ナノ・マイクロメートル小胞における非平衡代謝ネットワークの構築

要約

膜タンパク質を再構成し、酵素やその他の水溶性成分をサブマイクロメートルおよびマイクロメートルサイズの脂質小胞にカプセル化するためのプロトコルを提示します。

要約

精製されたコンポーネントを使用して、内在性膜タンパク質、酵素、および蛍光ベースのセンサーを含む複雑なタンパク質ネットワークを小胞に組み込む方法を紹介します。この方法は、バイオリアクターの設計と構築、および複雑な非平衡代謝反応ネットワークの研究に関連しています。まず、以前に開発されたプロトコルに従って、(複数の)膜タンパク質を大きな単層小胞(LUV)に再溶解します。次に、精製された酵素、代謝物、および蛍光ベースのセンサー(蛍光タンパク質または色素)の混合物を凍結融解押出しでカプセル化し、遠心分離および/またはサイズ排除クロマトグラフィーによって非組み込み成分を除去します。代謝ネットワークのパフォーマンスは、ATP/ADP比、代謝物濃度、内部pH、または蛍光読み出しによるその他のパラメータを監視することにより、リアルタイムで測定されます。直径100-400 nmの膜タンパク質含有小胞は、既存の最適化された手順を使用して、巨大単層小胞(GUV)に変換できます。このアプローチにより、可溶性成分(酵素、代謝物、センサー)をマイクロメートルサイズの小胞に含めることができるため、バイオリアクターの容量を桁違いに拡大できます。GUVを含む代謝ネットワークは、光学顕微鏡による分析のためにマイクロ流体デバイスに閉じ込められます。

概要

ボトムアップ合成生物学の分野は、^{バイオテクノロジー3,4}または生物医学目的^5,6,7,8のための(最小限の)細胞^1,2および代謝バイオリアクターの構築に焦点を当てています。合成細胞の構築は、研究者が天然環境のものを模倣した明確に定義された条件でタンパク質を研究(膜)することを可能にする独自のプラットフォームを提供し、タンパク質と反応ネットワークの創発的特性と隠された生化学的機能の発見を可能にします⁹。自律的に機能する合成細胞への中間ステップとして、代謝エネルギー保存、タンパク質および脂質合成、恒常性など、生細胞の本質的な特徴を捉えるモジュールが開発されています。このようなモジュールは、生命に対する理解を高めるだけでなく、医学⁸や^{バイオテクノロジー10}の分野にも応用できる可能性がある。

プロトコル

1. 一般的な準備

1. 化学薬品
   1. 脂質(粉末状)をCHCl₃ に25 mg / mLに溶解して、予め形成されたリポソームを作製します。
      注:新鮮な脂質ストックを調製することが望ましいですが、ストック溶液は-20°Cで数週間保存することもできます。粉末状の脂質を扱うことは、CHCl₃ですでに可溶化された脂質を使用するよりも正確です。CHCl₃ はプラスチック_{を溶解するため} 、CHCl 3はガラスピペットおよび/またはシリンジを使用して取り扱い、ガラス容器に保管する必要があります。
   2. カプセル化手順のために低分子(ヌクレオチド、アミノ酸、蛍光プローブ)を50 mM KPi(バッファーA、 表1を参照)に溶解し、pHを7.00±0.01に調整します。リン酸マグネシウム沈殿物の形成を避けるために、MgCl₂ を脱イオン水に溶解します。
      注:ストック溶液は、実験日に新たに調製されるDTTを除き、-20°Cで数週間保存できます。
   3. イオノフォア(例えば、バリノマイシン、ニゲリシン)をDMSOまたはEtOHのいずれかに100〜500μMのストック濃度で溶解し、-20°Cで数週間保存します。蒸発を避けてください。
      注:DMSOは揮発性ではないため、EtOHよりも好まれます。プラスチック....

ディスカッション

サブマイクロメートルサイズの脂質小胞を含む(膜)タンパク質(proteoLUV)の合成、およびproteoLUVの巨大単層小胞(proteoGUV)への変換のためのプロトコルを紹介します。このプロトコルは、他の膜タンパク質13,19,30,40の再構成、およびここに提示されているL-アルギニン分解およびグリセロール3-リン酸合成経路以外の代謝ネットワークのカプセル化に適用できるはずです。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma Aldrich	A9414-25g
Amicon cut-off filter	Sigma Aldrich	Milipore centrifugal filter units Amicon Ultra
BioBeads	BioRad	152-3920
CHCl3	Macron Fine Chemicals	MFCD00000826
D(+)-Glucose	Formedium	-
D(+)-Sucrose	Formedium	-
DDM	Glycon	D97002 -C
Diethyl Ether	Biosolve	52805
DMSO	Sigma-Aldrich	276855-100ml
DOPC	Avanti	850375P-1g
DOPE	Avanti	850725P-1g
DOPG	Avanti	840475P-1g
DTT	Formedium	DTT005
EtOH	J.T.Baker Avantor	MFCD00003568
Extruder	Avestin Inc	LF-1
Fluorimeter	Jasco	Spectrofluorometer FP-8300
Glycerol	BOOM	51171608
Gravity flow column	Bio-Rad	732-1010
Hamilton syringe 100 µL	Hamilton	7656-01
Hamilton syringe 1000 µL	Hamilton	81320
Handheld LCP dispenser	Art Robbins Instruments	620-411-00
Handheld Sonicator	Hielscher Ultrasound Technology	UP50H
HCl	BOOM	x76021889.1000
Imidazole	Roth	X998.4-250g
K2HPO4	Supelco	1.05099.1000
KCl	BOOM	76028270.1
KH2PO4	Supelco	1.04873.1000
Kimwipe	Kimtech Science	7552
Large Falcon tube centrifuge	Eppendorf	Centrifuge 5810 R
L-Arginine	Sigma-Aldrich	A5006-100G
Light microscope	Leica	DM LS2
L-Ornithine	Roth	T204.1
LSM Laser Scanning Confocal Microscope	Zeiss	LSM 710 ConfoCor 3
MgCl2	Sigma-Aldrich	M2670-1KG
Microfluidic chip	Homemade	PDMS based	DOI: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J
Na-ADP	Sigma-Aldrich	A2754-1G
NaCl	Supelco	1.06404.1000
Nanodrop Spectrometer	Isogen Life Science	ND-1000 spectrophotometer NanoDrop
NaOH	Supelco	1.06498.1000
Needles for GUVs	Henke-Ject	14-14575	27 G x 3/4'' 0.4 x 20 mm
Needles for microfluidics	Henke-Ject	14-15538	18 G x 1 1/2'' 1.2 x 40 mm
Ni2+ Sepharose	Cytiva	17526802
Nigericin	Sigma-Aldrich	N7143-5MG
Nutator	VWR	83007-210
Osmolality meter	Gonotec Salmenkipp	Osmomat 3000 basic freezing point osmometer
Plasmacleaner	Plasma Etch	PE-Avenger
Polycarbonate filter	Cytiva Whatman	Nuclepor Track-Etch Membrane Product: 10417104	0.4 µm
Polycarbonate ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	355647
Pyranine	Acros Organics	H1529-1G
Quartz cuvette (black)	Hellma Analytics	108B-10-40
Sephadex G-75 resin	GE Healthcare	17-0050-01
Sonicator	Sonics Sonics & Materials INC	Sonics vibra cell
Syringe filter	Sarstedt	Filtropur S plus 0.2	0.2 µm
Syringe pump	Harvard Apparatus	A-42467
Tabletop centrifuge	Eppendorf	centrifuge 5418
Teflon spacer	Homemade	Teflon based	45 x 26 x 1.5 or 45 x 26 x 3 or 20 x 20 x 3 mm
Tris	PanReac AppliChem	A1086.1000
Triton X-100	Sigma Aldrich	T8787-100 ml
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima Max-E
UV lamp	Spectroline	ENB-280C/FE
UV/VIS Spectrometer	Jasco	V730 spectrophotometer
Valinomycin	Sigma-Aldrich	V0627-10MG
Widefield fluorescence microscope	Zeiss	AxioObserver
β-Casein	Sigma Aldrich	C5890-500g