passo de um degrau alto para outro degrau alto (H-H), independentemente do comprimento do degrau. Considere os tipos de etapas que envolvem um degrau inferior como passos em falso.
      2. Divida os passos corretos e os passos errados em passos curtos e longos, passos para trás e saltos, dependendo do comprimento e direcionalidade do passo entre os degraus pressionados (consulte a Figura 1A).
2. Selecione e plote parâmetros específicos para avaliar a aprendizagem motora desafiada (ensaios somente nos EUA) e a aprendizagem associativa (ensaios pareados) nos últimos 4 dias.
   1. Selecione e plote o tempo na escada após as pistas (Figura 3).
   2. Selecione e plote a porcentagem de tentativas com passos em falso (Figura 4A).
   3. Selecionar e plotar os tempos dos degraus pré e pós-perturbação, definidos como uma diferença de precisão ms entre a ativação do degrau imediatamente antes (degrau controle) e após o obstáculo (degrau adaptado) no mesmo lado da escada (Figura 4B).
      NOTA: A análise dos tempos de passo pré vs pós-perturbação deve ser realizada para comparar os dados dentro de cada tipo de sessão. O parâmetro mede a capacidade dos camundongos de prever e superar os obstáculos durante a aprendizagem associativa.
3. Analise os dados com um software estatístico dedicado (por exemplo, SigmaPlot). Realize uma análise de regressão não-linear de poder dos dados coletados do mesmo tipo de ensaio ao longo das sessões para descrever o processo de aprendizagem de forma mais eficiente e use ANOVA de Medidas Repetidas de Duas Vias (RM) para comparar entre os tipos de estudo.

Resultados

O dispositivo, a configuração e o protocolo Erasmus Ladder aplicados são apresentados na Figura 1. O protocolo consiste em quatro sessões inalteradas e quatro de desafio (42 tentativas cada). Cada tentativa é uma corrida na escada entre as caixas de meta inicial e final. No início da sessão, um mouse é colocado em uma das caixas iniciais. Após um tempo definido de 15 ± 5 s (estado de "repouso"), a luz é acesa (pista 1, para um máximo de 3 s). Uma pista de ar leve (pista 2, 45 s n...

Discussão

A Escada Erasmus apresenta grandes vantagens para a avaliação do fenótipo motor para além das abordagens atuais. O teste é fácil de conduzir, automatizado, reprodutível e permite que os pesquisadores avaliem vários aspectos do comportamento motor separadamente usando uma única coorte de camundongos. No presente estudo, a reprodutibilidade permitiu a geração de dados robustos com um pequeno número de camundongos WT aproveitando as características do dispositivo, o planejamento experimental e os métodos de an...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder device	Noldus, Wageningen, Netherlands
Erasmus Ladder 2.0 software	Noldus, Wageningen, Netherlands
Excel software	Microsoft
Sigmaplot software	Systat Software, Inc.