Überwachung des feinmotorischen und assoziativen Lernens bei Mäusen mit Hilfe der Erasmus-Leiter

Zusammenfassung

In diesem Artikel wird ein Protokoll vorgestellt, das eine nicht-invasive und automatisierte Bewertung der feinmotorischen Leistung sowie adaptives und assoziatives motorisches Lernen bei Herausforderungen unter Verwendung eines Geräts namens Erasmus-Leiter ermöglicht. Der Schwierigkeitsgrad der Aufgabe kann titriert werden, um motorische Beeinträchtigungen zu erkennen, die von schweren bis hin zu subtilen Graden reichen.

Zusammenfassung

Verhalten wird durch Handlungen geprägt, und Handlungen erfordern motorische Fähigkeiten wie Kraft, Koordination und Lernen. Keines der Verhaltensweisen, die für die Erhaltung des Lebens unerlässlich sind, wäre ohne die Fähigkeit, von einer Position in eine andere zu wechseln, möglich. Leider können die motorischen Fähigkeiten bei einer Vielzahl von Krankheiten beeinträchtigt sein. Daher ist die Untersuchung der Mechanismen motorischer Funktionen auf zellulärer, molekularer und Schaltkreisebene sowie das Verständnis der Symptome, Ursachen und des Fortschreitens motorischer Störungen entscheidend für die Entwicklung wirksamer Behandlungen. Zu diesem Zweck werden häufig Mausmodelle eingesetzt.

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll, das die Überwachung verschiedener Aspekte der motorischen Leistung und des Lernens bei Mäusen mit einem automatisierten Tool namens Erasmus Ladder ermöglicht. Der Test umfasst zwei Phasen: eine erste Phase, in der die Mäuse darauf trainiert werden, eine horizontale Leiter aus unregelmäßigen Sprossen zu navigieren ("feinmotorisches Lernen"), und eine zweite Phase, in der ein Hindernis auf dem Weg des sich bewegenden Tieres dargestellt wird. Die Störung kann unerwartet sein ("herausgefordertes motorisches Lernen") oder von einem auditiven Ton vorausgehend ("assoziatives motorisches Lernen"). Die Aufgabe ist einfach durchzuführen und wird vollständig von automatisierter Software unterstützt.

Dieser Bericht zeigt, wie verschiedene Messwerte des Tests, wenn sie mit empfindlichen statistischen Methoden analysiert werden, eine feine Überwachung der motorischen Fähigkeiten von Mäusen anhand einer kleinen Kohorte von Mäusen ermöglichen. Wir schlagen vor, dass die Methode sehr empfindlich sein wird, um motorische Anpassungen, die durch Umweltmodifikationen verursacht werden, sowie subtile motorische Defizite im Frühstadium in mutierten Mäusen mit beeinträchtigten motorischen Funktionen zu bewerten.

Einleitung

Es wurde eine Vielzahl von Tests entwickelt, um motorische Phänotypen bei Mäusen zu beurteilen. Jeder Test gibt Aufschluss über einen bestimmten Aspekt des motorischen Verhaltens¹. Zum Beispiel gibt der Freifeldtest Aufschluss über den allgemeinen Bewegungs- und Angstzustand; die Rotarod- und Hubbalkentests auf Koordination und Gleichgewicht; Bei der Fußabdruckanalyse geht es um den Gang; das Laufband oder das Laufrad bei erzwungener oder freiwilliger körperlicher Betätigung; Und beim komplexen Rad geht es um das Erlernen motorischer Fähigkeiten. Um motorische Phänotypen von Mäusen zu analysieren, müssen die Forscher diese Tests nacheinander durchführen, was viel Zeit und Mühe und oft mehrere Tierkohorten erfordert. Wenn Informationen auf zellulärer oder Schaltkreisebene vorhanden sind, entscheidet sich der Untersucher normalerweise für einen Test, der einen verwandten Aspekt überwacht und von dort aus folgt. Es fehlen jedoch Paradigmen, die verschiedene Aspekte des motorischen Verhaltens automatisiert unterscheiden.

Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll zur Verwendung der Erasmus Ladder ^2,3, einem System, das eine umfassende Bewertung einer Vielzahl von motorischen Lernmerkmalen bei Mäusen ermöglicht. Die Hauptvorteile sind die Reproduzierbarkeit und Sensitivität der Methode sowie die Fähigkeit, motorische Schwierigkeiten zu titrieren und Defizite in der motorischen Leistungsfähigkeit von beeinträchtigtem assoziativem motorischem Lernen zu trennen. Die Hauptkomponente besteht aus einer horizontalen Leiter mit abwechselnd hohen (H) und niedrigen (L) Sprossen, die mit berührungsempfindlichen Sensoren ausgestattet sind, die die Position der Maus auf der Leiter erkennen. Die Leiter besteht aus 2 x 37 Sprossen (L, 6 mm; H, 12 mm) im Abstand von 15 mm zueinander angeordnet und in einem Links-Rechts-Wechselmuster mit 30 mm Lücken angeordnet (Abbildung 1A). Sprossen können einzeln verschoben werden, um verschiedene Schwierigkeitsgrade zu erzeugen, d.h. ein Hindernis zu schaffen (Anhebung der hohen Sprossen um 18 mm). In Verbindung mit einem automatisierten Aufzeichnungssystem und der Verknüpfung von Modifikationen des Sprossenmusters mit sensorischen Reizen testet die Erasmus-Leiter das feinmotorische Lernen und die Anpassung der motorischen Leistung als Reaktion auf Umweltherausforderungen (Auftreten einer höheren Sprosse, um ein Hindernis zu simulieren, ein unkonditionierter Reiz [US]) oder die Assoziation mit sensorischen Reizen (ein Ton, ein konditionierter Reiz [CS]). Die Tests umfassen zwei verschiedene Phasen, in denen jeweils die Verbesserung der motorischen Leistung über 4 Tage bewertet wird, in denen die Mäuse eine Sitzung von 42 aufeinanderfolgenden Versuchen pro Tag durchlaufen. In der Anfangsphase werden die Mäuse darauf trainiert, auf der Leiter zu navigieren, um das "feine" oder "geschickte" motorische Lernen zu beurteilen. Die zweite Phase besteht aus verschachtelten Versuchen, bei denen ein Hindernis in Form einer höheren Sprosse auf dem Weg des sich bewegenden Tieres dargestellt wird. Die Störung kann unerwartet sein, um das "herausgeforderte" motorische Lernen zu beurteilen (nur in den USA) oder durch einen auditiven Ton angekündigt werden, um das "assoziative" motorische Lernen zu beurteilen (gepaarte Studien).

Die Erasmus-Leiter wurde erst vor relativ kurzer Zeit entwickelt ^2,3. Es wurde bisher nicht ausgiebig eingesetzt, da die Einrichtung und Optimierung des Protokolls konzentrierte Anstrengungen erforderte und speziell entwickelt wurde, um kleinhirnabhängiges assoziatives Lernen zu bewerten, ohne sein Potenzial, andere motorische Defizite aufzudecken, im Detail zu untersuchen. Bisher wurde es für seine Fähigkeit validiert, subtile motorische Beeinträchtigungen im Zusammenhang mit zerebellärer Dysfunktion bei Mäusen aufzudecken 3,4,5,6,7,8. Zum Beispiel zeigen Connexin36 (Cx36) Knockout-Mäuse, bei denen die Gap Junctions in den Olivary-Neuronen beeinträchtigt sind, Feuerdefizite aufgrund fehlender elektrotonischer Kopplung, aber der motorische Phänotyp war schwer zu lokalisieren. Tests mit der Erasmus-Leiter deuteten darauf hin, dass die Rolle der inferioren olivarischen Neuronen bei einer motorischen Lernaufgabe des Kleinhirns darin besteht, präzise zeitliche Kodierung von Reizen zu kodieren und lernabhängige Reaktionen auf unerwartete Ereignisse zu erleichtern ^3,4. Die Fragile X Messenger Ribonukleoprotein 1 (Fmr1) Knockout-Maus, ein Modell für das Fragile-X-Syndrom (FXS), weist eine bekannte kognitive Beeinträchtigung zusammen mit leichteren Defekten in der prozeduralen Gedächtnisbildung auf. Fmr1-Knockouts zeigten keine signifikanten Unterschiede in Schrittzeiten, Fehltritten pro Versuch oder motorischer Leistungsverbesserung im Vergleich zu Sitzungen in der Erasmus-Leiter, konnten aber ihr Laufmuster im Vergleich zu ihren Wildtyp-Wurfgeschwistern (WT) nicht an das plötzlich auftretende Hindernis anpassen, was spezifische prozedurale und assoziative Gedächtnisdefizite bestätigte ^3,5. Darüber hinaus zeigten zellspezifische Maus-Mutantenlinien mit Defekten in der Kleinhirnfunktion, einschließlich beeinträchtigter Purkinje-Zellleistung, Potenzierung und Molekularschicht-Interneuron- oder Körnerzellausgänge, Probleme in der motorischen Koordination mit verändertem Erwerb effizienter Schrittmuster und in der Anzahl der Schritte, die zum Überqueren der Leiter erforderlich sind⁶. Eine neonatale Hirnverletzung verursacht kleinhirnartige Lerndefizite und Purkinje-Zell-Dysfunktion, die auch mit der Erasmus-Leiter ^7,8 nachgewiesen werden konnten.

In diesem Video präsentieren wir eine umfassende Schritt-für-Schritt-Anleitung, die die Einrichtung des Verhaltensraums, das Verhaltenstestprotokoll und die anschließende Datenanalyse detailliert beschreibt. Dieser Bericht ist so gestaltet, dass er zugänglich und benutzerfreundlich ist und speziell für Neueinsteiger entwickelt wurde. Dieses Protokoll bietet Einblicke in die verschiedenen Phasen des motorischen Trainings und die erwarteten motorischen Muster, die Mäuse annehmen. Schließlich schlägt der Artikel einen systematischen Workflow für die Datenanalyse unter Verwendung eines leistungsstarken nichtlinearen Regressionsansatzes vor, komplett mit wertvollen Empfehlungen und Vorschlägen für die Anpassung und Anwendung des Protokolls in anderen Forschungskontexten.

Protokoll

In der aktuellen Studie wurden adulte (2-3 Monate alte) C57BL/6J-Mäuse beiderlei Geschlechts verwendet. Die Tiere wurden zu zweit bis fünf pro Käfig mit ad libitum Zugang zu Futter und Wasser in einer beobachteten Tiereinheit untergebracht und in einer temperaturkontrollierten Umgebung über einen 12-stündigen Dunkel-Hell-Zyklus gehalten. Alle Verfahren wurden in Übereinstimmung mit den europäischen und spanischen Vorschriften (2010/63/EU; RD 53/2013) und wurden von der Ethikkommission der Generalitat Valenciana und der Tierschutzkommission der Universidad Miguel Hernández genehmigt.

1. Einrichtung des Verhaltensraums

1. Reservieren Sie den Verhaltenstestraum jeden Tag zur gleichen Zeit und legen Sie die Liste und Reihenfolge der zu verwendenden Mäuse sowie die Vorkehrungen für deren Unterbringung fest.
2. Bewahren Sie die Versuchsmäuse außerhalb des Testraums auf, damit sie die Geräusche des Luftkompressors und der Erasmus-Leitertöne nicht hören, wenn sie nicht getestet werden.
3. Vergewissern Sie sich, dass alle Komponenten des Erasmus-Leitersystems in Ordnung und einsatzbereit sind: der Netzwerkrouter, der Computer mit der Software (siehe Materialtabelle), der Luftkompressor, zwei Torkästen und die Leiter mit den richtig positionierten Sprossen.
4. Reinigen Sie die Torboxen, die Leiter und die Sprossen nach jedem Tier ausgiebig mit Wasser und am Ende jedes Trainingstages mit Wasser und 70 % Ethanol.

2. Protokoll für Verhaltenstests

1. Erstellen Sie ein Experiment und geben Sie das Protokoll in die Software ein (Ergänzende Abbildung S1).
   1. Schalten Sie die Software ein.
   2. Um ein Experiment zu erstellen, wählen Sie Datei | Neues Experiment | Neu oder Einrichten | Protokoll des Experiments.
      HINWEIS: Das Standardprotokoll, das in dieser Studie verwendet wird, heißt EMC und wurde am Erasmus University Medical Center in Rotterdam entwickelt.
   3. Geben Sie dem Experiment einen Namen, und klicken Sie auf OK.
   4. Vergewissern Sie sich, dass das ausgewählte EMC-Standardprotokoll aus 4 Tagen ungestörten Sitzungen (42 ungestörte Versuche pro Tag) und 4 Tagen Challenge-Sitzungen (42 gemischte Versuche pro Tag: ungestört, nur CS (Ton), nur USA (Hindernis), Paarung (Hindernis durch Ton) besteht (siehe Abbildung 1B). Überprüfen Sie in der rechten Seitenleiste auch den Lichthinweis (maximale Dauer von 3 Sekunden), den Lufthinweis (maximale Dauer von 45 Sekunden) und den Rückenwind (Ja in allen Testtypen), der verwendet wird, um die Maus zum Überqueren der Leiter zu bewegen, sowie den Ton (250 ms, Ja nur in reinen CS- und Paar-Tests).
   5. Um ein anderes Protokoll zu erstellen, wählen Sie Einrichten | Versuchsprotokoll | Neu | Von Grund auf neu oder kopieren Sie das EMC-Protokoll und ändern Sie es einfach, indem Sie die Tabellenzeilen bearbeiten, die sich auf die Anzahl der Sitzungen (Versuchstage) und die Anzahl und Art der Versuche pro Tag beziehen.
      HINWEIS: Ruhezeit, Art und Aktivierung der Hinweise, Dauer, Intensität und Intervall können ebenfalls an die experimentellen Fragen angepasst werden.
   6. Um die Sitzungsliste zu öffnen und die Themen zu benennen, wählen Sie Einstellungen | Sitzungsliste.
   7. Klicken Sie auf Subjekte und Variablen hinzufügen.
   8. Geben Sie jede spezifische Mauskennung, das Geburtsdatum, das Geschlecht, den Genotyp und die relevanten Kategorien ein, indem Sie der geordneten Liste der Mäuse folgen.
2. Starten Sie die Sitzung (Ergänzende Abbildung S2).
   1. Bevor Sie beginnen, überprüfen Sie, ob die Software geöffnet ist, und schalten Sie dann die Leiter ein.
   2. Prüfen Sie, ob der Luftkompressor angeschlossen und eingeschaltet ist.
   3. Um das Fenster "Erfassung" zu öffnen, öffnen Sie das erstellte Experiment.
   4. Wählen Sie Akquisition | Öffnen Sie die Akquise.
   5. Platzieren Sie die Maus mit der von der Software angegebenen Kennung in der Startzielbox (rechte Seite der Leiter).
   6. Wählen Sie die Maus-ID aus, die in der ersten Sitzung abgerufen werden soll.
   7. Klicken Sie auf Akquise starten.
   8. Drücken Sie den roten Menüknopf der Leiter 3x. Vergewissern Sie sich, dass die Sitzung gestartet wird und die Mausbewegungen bis zum Ende des letzten Versuchs der Sitzung automatisch gesteuert und aufgezeichnet werden.
3. Beenden Sie die Sitzung.
   1. Vergewissern Sie sich, dass am Ende des 42^. Versuchs auf dem Display die Meldungen "Daten werden gesendet" und "Erworben" angezeigt werden.
   2. Setze die Maus wieder in den Ausgangskäfig ein.
   3. Reinigen Sie die Leiter und die Torkästen.
   4. Platzieren Sie die nächste Maus und wiederholen Sie den Vorgang ab Schritt 2.2.6.
4. Führen Sie den ausgewählten Sitzungstyp jeden Tag bis zum Ende des Protokolls durch. Wiederholen Sie die Schritte 2.2 und 2.3 jeden Tag gemäß dem ausgewählten Protokoll.
5. Exportieren Sie die Daten (Ergänzende Abbildung S2).
   1. Um die aufgezeichneten Daten zu visualisieren, wählen Sie aus dem Menü "Analyse ", "Teststatistiken", "Sitzungsstatistiken" und "Gruppenstatistiken und Diagramme".
      HINWEIS: Die Daten können als Tabelle mit Daten für einzelne Studien und den Mittelwerten der gleichen Studientypen innerhalb einer Sitzung heruntergeladen werden. Sitzungen können auch nach Variablen gefiltert werden, die für eine bestimmte Analyse ausgewählt wurden.
   2. Klicken Sie auf die Schaltfläche Exportieren in der oberen rechten Ecke und wählen Sie das Dateiformat (Tabelle) und den Speicherort des Ordners aus.
   3. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die automatisch generierten Diagramme und wählen Sie In Datei speichern unter *.jpg.

3. Datenanalyse

HINWEIS: Eine Liste von Parametern wird automatisch von der Erasmus-Leiter gemessen, basierend auf der sofortigen Aufzeichnung der Aktivitäten der berührungsempfindlichen Sensoren. Für die Analyse werden die vom Benutzer ausgewählten Ausgabeparameter in den Tabellenkalkulationen organisiert und verarbeitet. Zusammen mit den softwaregenerierten Diagrammen können Benutzer mit der Grafiksoftware ihrer Wahl Diagramme erstellen, um bestimmte Änderungen verschiedener Parameter während der Sitzungen zu visualisieren.

1. Wählen Sie spezifische Parameter aus, um die basale Motivation oder Angstzustände, sensorische Reaktionen, die motorische Leistung und das feinmotorische Lernen in den ersten 4 Tagen zu analysieren.
   1. Auswählen und Darstellen von Steuerungsparametern, einschließlich der Ruhezeit im Torraum und der Zeit bis zum Verlassen des Torraums nach der Ruhezeit als Reaktion auf Licht- und Luftsignale (Abbildung 2A).
      HINWEIS: Die Ruhezeiten oder die Reaktion auf Signale sind bei WT-Mäusen relativ konstant. Andere Parameter wie die Häufigkeit der Ausgänge sind bei WT-Mäusen im Grunde vernachlässigbar - die Tiere verlassen die Ruhebox selten ohne die Hinweise oder kommen einmal in der Leiter zurück, was zu einer Häufigkeit des Ausstiegs von 1 pro Versuch führt. Wenn ein Tier das Feld verlässt, bevor die Signale gegeben werden, wird ein Luftstrom aktiviert, der die Maus zwingt, zum Torkasten zurückzukehren. Dies wird von der Software nicht als Testversion gewertet.
   2. Wählen Sie die Zeit auf der Leiter nach den Hinweisen aus und tragen Sie sie auf, gemessen als die Zeit, die mit dem Überqueren der Leiter verbracht wird, sobald die Maus das Torfeld verlässt (Abbildung 2B).
      HINWEIS: Eine nichtlineare Power-Regression ist eine robuste Methode zur Bewertung des Lernens. Die Pearson- oder Spearman-Koeffizienten (R) liefern ein Maß dafür, ob die Datenanpassung gut ist (R-Werte nahe eins, wenn die Tiere im Laufe der Sitzungen lernen/sich verbessern; R-Werte nahe 0 bedeuten, dass die Daten konstant sind und Mäuse nicht lernen).
   3. Auswählen und Darstellen von Schrittmusterparametern , wie z. B. dem Prozentsatz der Versuche mit Fehltritten als sensitiver Lernparameter (Abbildung 2C).
      1. Definieren Sie einen korrekten Schritt als einen Schritt von einer hohen Sprosse zu einer anderen hohen Sprosse (H-H), unabhängig von der Länge des Schritts. Betrachten Sie Schritttypen, die eine niedrigere Sprosse beinhalten, als Fehltritte.
      2. Unterteilen Sie korrekte Schritte und Fehltritte in kurze und lange Schritte, Rückwärtsschritte und Sprünge, abhängig von der Länge und Richtung des Schrittes zwischen den gedrückten Sprossen (siehe Abbildung 1A).
2. Wählen Sie spezifische Parameter aus und stellen Sie sie dar, um das motorische Lernen mit Herausforderungen (nur in den USA) und das assoziative Lernen (gepaarte Studien) in den letzten 4 Tagen zu bewerten.
   1. Wählen Sie die Zeit auf der Leiter nach Cues aus und stellen Sie sie dar (Abbildung 3).
   2. Wählen Sie den Prozentsatz der Versuche mit Fehltritten aus und stellen Sie ihn dar (Abbildung 4A).
   3. Wählen Sie die Schrittzeiten vor und nach der Störung aus und tragen Sie sie auf, definiert als ms-Präzisionsdifferenz zwischen der Sprossenaktivierung kurz vor (Kontrollschritt) und nach dem Hindernis (angepasste Stufe) auf derselben Seite der Leiter (Abbildung 4B).
      HINWEIS: Es sollte eine Analyse der Schrittzeiten vor und nach der Störung durchgeführt werden, um die Daten innerhalb der einzelnen Sitzungstypen zu vergleichen. Der Parameter misst die Fähigkeit der Mäuse, die Hindernisse beim assoziativen Lernen vorherzusagen und zu überwinden.
3. Analysieren Sie die Daten mit einer speziellen Statistiksoftware (z. B. SigmaPlot). Führen Sie eine leistungsstarke, nichtlineare Regressionsanalyse von Daten durch, die aus demselben Studientyp über Sitzungen hinweg gesammelt wurden, um den Lernprozess effizienter zu beschreiben, und verwenden Sie die Zwei-Wege-ANOVA mit wiederholten Messungen (RM), um zwischen den Studientypen zu vergleichen.

Ergebnisse

Das Erasmus Ladder-Gerät, die Einrichtung und das angewandte Protokoll sind in Abbildung 1 dargestellt. Das Protokoll besteht aus vier ungestörten und vier Challenge-Sitzungen (jeweils 42 Versuche). Jeder Versuch ist ein Lauf auf der Leiter zwischen den Start- und Endzielboxen. Zu Beginn der Sitzung wird eine Maus in eine der Startboxen gelegt. Nach einer eingestellten Zeit von 15 ± 5 s ("Ruhezustand") wird das Licht eingeschaltet (Cue 1, für maximal 3 s). Anschließend wird ein Lichtsig...

Diskussion

Die Erasmus-Leiter bietet große Vorteile für die motorische Phänotyp-Bewertung, die über die derzeitigen Ansätze hinausgehen. Die Tests sind einfach durchzuführen, automatisiert, reproduzierbar und ermöglichen es den Forschern, verschiedene Aspekte des motorischen Verhaltens anhand einer einzigen Mauskohorte separat zu bewerten. In der aktuellen Studie ermöglichte die Reproduzierbarkeit die Generierung robuster Daten mit einer kleinen Anzahl von WT-Mäusen, die die Funktionen des Geräts, das experimentelle Desig...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
C57BL/6J mice (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder device	Noldus, Wageningen, Netherlands
Erasmus Ladder 2.0 software	Noldus, Wageningen, Netherlands
Excel software	Microsoft
Sigmaplot software	Systat Software, Inc.